一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法

1.本发明涉及生物医用高分子材料技术领域，特别涉及一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法。


背景技术：

2.因外伤、肿瘤切除、感染和先天性疾病导致的骨缺损在临床治疗中仍面临巨大挑战。目前，常见的骨填充材料包括：自体骨、异体骨及人工骨。尽管传统的自体骨、异体骨植入的治疗策略已达到临床实践，但一些缺点限制了它们的治疗效果。对于自体骨，可用性较差、潜在的供体损伤和尺寸匹配度低。异体骨的潜在风险是污染或感染、排斥反应或免疫反应以及疾病交叉传播。因此，自体骨和异体骨的应用受到限制。
3.理想的骨填充材料应满足良好的生物相容性、安全无毒、多孔及成骨诱导性，且应保证来源易得，成本低。黑磷(bp)是新兴的二维材料之一，具有独特的折叠层状结构，良好的生物相容性、优异的生物降解性和近红外光热转化效率高，在生物医学领域引起广泛关注。黑磷在生理环境中的降解产物为磷酸盐，能够与钙离子结合形成钙磷复合物，是骨组织重要无机组成成分。同时，bp介导的高效光热效应可提高骨缺损区的局部温度，并激活成骨相关细胞中的热休克反应，从而激活热休克蛋白(hsps)下游的成骨相关信号通路以加速骨再生。
4.然而基于黑磷的治疗平台都是利用生理环境中体内的钙离子来实现骨再生的生物矿化。如果将这些基于黑磷的无钙磷策略应用于患有骨缺损的老年患者或因钙丢失而导致骨骼受损的患者，其治疗效果将大打折扣。因此，非常有必要设计具有可调节的营养水平、富含矿化离子的bp纳米片人工骨支架。
5.由于黑磷纳米片(bpns)与氧气和水都具有较高的反应活性，在生理环境中容易降解，这限制了其在生物医学方面的应用。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，通过gelma紫外光交联，将黑磷纳米片和生物活性玻璃包裹，使黑磷纳米片在体内短期稳定存在，降低黑磷降解率；同时，利用黑磷纳米片和生物活性玻璃的协同作用，利用生物活性玻璃为黑磷成骨提供ca、si、p的生物矿化环境，利用黑磷近红外光热响应，进一步提高基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的骨修复效率。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
9.制备黑磷纳米片：将黑磷晶体粉末研磨后分散在超纯水中，采用细胞破碎仪对混合物冰浴破碎，之后进行冰浴超声，得到棕色分散液；棕色分散液离心后，收集沉淀重悬，得
到黑磷纳米片悬液；
10.制备甲基丙烯酸酯化明胶：将明胶在水浴条件下溶于pbs缓冲液中，制成明胶溶液；缓慢滴加甲基丙烯酸酰，搅拌反应，停止反应后用去离子水反复透析，得到甲基丙烯酸酯化明胶；
11.制备基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶：在光引发剂溶液中加入生物活性玻璃和黑磷纳米片，搅拌至均匀，加入甲基丙烯酸酯化明胶，搅拌，得到含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液；在含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液中加入聚乙二醇二丙烯酸酯，即得预聚液；预聚液避光搅拌至均匀，在紫外光照射下引发聚合反应，得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶；
12.所述生物活性玻璃的化学组成为sio
2-cao-p2o5。
13.优选的，所述光引发剂为i2959光引发剂；所述光引发剂溶液中光引发剂质的质量百分比为0.1％～1％。
14.优选的，所述生物活性玻璃的质量为含甲基丙烯酸酯化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯质量和的2.5～50％。
15.优选的，所述基于黑磷的黑磷的复合水凝胶中黑磷纳米片的含量为0.1～0.5mg/ml。
16.优选的，所述制备黑磷纳米片，具体为：将黑磷晶体粉末研磨后分散在超纯水中，采用功率为390～400w的细胞破碎仪对混合物冰浴破碎9～10小时，之后进行冰浴超声4～5小时，得到棕色分散液；在12000～13000rpm下离心20～30分钟，吸去上清液，收集沉淀重悬，得到黑磷纳米片悬液。
17.优选的，所述制备甲基丙烯酸酯化明胶，具体为：
18.将明胶在30～60℃水浴下溶于pbs缓冲液中，制成质量体积浓度为5％～20％的溶液；以0.1～1ml/min的速度加入甲基丙烯酸酐，其中，甲基丙烯酸酐与明胶溶液的质量体积比为7～8：1，于45～55℃水浴中搅拌反应4～24h，加入3～5倍量的pbs停止反应；所得液体用去离子水反复透析7～10d后，冷冻干燥得到白色松软的海绵状产物，即为甲基丙烯酸酯化明胶。
