醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶及在他汀类药物手性中间体连续流合成中的应用

醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶及在他汀类药物手性中间体连续流合成中的应用
(一)技术领域
1.本发明涉及一种6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的制备方法，特别涉及一种基于功能化树脂固定化酶填充的循环式连续流反应器高效绿色生产6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的方法。
(二)

背景技术：

2.阿托伐他汀和瑞舒伐他汀、匹伐他汀等“超级他汀”是治疗心脑血管疾病的重大降脂药品种，具有高效的降脂功效、长期安全性和临床益处，显著降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。血浆中胆固醇的正常含量为0-200mg/dl，当ldl胆固醇浓度升高沉积于心脑部位血管动脉内壁，导致动脉粥样硬化性斑块，从而引发心血管疾病。而他汀类药物能够作为胆固醇合成限速酶的竞争性抑制剂，降低血液中低密度脂蛋白(low density lipoprotein,ldl)胆固醇水平。在降低心脑血管疾病发生率及抗氧化、消炎、抗癌，预防中风和老年痴呆症等方面也得到了广泛研究应用。
3.6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯、6-氯-(3r,5s)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀、瑞舒伐他汀及匹伐他汀合成的关键手性中间体。由于6-取代-(3r,5r/s)-二羟基己酸叔丁酯具有两个手性中心，因此，研究光学纯6-取代-(3r,5r/s)-二羟基己酸叔丁酯的手性合成方法学和合成技术具有重要意义。化学法合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯反应条件较为苛刻，其第二个手性中心的合成，需要在超低温-90℃条件下，二异丙基胺基锂(lda)脱质子缩合，硼烷作为手性诱导剂，硼氢化钠作为还原剂进行反应。该反应存在选择性不强，产物光学纯度低，能耗大、成本高、环境不友好等问题。而生物催化合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯，具有原子利用率高，区域/立体选择性高，反应条件温和，有机试剂用量少，安全绿色等优势，可避免化学法的多步保护与去保护步骤。
4.现有生物催化合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯反应体系主要包括醛酮还原酶偶联葡萄糖脱氢酶双酶双底物体系以及羰基还原酶偶联辅底物异丙醇的单酶双底物体系，而目前主要是通过全细胞或游离酶构筑的酶-偶联与底物-偶联体系来实现6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的不对称还原合成。
5.而采用游离细胞或者酶作为催化剂，游离细胞或者酶的稳定性较差，易变性失活；细胞或者酶只能一次性使用，增加了酶制剂成本与废水、废渣排放；酶与底物和产物的混合加大了产物的分离纯化的难度，影响产品收率，增加生产成本。而酶固定化技术因其稳定性高、与反应混合物分离简单、可回收性强等优点，可解决上述问题。但是，将第一代热点材料(硅藻土、树脂、多孔玻璃、多糖类材料等)作为固定化酶的基质，普遍存在回收率和稳定性不高等缺点。
6.因此，设计理想的固定化方案，筛选合适的具备工业属性的固定化材料，采用静电吸附的方法，为提高醛酮还原酶固定化酶的稳定性及酶活回收率，自动化、高效连续式生产6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯，成为酶法合成他汀类药物关键手性中间体的瓶颈。
7.0、20mm磷酸钠缓冲液)洗脱目的蛋白并收集后置于冰上保存，再用50mm ph 7.0磷酸钠缓冲液4℃透析(透析袋的截留分子量为10kda)12h，收集截留液，即为醛酮还原酶纯酶液。
15.所述葡萄糖脱氢酶纯酶液制备步骤和醛酮还原酶纯酶液的步骤相同，葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
16.优选的，所述共固定化酶按以下方法制备获得：
17.(1)戊二醛修饰氨基树脂
18.将氨基树脂加入含体积浓度0.5-2％的戊二醛的磷酸钠缓冲液(0.2m，ph 7.0)中，37℃搅拌1h对氨基树脂进行活化，然后用0.2m，ph 7.0磷酸钠缓冲液冲洗树脂去掉未反应的戊二醛，获得戊二醛修饰的氨基树脂；
19.(2)葡萄糖脱氢酶的固定化
20.将葡萄糖脱氢酶bmgdh纯酶液添加到步骤(1)戊二醛修饰的氨基树脂中，在28℃、200rpm下孵育3小时，用0.2m、ph 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤后，获得葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合物；
21.(3)pei修饰
22.将步骤(2)葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合物添加到体积浓度2～6％的pei水溶液中，在28℃、200rpm下孵育过夜，并用0.2m、ph7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，对氨基树脂表面进行pei修饰，实现了树脂表面局部带正电的微环境，获得pei修饰树脂；
23.(4)醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶
24.将醛酮还原酶纯酶液加入步骤(3)pei修饰树脂，在28℃、200rpm下孵育18小时，通过pei和醛酮还原酶酶分子静电吸附作用，有效固定醛酮还原酶，用0.2m、ph7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，获得醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。
