盐霉素在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于抗生素的技术领域，更具体地，涉及盐霉素在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用。


背景技术：

2.在化学医药领域中，尿酸是人类嘌呤化合物的最终代谢产物。人体内源性产生的嘌呤和外源性摄入的嘌呤最终都在肝脏中被黄嘌呤氧化酶代谢为尿酸。由于尿酸氧化酶的进化缺失，灵长类动物和人类都无法将尿酸代谢为尿囊素，因此人体血清尿酸水平比其他哺乳动物高五到六倍。
3.在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于416μmol/l，女性高于360μmol/l，即称为高尿酸血症(hyperuricemia)。高尿酸血症(hyperuricemia，hua)是由于尿酸合成与尿酸排泄不平衡所导致，体内大量的尿酸盐沉积容易诱发关节和组织的损伤，出现炎症反应，继而引发痛风、心血管疾病、糖尿病等代谢性疾病。
4.通常，单纯的处于高尿酸血症状态并没有自觉症状，但如果长时间处于该状态，血液中的尿酸盐将发生结晶，沉积在关节、皮下组织、肾脏等部位，进而出现痛风及痛风并发症等一系列临床表现。现今痛风已经成为我国仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病，并严重危害着人们的生命和健康。
5.此外，还有大量研究表明，高尿酸血症与肾病疾病密切相关。体内高尿酸水平会引起不同程度的肾小管损伤、间质纤维化、肾小球硬化等等。尿酸的排泄70％通过肾脏，30％通过肠道；肾脏作为尿酸排泄的主要途径，排泄减少和重吸收增加都将引起高尿酸血症。
6.肾脏中的尿酸转运蛋白是尿酸排泄和重吸收的重要部分，大致可分为重吸收相关蛋白和分泌相关蛋白。重吸收相关蛋白，如葡萄糖转运蛋白9(glut9)和尿酸转运蛋白1(urat1)；分泌相关蛋白，如有机阴离子转运体(oat)1和atp结合转运蛋白g2(abcg2)。
7.目前治疗高尿酸血症的药物主要靶向抑制尿酸生成和促进尿酸排泄的转运蛋白。但是，目前上市的药物如别嘌呤醇、托匹司他、苯溴马隆等虽具有较强的降尿酸作用，但会引起肝肾造成损伤等不良反应；雷西纳德为首个选择性抑制尿酸重吸收抑制剂，能特异性抑制urat1转运体，但其对于肝脏损害、有过肾透析的患者不可用该药物治疗。因此，如何提供一种能够降低尿酸，治疗高尿酸血症，副作用小且对器官具有保护作用的降尿酸药物成为亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