19.优选的，所述明胶的分子量为5000～500000。
20.优选的，所述聚乙二醇二丙烯酸酯分子量为500～1200单位。
21.优选的，所述紫外光照射，具体为：紫外光照10～300s。
22.优选的，所述生物活性玻璃为58％sio
2-35％cao-7％p2o5。
23.更优选的，所述明胶的分子量为10000～100000。
24.优选的，黑磷纳米片直径为200～800nm。
25.优选的，所述甲基丙烯酸酯化明胶占液相质量百分比为5～10％。
26.优选地，所述聚乙二醇二丙烯酸酯分子量为500～1200单位。
27.优选的，所述生物玻璃粒径为0.6-5微米。
28.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
29.(1)本发明的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，通过gelma紫外光交联，将黑磷纳米片和生物活性玻璃包裹，使黑磷纳米片在体内短期稳定存在，降低黑磷降解率；同时，利用黑磷纳米片和生物活性玻璃的协同作用，利用生物活性玻
璃为黑磷成骨提供ca、si、p的生物矿化环境，进一步提高基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的骨修复效率。另外，bp介导的高效光热效应还可提高骨缺损区的局部温度，并激活成骨相关细胞中的热休克反应，从而激活hsps下游的成骨相关信号通路以加速骨再生。
30.(2)本发明的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，制备得到的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶呈均匀的孔状结构，有良好的力学性能，可支持细胞的生长及成骨分化，有明显的促进新生骨的生成、骨缺损修复的作用；具有良好的生物降解性、生物相容性和极低的细胞毒性，适宜细胞的黏附生长与增殖；具有良好的光响应性，适宜骨修复过程的有效控制。
31.(3)本发明的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，制备工艺简单易操作，材料来源广泛，材料生物活性高，在再生医学和骨修复领域的应用前景广阔。
32.(4)本发明的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，可根据实际需要可通过对黑磷和生物活性玻璃的尺寸、浓度和构成水凝胶的组分、比例进行精确调控，选择适合的光照时间，配合不同模具，可实现不同形状、不同厚度的复合水凝胶的快速制备。
附图说明
33.图1为本发明的实施例1制备得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的扫描电镜图。
34.图2为本发明的实施例1制备得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶bp-bg/pegda/gelma、黑磷bp、水凝胶pegda/gelma、水凝胶bg/pegda/gelma的zeta电位图。
35.图3a为黑磷分散液的uv-vis吸收光谱；图3b为基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶分散液的uv-vis吸收光谱。
36.图4为空白对照组bg/pegda/gelma、本发明的实施例1～3制备的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的近红外光热转化行为示意图。
37.图5为本发明的实施例1制备的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶在近红外曝光5次开/关循环期间的温度变化。
38.图6为本发明的空白对照组bg/pegda/gelma、黑磷浓度为0.1mg/ml的bp-bg/pegda/gelma、黑磷浓度为0.2mg/ml的bp-bg/pegda/gelma、黑磷浓度为0.5mg/ml的bp-bg/pegda/gelma的cck-8细胞增值实验。
具体实施方式
39.下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
40.实施例1
41.一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶，由以下步骤制备成：
42.1)取4ml去离子水加入0.04g的光引发剂i2959，水浴加热60℃搅拌1-2h，使其充分溶解，得到均匀溶液。
43.2)将步骤1)获得的均匀溶液加入0.08g58s生物活性玻璃搅拌1h后，加入