25.本发明还提供一种所述醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶在不对称还原6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述应用的方法按如下步骤进行：以醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶为催化剂，以6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，添加nadph，ph 4-10(优选ph为6)的缓冲液为反应介质，在25-65℃(优选40℃)下反应4h后，反应结束，反应液分离纯化，获得6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯。
26.优选，所述底物添加终浓度10-100g/l，优选20g/l；所述葡萄糖添加终浓度10-100g/l，优选30g/l。所述固定化酶催化剂用量以缓冲液体积计为50-200g/l，优选-为150g/l。所述nadph添加终浓度为1-3mm，优选1mm。
27.更优选，所述反应在连续流反应器中进行，所述连续流反应器包括反应液储罐、流量泵、填充式反应柱、液体收集罐，所述填充式反应柱设有进液口和出液口；所述反应液储罐通过流量泵与填充式反应柱进液口连接；所述填充式反应柱出液口分别与液体收集罐和反应稀释液连通，其中反应稀释液与高效液相色谱仪连通，液体收集罐与反应液储罐连通构成循环；
28.将醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶装载到填充式反应柱中，直至每个填充式反应柱都被装满，并将柱温保持在25-65℃；使用注射泵(slp01-02a，兰格，中国)将含有底物6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(5r)-1、nadp
+
和葡萄糖的ph4-10的缓冲液，在0.25-10ml/h流速下，连续流加到填充式反应柱中，反应完全后，反应液分离纯化，获得6-氰
基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯。
29.优选的，所述填充式反应柱温度保持在40℃、缓冲液为ph 6.0、200mm的磷酸盐缓冲液，流速为5ml/h。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
31.本发明选用表面功能化的树脂，采用化学交联和静电吸附的方法，醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的共固定化酶，比游离酶的最适反应温度提高5℃，在弱酸性(ph 6)条件下，固定化酶相对活力比游离酶高12％，且共固化酶在使用8个批次后仍保留80.7％的相对活力。
32.本发明设计的固定化酶具备批次使用良好、酶活保留高的优势，构建的循环式连续流生物反应系统具备杂质少、固液分离容易、反应器易清洗、更换催化剂简便的优势，并验证了闭环、无废、绿色合成医药中间体的技术可行性，实现了辅酶循环，0.25-5ml/h流速下完全转化底物(20g/l)，7ml/h及以上流速下未反应的底物二次循环实现更高的转化率，5ml/h的流速下运行90小时的催化反应后保留了95％以上的转化率、实现了产物的连续稳定合成。对其他氧化还原酶的级联/偶联催化反应、固定化方法和载体的选择提供了参考，为工业上生物法合成药物成分提供新的思路和理论基础，对车间技术和设备的革新具有重要的借鉴意义，且具有可观的经济效益和广阔的应用前景。
(四)附图说明
33.图1为醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶双酶偶联合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的反应式。
34.图2为实施例1醛酮还原酶纯酶液与葡萄糖脱氢酶纯酶液的sds-page电泳图。
35.图3为实施例2不同树脂的显微照片。
36.图4为实施例2不同树脂的化学结构示意图。
37.图5为实施例3静电吸附不同来源醛酮还原酶的固定化酶活力柱形图。
38.图6为实施例5戊二醛和聚乙烯亚胺浓度对固定化率的影响柱形图。
39.图7为实施例7葡萄糖脱氢酶浓度对固定化酶活力影响柱形图。
40.图8为实施例7醛酮还原酶浓度对固定化酶活力影响柱形图。
41.图9为实施例8树脂和酶-树脂固定化复合物的红外表征图。
42.图10为实施例8树脂及酶-树脂固定化复合物的热重表征图。
43.图11为实施例9ph对游离酶和固定化酶相对活性影响的曲线图。
44.图12为实施例10温度对游离酶和固定化酶相对活性影响的曲线图。
45.图13为实施例11醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶的重复使用次数对相对活性影响的柱形图。
46.图14为实施例12双酶共固化介导的循环式连续流反应器的示意图。
47.图15为实施例12连续流反应器不同流速催化合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的转化率柱形图。
48.图16为实施例13醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶在釜式反应和连续流反应后的电镜表征图。
(五)具体实施方式
49.以下结合实例来进一步说明本发明，但本发明的保护并不仅限于此：
50.lb液体培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为水，ph自然。
51.lb固体培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂18g/l，溶剂为水，ph自然。
52.本发明实施例所用环氧树脂(epoxy resin)lxte-600，氨基树脂(amino resin)lxte-700，氨基环氧树脂(amino-epoxy resin)lxte-706、羧基树脂(carboxyl resin)lxte-800、离子交换树脂(ion exchange resin)lxte-901、大孔树脂(macrosporous resin)lxte-1000，以及氨基树脂(amino resin)lxte-703、lxte-704和lxte-705均购自西安蓝晓公司；其中lxte-703、lxte-704和lxte-705结构相同，只是树脂粒径分别为28.7，195.2，154.0μm.
