一种GSH/pH双响应型Cu2O@Cu

一种gsh/ph双响应型cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物
技术领域
1.本发明属于金属有机框架材料作为药物运输载体技术领域，具体涉及一种gsh/ph双响应型cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.ros作为一种氧代谢副产物，具有细胞信号传导和维持细胞氧化平衡等作用。目前，调节ros水平以诱导细胞死亡已被证明是一种有效的癌症治疗方法，许多基于ros的癌症治疗方法被广泛研究。
3.光动力疗法（pdt）是一种临床认可的微创ros治疗方法，其通过使用特定波长的光照射光敏剂（ps）生成ros，从而对恶性细胞产生选择性细胞毒性。作为pdt的关键组分，常用的ps通常具有疏水性、易聚集等特点，例如酞菁（pc）是一类有高单线态氧生产率的具有平面结构的稠环化合物，在生理环境中易发生聚集导致荧光淬灭（acq），不利于ros 的产生。若能降低这类光敏剂的聚集，则可以提升光动力治疗的效率。金属有机框架（mofs） 是一类具有多孔结构的纳米材料，其具有较高的比表面积、可调节的孔径大小，以及优异的生物相容性，且mofs中的孔隙或缺陷可以用来“固定”pss来防止其聚集，故使用mofs来作为此类pss的载体可以有效降低其聚集，提高pdt的效果。
4.肿瘤微环境(tme)具有缺氧、ph值偏酸性、谷胱甘肽(gsh)过表达、h2o2水平较高等特点。较低的内源性o2含量限制了光敏剂在肿瘤细胞中的光动力治疗作用，且gsh作为细胞内的自由基清除剂，会进一步的消耗pdt产生的1o2降低光动力活性，故单一的pdt治疗难以达到满意的治疗效果。化学动力学疗法（cdt）是一种利用芬顿或类芬顿反应将癌细胞内过量的过氧化氢（h2o2）转化为高细胞毒性的羟基自由基（
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oh）来杀死癌细胞的方法。更重要的是，随着
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oh的产生，一些芬顿或类芬顿反应可以诱导o2生成，以缓解tme缺氧，进一步提高pdt的治疗作用，实现cdt及pdt的联合协同治疗。
5.传统芬顿金属fe
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需要在ph约2-4的条件下才能完全发挥其芬顿活性，相比之下，cu
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有着更宽的ph应用范围和更高的类芬顿催化活性，催化反应速率比前者高约160倍。但是cu
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的临床毒性限制了其在肿瘤治疗中的应用。cu2o作为一种cu
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离子源，具有较高的临床毒性。若能在cu
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源表面形成一层tme响应型外壳以防止cu
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提前泄露，有助于其在选择性富集肿瘤部位、改善临床毒性的同时，充分发挥类芬顿催化活性。一些功能性mofs不仅能够通过其多孔结构装载药物，还能在tme中特异性降解，故将功能型mofs作为包覆外壳不仅可以保护内核使其不被免疫系统攻击，还可以作为稳定的受控释放框架，将内容物准确地在肿瘤位置释放。但目前基于tme响应型mofs外壳的研究仍主要集中在zif-8、mil-100（fe）等易于改性修饰的结构上，对于其他更多功能型mofs研究开发十分有限。由于核与壳两种材料之间较大的界面能垒，在cu2o核表面合成mofs壳结构时mofs更易在溶液中单独成相或内核零散沉积在mofs表面，同时存在cu
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/药物提前泄露、壳核分布不均匀、重复性及稳定性及差等问题。因此，开发具有均匀核壳结构、tme响应型的功能mofs复合材料仍然具有挑战性。
6.zif-67是由co
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与2-甲基咪唑形成的mofs，有着较好的容纳客体药物分子能力与生物相容性，并且可以在酸性的肿瘤微环境中降解以释放其内容物。高价芬顿金属离子（如fe
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、cu
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、mn
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）可以消耗gsh并被还原至低价态，并通过进一步与h2o2反应生产
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oh进行cdt治疗。同时，抗氧化剂gsh的消耗有利于增强肿瘤细胞内ros水平，从而协同提高pdt治疗效果。因此，在cu2o表面包裹掺杂高价芬顿离子的zif-67结构，构建具有gsh/ph双响应型的纳米载体具有重要的现实意义。
7.cu2o作为一种cu
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离子源，鲜有将其与mofs结合进行cdt/pdt协同治疗的报导。若使用zif-67将其包裹形成核壳药物载体，将可以改善其临床毒性，同时提高光敏剂装载效率。更为重要的是，本发明中基于cu2o自模板合成的cu
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掺杂的核壳mofs结构，在保护芬顿剂cu2o并高效装载光敏剂药物的同时，兼具gsh/ph响应能力，且能够通过消耗抗氧化剂gsh提高肿瘤细胞内ros水平, 最终释放内容物进行高效cdt/pdt协同治疗。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种gsh/ph双响应型cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物及其制备方法和应用。在tme中gsh/ph响应释放类芬顿剂与光敏剂的同时减少tme中的抗氧化物gsh，以达到高效cdt/pdt协同治疗。
9.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于cu2o自模板法合成的cu2o@cu