4ml0.4mg/ml的黑磷纳米片悬液，搅拌1h至均匀，获得混合溶液。
44.3)将分子量为10000的明胶甲基丙烯酸酯化后，加入0.8g甲基丙烯酸酯化明胶到步骤2)中获得的混合溶液。搅拌3h，得到含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液。
45.4)将步骤3)获得的含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液加入0.8g聚乙二醇二丙烯酸酯，既得预聚液。
46.5)将步骤4)获得的预聚液，避光搅拌3h至均匀，获得分散均匀后超声除去气泡，置于模具中，在紫外光照射下光照5min引发聚合反应，即可得到所述的复合水凝胶。
47.本实施例制备的一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶中，光引发剂i2959占预聚液0.5w/v％，甲基丙烯酸酯化明胶占预聚液10w/v％，聚乙二醇二丙烯酸酯占预聚液10w/v％，58s生物活性玻璃占有机相5w/w％；复合水凝胶中黑磷纳米片含量为0.2mg/ml。
48.图1中示出了本实施例制备得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的扫描电镜图，由图可知，本实施例制备的冻干bp-bg/pegda/gelma水凝胶呈不规则的三维多孔结构。
49.图2中示出本实施例制备的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶bp-bg/pegda/gelma、黑磷bp、水凝胶pegda/gelma、水凝胶bg/pegda/gelma的zeta电位图，其中，水凝胶pegda/gelma、水凝胶bg/pegda/gelma除分别不含黑磷和生物玻璃、不含黑磷外，其他配比与样品bp-bg/pegda/gelma同。由图可知，bpns的zeta电位为-26.5mv，当bpns被水凝胶包裹时，pegda/gelma水凝胶中的正电荷在一定程度上中和了bpns的负电荷，bp-bg/pegda/gelma的zeta电位上升至-0.69mv，表明bpns已成功封装到pegda/gelma水凝胶中。
50.图3a为黑磷分散液的uv-vis吸收光谱；图3b为bp-bg/pegda/gelma分散液的uv-vis吸收光谱。对比可知，黑磷分散液和bp-bg/pegda/gelma分散液的uv-vis吸收峰强度在7天内均呈现逐渐降低的趋势，表明黑磷固有的降解特性。bp-bg/pegda/gelma分散液的uv-vis吸收峰强下降较为缓慢，由于聚合物的保护，增强了bpnss在液体环境中的稳定性，有效减缓了bpnss的降解。
51.取0.5ml本实施例制备的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶溶液在nir光(0.5w/cm2)下照射10分钟测试温度变化情况，得到本实施例的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的近红外光热转化行为如图4中0.2bp所示在nir光(0.5w/cm2)下连续暴露5个循环(照射5分钟，冷却5分钟)，可以使水凝胶稳定升温14～16℃，使室温下升高至39～41℃，达到这一温度会提高hsp蛋白的表达，从而促成骨，结果如图5所示。
52.本实施例制备的黑磷浓度为0.2mg/ml的bp-bg/pegda/gelma样品与bmscs共培养1天、4天、7天后的细胞增殖情况。图6中0.2bp示出了本实施例制备得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶细胞增殖的od值。
53.实施例2
54.1)取4ml去离子水加入0.04g的光引发剂i2959，水浴加热60℃搅拌1-2h1-2h，使其充分溶解，得到均匀溶液。
55.2)将步骤1)获得的均匀溶液加入0.08g58s生物活性玻璃搅拌1h后，加入4ml0.2mg/ml的黑磷纳米片悬液，搅拌1h至均匀，获得混合溶液。
56.3)将分子量为10000的明胶甲基丙烯酸酯化后，加入0.8g甲基丙烯酸酯化明胶到
步骤2)中获得的混合溶液。搅拌3h，得到含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液。
57.4)将步骤3)获得的含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液加入0.8g聚乙二醇二丙烯酸酯，既得预聚液。
58.5)将步骤4)获得的预聚液，避光搅拌3h至均匀，获得分散均匀后超声除去气泡，置于模具中，在紫外光照射下光照5min引发聚合反应，即可得到所述的复合水凝胶。