8.针对上述现有的技术问题，本发明的首要目的在于提供盐霉素在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用，所述盐霉素能够有效地降低动物体血清中的尿酸，能够起到治疗高尿酸血症的作用，且无明显的副作用。
9.本发明的第二个目的在于提供盐霉素在制备治疗和/或预防高尿酸血症引起的痛风或痛风并发症药物中的应用。
10.本发明的第三个目的在于提供盐霉素在制备治疗高尿酸血症引起的肾损伤的药物中的应用。
11.本发明的第四个目的在于提供包含治疗有效量的盐霉素和任选自药学上可接受的载体或辅料的药物组合物在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用。
12.本发明的第五个目的在于提供包含治疗有效量的盐霉素和任选自药学上可接受的载体或辅料的药物组合物在制备治疗高尿酸血症引起的肾损伤的药物中的应用。
13.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
14.盐霉素在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用。
15.发明人首先通过腹腔注射氧嗪酸钾和灌胃给予次黄嘌呤构建高尿酸血症病小鼠模型，通过he染色观察高尿酸血症模型小鼠和盐霉素给药小鼠的组织病理变化，研究盐霉素对于降尿酸以及治疗高尿酸血症的作用。发明人通过实验发现，盐霉素能够有效降低小鼠血清中的尿酸，能够起到治疗高尿酸血症的作用；此外，发明人还发现盐霉素能够改善肾小管扩张导致的损害，减少肾小管上皮细胞的坏死，进而起到减轻肾脏损伤的作用。发明人通过进一步的研究发现，盐霉素可能通过有效抑制了动物体内urat1的表达，从而达到降尿酸，治疗高尿酸血症，以及减轻肾脏损伤的作用。
16.进一步地，本发明还请求保护盐霉素在制备治疗和/或预防高尿酸血症引起的痛风或痛风并发症药物中的应用。
17.优选地，所述痛风并发症为痛风性关节炎、尿路结石或心血管病中的一种或多种。更具体而言，痛风可以是急性痛风或慢性痛风；所述心血管病包括但不限于血栓、动脉粥样硬化等心血管病。
18.进一步地，基于本发明的研究，本发明还请求保护盐霉素在制备治疗高尿酸血症引起的肾损伤的药物中的应用。
19.优选地，所述肾损伤是指肾小管扩张和/或肾小管上皮细胞坏死。
20.优选地，所述治疗高尿酸血症是指降低尿酸的重吸收。
21.优选地，所述降低尿酸的重吸收是指通过抑制urat1的表达实现降低尿酸的重吸收。
22.优选地，所述高尿酸血症为氧嗪酸钾和/或次黄嘌呤导致的高尿酸血症。
23.进一步地，本发明还请求保护一种药物组合物在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用，所述药物组合物包含治疗有效量的盐霉素和任选自药学上可接受的载体或辅料。
24.进一步地，本发明还请求保护一种药物组合物在制备治疗高尿酸血症引起的肾损伤的药物中的应用，所述药物组合物包含治疗有效量的盐霉素和任选自药学上可接受的载体或辅料。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过实验发现，盐霉素能够有效降低小鼠血清中的尿酸，进而起到治疗高尿酸血症的作用；此外，盐霉素还能够改善肾小管扩张导致的损害，减少肾小管上皮细胞的坏死，进而起到减轻肾脏损伤的作用。盐霉素可能通过抑制动物体内urat1的表达，从而达到降尿酸，治疗高尿酸血症，以及减轻肾脏损伤的作用。
附图说明
26.图1为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸、血尿素氮与血肌酐水平的影响示意图；图1中，图a为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸水平的影响示意图；图b为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血尿素氮水平的影响示意图；图c为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血肌酐水平的影响示意图。
27.图2为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠肾脏病理损伤的影响示意图。
28.图3为盐霉素对高尿酸血症小鼠肾脏urat1蛋白表达水平的影响示意图；图3中，图a为不同处理组中，urat1蛋白表达水平的条带显影示意图，图b为不同处理组中，urat1蛋白表达水平示意图。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.实施例1盐霉素的体内降尿酸活性实验
31.(1)实验动物分组
32.本发明选取体重在20
±
2g左右的雄性km小鼠，将小鼠饲养在标准条件下，在温度为25
±
1℃和50
±
10％的湿度的受控室内，进行12小时的明/暗循环。允许所有动物自由进食实验室饮食和水。将小鼠随机分成六组，每组6只小鼠。分别为：空白组(control组)、高尿酸血症模型组(hn组)、盐霉素低剂量给药组(0.5mg/kg，hn+sal 0.5mg组)、盐霉素高剂量给药组(1mg/kg，hn+sal 1mg组)、别嘌呤醇组(hn+ap组)、单独给药盐霉素组(1mg/kg，sal 1mg组)。
33.(2)高尿酸血症模型小鼠的建立和给药
34.除空白组和单独给药组给予0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)之外，剩下的四组给予氧嗪酸钾和次黄嘌呤进行造模。模型构建半个小时后，按照组别分别给药，共持续7天。
35.(3)动物处死和生化指标的检测
36.在第七天，给药两小时后对小鼠进行麻醉及眼眶取血，然后处死，解剖取出肾脏，并进行组织固定，用于后续进行病理染色分析。脏器组织于-80℃冰箱保存。血液样品离心后取上清，用生化仪进行相关生化指标的检测。
37.图1为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸、血尿素氮与血肌酐水平的影响示意图；其中，图a为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸水平的影响示意图。如图a所示，高尿酸血症模型组(hn组)小鼠的血尿酸水平约250μm，明显高于空白组(control组)，而不同剂量的盐霉素给药组(hn+sal 0.5mg组，hn+sal 1mg组)的小鼠尿酸水平都比高尿酸血症模型组(hn组)有显著性的降低，说明盐霉素的降尿酸效果较好。
38.图b为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血尿素氮水平的影响示意图，如图b所示，高尿酸血症模型组(hn组)小鼠的血尿素氮水平明显高于空白组(control组)，而不同剂量的盐霉素给药组(hn+sal 0.5mg组，hn+sal 1mg组)的小鼠血尿素氮水平都比高尿酸血症模型组(hn组)有显著性的降低；而阳性药别嘌醇组(hn+ap组)的血尿素氮水平甚至高于高尿酸血症模型组(hn组)，说明该药对小鼠的肾脏具有一定的损伤，而盐霉素却对肾脏有一定的
保护作用。
39.图c为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠血肌酐水平的影响示意图，如图c所示，高尿酸血症模型组(hn组)小鼠的血肌酐水平明显高于空白组(control组)，而不同剂量的盐霉素给药组(hn+sal 0.5mg组，hn+sal 1mg组)的小鼠血肌酐水平都比高尿酸血症模型组(hn组)有显著性的降低；而阳性药别嘌醇组(hn+ap组)的血肌酐水平和高尿酸血症模型组(hn组)相当，说明该药对小鼠的肾脏具有一定的损伤，而盐霉素却对肾脏有一定的保护作用。
40.图2为盐霉素对高尿酸血症模型小鼠肾脏病理损伤的影响示意图，如图2所示，高尿酸血症模型(hn组)可引起小鼠肾脏的肾小管扩张，肾小管上皮细胞坏死，而盐霉素给药组可改善肾小管扩张的损害作用，进而起到对肾脏有的保护作用。
41.实施例2盐霉素在体内对urat1表达的影响实验
42.(1)小鼠肾脏蛋白提取
43.取实施例1步骤(3)中的小鼠肾脏组织约5mg，加入裂解液、蛋白酶抑制剂(100
×
)和磷酸酶抑制剂(50
×
)，放入钢珠2颗，于研磨机上进行超声研磨。把研磨液进行涡旋混匀，约5min一次，总共进行6次。低温离心，13000rcf，15min，取上清至新的离心管。
44.(2)蛋白定量
45.取组织上清2μl于96孔板，加入18μl dd h2o，然后再加入200μl bca蛋白定量工作液。于孵箱孵育30min。取置于出于酶标仪570mm吸光度值处测吸光度。把吸光度值代入标准曲线中计算出样品的浓度，同时计算出需要加入ripa和loading buffer的量，进行蛋白的稀释和定量。把配置好的蛋白样品于100℃金属浴中煮5-8min。把煮好的蛋白放置在-80℃冰箱保存。
46.(3)western blot验证urat1的表达量
47.①
电泳：按照比例配置好sds-page凝胶，加入足够的电泳液，拔出凝胶的梳子，按照顺序上蛋白样品。开始电泳，用80v电压对蛋白进行浓缩压线，后转换为100v电压对蛋白进行分离。
48.②
转膜：电泳结束后，先把pvdf膜泡入甲醇中进行活化。然后按照三明治法对凝胶进行转膜，把sds-page上的蛋白转到pvdf膜上。加入足够的转膜液，用90v电压进行转膜。转膜结束用5％的脱脂牛奶对pvdf膜进行封闭1h。封闭结束后，按照urat1的蛋白分子量对pvdf膜进行切割。
49.③
抗体的孵育：urat1的抗体按照1：1000的比例进行稀释，然后把urat1条带放入urat1的抗体管孵育过夜。一抗孵育结束后，用tbst溶液对条带进行洗膜，约5min一次，共进行6次。用5％脱脂牛奶按照1：5000的比例配置一抗对应种属的二抗溶液。把条带放入二抗孵育盒中孵育约1h。二抗孵育结束后，用tbst溶液对条带进行洗膜，约10min一次，共进行3次。
50.④
显影：tcl发光液按照1：1的比例配好，每个条带均匀滴加200μl发光液，然后置于多功能成像分析系统中进行条带显影。
51.图3为盐霉素对高尿酸血症小鼠肾脏urat1蛋白表达水平的影响示意图，其中，图3中，图a为不同处理组中，urat1蛋白表达水平的条带显影示意图，图b为不同处理组中，urat1蛋白表达水平示意图。如图3所示，高尿酸血症模型组的urat1表达水平明显升高，而不同剂量的盐霉素给药组小鼠体内urat1水平都降低，说明盐霉素可能通过有效抑制了
urat1的表达从而起到降尿酸的作用，以及减轻肾脏损伤的作用。
52.基于上述实验及其实验结果，本发明证明了盐霉素能够有效降低小鼠血清中的尿酸，进而起到治疗高尿酸血症的作用；此外，盐霉素还能够改善肾小管扩张导致的损害，减少肾小管上皮细胞的坏死，进而起到减轻肾脏损伤的作用。盐霉素可能通过有效抑制了动物体内urat1的表达，从而达到降尿酸，治疗高尿酸血症，以及减轻肾脏损伤的作用。
53.前述的实施例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例为申请人真实试验结果加以论证。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