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/zif-67@znpc的核壳结构纳米药物，其合成方法包括以下步骤：（1）取一定量二水合氯化铜，聚乙烯吡咯烷酮k30放入烧瓶中，加入50ml去离子水，在室温下搅拌15min至溶液澄清，在溶液中加入5ml氢氧化钠水溶液，室温搅拌5min，随后加入5ml抗坏血酸水溶液，室温搅拌15min，得到cu2o，离心并用水和甲醇洗涤几次后分散于15ml甲醇中。
10.（2）将步骤（1）溶液与十二烷基磺酸钠混合超声30min后离心，分散于37ml甲醇中，加入12ml六水合硝酸钴甲醇溶液混合室温搅拌10min，随后加入12ml 2-甲基咪唑甲醇溶液室温搅拌1h，离心并用甲醇洗涤后置于真空干燥箱中干燥得到cu2o@cu
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/zif-67纳米材料；（3）取部分步骤（2）产物cu2o@cu
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/zif-67溶于5ml甲醇中，取四羧基酞菁锌溶于2ml n，n-二甲基甲酰胺中，将两种溶液混合在室温下搅拌，离心并用n，n-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤后置于真空干燥箱中干燥；（4）将步骤（3）产物溶于10ml去离子水中与聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物混合，室温搅拌12h,离心并置于真空干燥箱中干燥得到所属核壳结构纳米药物。
11.优选地，步骤（1）中加入的聚乙烯吡咯烷酮k30为溶液质量的1.7%~2.3%，二水合氯化铜：氢氧化钠：抗坏血酸的摩尔比为2:10:5。步骤（2）中加入十二烷基磺酸钠后其质量浓度为0.1mg/ml，六水合硝酸钴：2-甲基咪唑的摩尔比为3:25。步骤（3）中cu2o@cu
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/zif-67的质量浓度为2~2.5mg/ml，对应于四羧基酞菁锌质量浓度为2~2.5mg/ml。步骤（4）中加入的聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物后其质量浓度为1.8~2.5mg/ml。
12.如上所述的方法制得的gsh/ph双响应型cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物在制备光动力治疗纳米药物中的应用。
13.本发明利用在特定情况下cu2o会游离出cu
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并被氧化为cu
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，以cu2o纳米球为模板，
甲基咪唑甲醇溶液(0.017g/ml)室温搅拌1h，10000rpm离心5min并用甲醇洗涤两次后置于真空干燥箱中干燥得到cu2o@cu
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/zif-67纳米材料；（3）取10mg cu2o@cu
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/zif-67溶于5ml甲醇中，取4mg四羧基酞菁锌溶于2ml n，n-二甲基甲酰胺中，将两种溶液混合在室温下搅拌，10000rpm离心5min并用n，n-二甲基甲酰胺洗涤一次，甲醇洗涤两次后置于真空干燥箱中干燥；（4）将步骤（3）产物溶于去10ml离子水中与20mg聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物混合，室温搅拌12h, 10000rpm离心5min并置于真空干燥箱中干燥得到所属核壳结构纳米药物。
26.实施例二（1）取0.17g二水合氯化铜，0.9g聚乙烯吡咯烷酮k30放入烧瓶中，加入去50ml离子水，在室温下搅拌15min至溶液澄清，在溶液中加入5ml浓度为2m的氢氧化钠水溶液，室温搅拌5min，随后加入5ml浓度为1m的抗坏血酸水溶液，室温搅拌15min，得到cu2o，13000rpm离心5min并用水和甲醇洗涤两次后分散于15ml甲醇中；（2）将步骤（1）溶液与0.15g十二烷基磺酸钠混合超声30min后离心，分散于37ml甲醇中，加入12ml六水合硝酸钴甲醇溶液（0.008g/ml）混合室温搅拌10min，随后加入12ml 2-甲基咪唑甲醇溶液(0.017g/ml)室温搅拌1h，10000rpm离心5min并用甲醇洗涤两次后置于真空干燥箱中干燥得到cu2o@cu
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/zif-67纳米材料；（3）取12mg cu2o@cu
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/zif-67溶于5ml甲醇中，取5mg四羧基酞菁锌溶于2ml n，n-二甲基甲酰胺中，将两种溶液混合在室温下搅拌，10000rpm离心5min并用n，n-二甲基甲酰胺洗涤一次，甲醇洗涤两次后置于真空干燥箱中干燥；（4）将步骤（3）产物溶于去10ml离子水中与23mg聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物混合，室温搅拌12h, 10000rpm离心5min并置于真空干燥箱中干燥得到所属核壳结构纳米药物。
27.图1为实施例一中cu2o@cu
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/zif-67核壳结构纳米材料的xrd图，从图1可见，所合成的核壳结构纳米材料的衍射峰与cu2o和zif-67的峰对应。
28.图2为实施例一中cu2o@cu
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/zif-67核壳结构纳米材料的sem图与tem图，若反应中未加入十二烷基磺酸钠则成两相。可能是由于未使用十二烷基磺酸钠改变cu2o电位时，加入的co
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离子更倾向于均匀分散在溶液中，导致后续的2-甲基咪唑配体与其在溶液中单独成相。这说明了该合成方法的必要性。
29.图3为实施例一中cu2o@cu