59.本实施例制备的一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶中，光引发剂i2959占预聚液0.5w/v％，甲基丙烯酸酯化明胶占预聚液10w/v％，聚乙二醇二丙烯酸酯占预聚液10w/v％，58s生物活性玻璃占有机相5w/w％；复合水凝胶中黑磷纳米片含量为0.1mg/ml。
60.取0.5ml本实施例制备的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶溶液在nir光(0.5w/cm2)下照射10分钟测试温度变化情况，得到的本实施例的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶溶液的近红外光热转化行为如图4中0.1bp所示。
61.测试本实施例制备的黑磷浓度为0.1mg/ml的bp-bg/pegda/gelma样品与bmscs共培养1天、4天、7天后的细胞增殖情况。图6中0.1bp示出了本实施例制备得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的细胞增殖od值。
62.实施例3
63.1)取4ml去离子水加入0.04g的光引发剂i2959，水浴加热60℃搅拌1-2h，使其充分溶解，得到均匀溶液。
64.2)将步骤1)获得的均匀溶液加入0.08g58s生物活性玻璃搅拌1h后，加入4ml1mg/ml的黑磷纳米片悬液，搅拌1h至均匀，获得混合溶液。
65.3)将分子量为10000的明胶甲基丙烯酸酯化后，加入0.8g甲基丙烯酸酯化明胶到步骤2)中获得的混合溶液。搅拌3h，得到含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液。
66.4)将步骤3)获得的含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液加入0.8g聚乙二醇二丙烯酸酯，既得预聚液。
67.5)将步骤4)获得的预聚液，避光搅拌3h至均匀，获得分散均匀后超声除去气泡，置于模具中，在紫外光照射下光照5min引发聚合反应，即可得到所述的复合水凝胶。
68.本实施例制备的一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶中，光引发剂i2959占预聚液0.5w/v％，甲基丙烯酸酯化明胶占预聚液10w/v％，聚乙二醇二丙烯酸酯占预聚液10w/v％，58s生物活性玻璃占有机相5w/w％；复合水凝胶中黑磷纳米片含量为0.5mg/ml。
69.图4中0.5bp示出了本实施例制备得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的近红外光热转化行为示意图。
70.取0.5ml本实施例制备的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶溶液在nir光(0.5w/cm2)下照射10分钟测试温度变化情况，得到的本实施例的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶溶液的近红外光热转化行为如图4中0.5bp所示。
71.测试本实施例制备的黑磷浓度为0.5mg/ml的bp-bg/pegda/gelma样品与bmscs共培养1天、4天、7天后的细胞增殖情况。图6中0.5bp示出了本实施例制备得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶细胞增殖的od值。
72.关于复合水凝胶的近红外光热转化行为对比：
73.对比可知，在nir光(0.5w/cm2)下照射5分钟:实施例1所制黑磷浓度为0.2mg/ml的bp-bg/pegda/gelma温度可升高到42.8℃；实施例2所制黑磷浓度为0.1mg/ml的bp-bg/pegda/gelma温度可升高到37.3℃；实施例3所制黑磷浓度为0.5mg/ml的bp-bg/pegda/gelma温度可升高到49.7℃。用作黑磷温热调控hsp蛋白表达光热成骨，实施例2温度偏低，实施例3温度偏高，实例1最佳。
74.关于复合水凝胶的cck-8细胞增值实验对比：
75.对比可知，随培养天数增加，各组od值都在增大，说明细胞生长良好。培养第1天时，实施例1组(0.2bp)、实施例2组(0.1bp)、实施例3组(0.5bp)与control组(0bp)没有明显差异；培养第4天时，实施例1组(0.2bp)、实施例2组(0.1bp)与control组(0bp)没有显著性差异，实施例3组(0.5bp)明显低于control组(0bp)；培养第7天时各组od值均提高，实施例1组(0.2bp)od值最高，其次实施例2组(0.1bp)较高、control组(0bp)，实施例3组(0.5bp)od值最低。表明黑磷的存在促进了细胞的增值，当黑磷浓度为0.2mg/ml时(实施例1)，起到了明显促进效果。