技术特征：
1.盐霉素在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用。2.盐霉素在制备治疗和/或预防高尿酸血症引起的痛风或痛风并发症药物中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述痛风并发症为痛风性关节炎、尿路结石或心血管病中的一种或多种。4.盐霉素在制备治疗高尿酸血症引起的肾损伤的药物中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肾损伤是指肾小管扩张和/或肾小管上皮细胞坏死。6.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述治疗高尿酸血症是指降低尿酸的重吸收。7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述降低尿酸的重吸收是指通过抑制urat1的表达实现降低尿酸的重吸收。8.根据权利要求1～5任一所述应用，其特征在于，所述高尿酸血症为氧嗪酸钾和/或次黄嘌呤导致的高尿酸血症。9.一种药物组合物在制备降尿酸、治疗高尿酸血症、治疗和/或预防高尿酸血症引起的痛风或痛风并发症的药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的盐霉素和任选自药学上可接受的载体或辅料。10.一种药物组合物在制备治疗高尿酸血症引起的肾损伤的药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的盐霉素和任选自药学上可接受的载体或辅料。

技术总结
本发明公开了盐霉素在制备降尿酸和/或治疗高尿酸血症的药物中的应用。此外，本发明还请求保护盐霉素在制备治疗和/或预防高尿酸血症引起的痛风或痛风并发症药物中的应用，以及盐霉素在制备治疗高尿酸血症引起的肾损伤的药物中的应用。所述盐霉素能够有效地降低动物体血清中的尿酸，能够起到治疗高尿酸血症的作用，能够起到减轻肾脏损伤的作用，且无明显的副作用。副作用。副作用。


技术研发人员：王健松 庞建新 秦飞 王玮 谢周凡 鲍颖霞 吴婷 陈泳君
受保护的技术使用者：广州白云山医药集团股份有限公司白云山制药总厂
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/13