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/zif-67核壳结构纳米材料的gsh消耗能力测试，使用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（dtnb） 来检测 mof 对 gsh 的消耗能力。dtnb 可以与 gsh 上的反应，生成5-巯基-2-硝基苯甲酸（tnb），tnb在412 nm 处有最大吸收。因此我们可以通过测定反应溶液中与 412 nm 处吸收的下降值来判断gsh 被消耗的程度。图中可以看到随着材料浓度的增加，412nm处吸光度逐渐降低，这证明了cu
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的掺杂可以有效消耗gsh。
30.图4为实施例一中cu2o@cu
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/zif-67核壳结构纳米材料(a)在h2o2存在下的
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oh生成能力，(b)在h2o2存在下的o2生成能力。使用亚甲基蓝（mb）作为
·
oh探针，观察其664nm处的吸收峰降低以检测
·
oh的生成。通过观察664nm处mb的吸收峰下降可以看出该纳米材料有优异的
·
oh生成能力以用于cdt治疗。使用便携式溶解氧仪测试h2o2存在下的水溶液中的溶解氧浓度，可以看出该材料可以生成o2以用于增强pdt效果。
31.图5为实施例一中cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物在酸性环境下单线态氧生成能力。使用1 ,3二苯基异苯并呋喃(dpbf)对纳米药物在670nm激光照射下产生单线态氧能力测试。dpbf可以与1o2反应使其在420nm处吸收峰下降。通过观察420nm处吸光度下降可以看出该纳米药物在酸性环境下可以释放光敏剂znpc以进行pdt治疗。
32.图6为实施例一中cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物对hepg2细胞的mtt法细胞光毒与暗毒实验。由图6a可知cu2o@cu
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/zif-67具有cdt效果，而在负载上光敏剂znpc后形成的cdt/pdt联合治疗相比单一的治疗模式有着明显的协同效应。
33.图7为实施例一中cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物对lo2细胞的mtt法细胞暗毒实验，说明该材料具有较好的生物相容性。
34.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种gsh/ph双响应型cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物的制备方法，其特征在于：以自制的cu2o纳米球为自模板混合六水合硝酸钴溶液和2-甲基咪唑甲醇溶液反应得到cu2o@cu
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/zif-67核壳结构，再加入四羧基酞菁锌、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物制得所述的cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将二水合氯化铜和聚乙烯吡咯烷酮k30溶于50ml去离子水，室温下搅拌至溶液澄清，加入5ml氢氧化钠溶液和5ml抗坏血酸溶液，室温搅拌15min，得到cu2o纳米球，离心并用水和甲醇多次洗涤后分散于15ml甲醇中；（2）将步骤（1）得到的溶液与十二烷基磺酸钠混合，超声30min后离心，分散于37ml甲醇中，加入12ml六水合硝酸钴甲醇溶液，室温搅拌10min，随后加入12ml 2-甲基咪唑甲醇溶液，室温搅拌1h，离心并用甲醇洗涤后真空干燥得到cu2o@cu
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/zif-67纳米材料；（3）将cu2o@cu
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/zif-67纳米材料溶于5ml甲醇中得溶液a，将四羧基酞菁锌溶于2ml n，n-二甲基甲酰胺中得溶液b，将溶液a和b混合，室温下搅拌，离心并用n，n-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤后真空干燥；（4）将步骤（3）得到产物溶于10ml去离子水中和聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物混合，室温搅拌12h，离心后真空干燥得到所述的cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中聚乙烯吡咯烷酮k30的用量为溶液质量的1.7%~2.3%，二水合氯化铜：氢氧化钠：抗坏血酸的摩尔比为2:10:5。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中十二烷基磺酸钠的质量浓度为0.1mg/ml，六水合硝酸钴：2-甲基咪唑的摩尔比为3:25。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中cu2o@cu
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/zif-67的质量浓度为2~2.5mg/ml，四羧基酞菁锌的质量浓度为2~2.5mg/ml。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4）中聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物的质量浓度为1.8~2.5mg/ml。7.一种如权利要求1所述的方法制得的gsh/ph双响应型cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物，其特征在于：纳米药物为大小200-300nm、厚度50-100nm的十二面体。8.一种如权利要求1所述的方法制得的gsh/ph双响应型cu2o@cu
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/zif-67@znpc核壳结构纳米药物在制备光动力治疗纳米药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种GSH/pH双响应型Cu2O@Cu


技术研发人员：贾潇 朱钰超 沈逸琳
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/13