76.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备黑磷纳米片：将黑磷晶体粉末研磨后分散在超纯水中，采用细胞破碎仪对混合物冰浴破碎，之后进行冰浴超声，得到棕色分散液；棕色分散液离心后，收集沉淀重悬，得到黑磷纳米片悬液；制备甲基丙烯酸酯化明胶：将明胶在水浴条件下溶于pbs缓冲液中，制成明胶溶液；滴加甲基丙烯酸酐，搅拌反应，停止反应后用去离子水反复透析，得到甲基丙烯酸酯化明胶；制备基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶：在光引发剂溶液中加入生物活性玻璃和黑磷纳米片，搅拌至均匀，加入甲基丙烯酸酯化明胶，搅拌，得到含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液；在含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液中加入聚乙二醇二丙烯酸酯，即得预聚液；预聚液避光搅拌至均匀，在紫外光照射下引发聚合反应，得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶；所述生物活性玻璃的化学组成为sio
2-cao-p2o5。2.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为i2959光引发剂；所述光引发剂溶液中光引发剂质的质量百分比为0.1％～1％。3.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述生物活性玻璃的质量为含甲基丙烯酸酯化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯质量和的2.5～50％。4.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述基于黑磷的黑磷的复合水凝胶中黑磷纳米片的含量为0.1～0.5mg/ml。5.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备黑磷纳米片，具体为：将黑磷晶体粉末研磨后分散在超纯水中，采用功率为390～400w的细胞破碎仪对混合物冰浴破碎9～10小时，之后进行冰浴超声4～5小时，得到棕色分散液；在12000～13000rpm下离心20～30分钟，吸去上清液，收集沉淀重悬，得到黑磷纳米片悬液。6.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备甲基丙烯酸酯化明胶，具体为：将明胶在30～60℃水浴下溶于pbs缓冲液中，制成质量体积浓度为5％～20％的溶液；以0.1～1ml/min的速度加入甲基丙烯酸酐，其中，甲基丙烯酸酐与明胶溶液的质量体积比为7～8：1，于45～55℃水浴中搅拌反应4～24h，加入3～5倍量的pbs停止反应；所得液体用去离子水反复透析7～10d后，冷冻干燥得到白色松软的海绵状产物，即为甲基丙烯酸酯化明胶。7.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述明胶的分子量为5000～500000。8.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇二丙烯酸酯分子量为500～1200单位。9.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述紫外光照射，具体为：紫外光照10～300s。
10.根据权利要求1所述的基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述生物活性玻璃为58％sio
2-35％cao-7％p2o5。

技术总结
本发明公开了一种基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶的制备方法：在光引发剂溶液中加入生物活性玻璃和黑磷纳米片，搅拌至均匀，加入甲基丙烯酸酯化明胶，搅拌，得到含甲基丙烯酸酯化明胶的混合溶液；加入聚乙二醇二丙烯酸酯，避光搅拌至均匀，在紫外光照射下引发聚合反应，得到基于黑磷增强生物活性玻璃成骨的复合水凝胶。本发明通过GelMA紫外光交联，将黑磷纳米片和生物活性玻璃包裹，使黑磷纳米片在体内短期稳定存在，降低黑磷降解率；同时，生物活性玻璃为黑磷成骨提供生物矿化环境；BP介导的高效光热效应可提高骨缺损区的局部温度，并激活成骨相关细胞中的热休克反应，从而激活HSPs下游的成骨相关信号通路以加速骨再生。生。生。


技术研发人员：曾倩 杭飞 陈晓峰 周柳琪 王一凡 张明豪 金宇峰
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2023.04.28
技术公布日：2023/8/13