53.实施例1:醛酮还原酶纯酶液、葡萄糖脱氢酶纯酶液的制备
54.1、醛酮还原酶纯酶液
55.(1)工程菌：将genbank中源自马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)的醛酮还原酶kmakr基因(核苷酸序列：seq id no.1)和源自多布克鲁维酵母(kluyveromycesdobzhanskii)的醛酮还原酶kdakr(核苷酸序列：seq id no.2)人工合成后，用相同的限制性内切酶(ncoi和xhoi)处理合成的目的基因片段和pet28a载体，并利用t4 dna连接酶将经同样酶切处理的片段和载体pet28a进行连接，获得重组表达载体pet28a-kmakr与pet28a-kdakr。进一步将重组表达载体转入化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板，37℃下过夜培养，随机挑取单克隆抽提质粒进行测序鉴定，分别获得重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28a-kmakr与e.coli bl21(de3)/pet28a-kdakr。
56.(2)粗酶液：将步骤(1)获得的重组大肠杆菌分别接种至lb固体培养基，37℃培养12h，获得活化菌体；将活化菌体接种至lb液体培养基，37℃、200rpm培养8h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％(v/v)的接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液体培养基中，37℃、200rpm培养2h至od值0.6-0.8，加入终浓度为0.15mm iptg，28℃、200rpm培养12h。并在4℃、8000rpm下离心10min，收集湿菌体；按照每1g湿菌体悬浮于20ml的ph 7、20mm磷酸钠缓冲液中得到菌悬液，超声破碎30min(功率300w，破碎1s，暂停3s)，12000rpm、4℃离心10min，收集上清，0.45μm微膜过滤去除细胞碎片等不溶性物质，滤液即为醛酮还原酶粗酶液。
57.(3)纯酶液：镍柱(1.6cm
×
10cm，bio-rad，usa)用a液(含300mm nacl和20mm咪唑的ph 7.0，20mm磷酸钠缓冲液)平衡后，上样步骤(2)粗酶液，上样量为1-2个柱体积，用a液冲洗3-4个柱体积，去除杂质和结合较弱的蛋白；再用b液(含300mm nacl，500mm咪唑的ph 7.0、20mm磷酸钠缓冲液)洗脱目的蛋白并收集后置于冰上保存，再用50mm ph 7.0磷酸钠缓冲液4℃透析(透析袋的截留分子量为10kda)12h，收集截留液，分别获得醛酮还原酶kmakr纯酶液和醛酮还原酶kdakr纯酶液。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳(sds-page)鉴定蛋白质大小，电泳图见图2所示，通过蛋白质定量试剂盒(bca法)测定蛋白浓度，并用ph 7.0、20mm磷酸钠缓冲液调整醛酮还原酶kmakr纯酶液和醛酮还原酶kdakr纯酶液的蛋白浓
度均为0.5g/l。
58.2、葡萄糖脱氢酶纯酶液
59.(1)工程菌：将genbank中源自巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium de bary)的葡萄糖脱氢酶bmgdh基因(核苷酸序列如seq id no.3所示)人工合成后，通过同源重组的方法连接至pet28b载体的多克隆位点，再将重组载体pet28b-bmgdh转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，获得表达重组质粒的重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28b-bmgdh。
60.(2)粗酶液：同醛酮还原酶粗酶液的方法制备。
61.(3)纯酶液：同醛酮还原酶纯酶液的方法制备，sds-page电泳图如图2，用ph 7.0、20mm磷酸钠缓冲液调整蛋白浓度为0.5g/l。
62.图2显示，没有其他明显的杂蛋白条带，表明两个酶都得到了有效纯化，对比标准蛋白marker分子量，分析醛酮还原酶的分子量为～36kda，葡萄糖脱氢酶的分子量为～29kda，可以进行后续固定化酶的实验。
63.实施例2:不同树脂类型对醛酮还原酶kmakr固定化的影响
64.1、不同树脂形态
65.为选择适合醛酮还原酶kmakr固定化的树脂载体，对六种不同类型的树脂进行了基本形态和物理化学性能的表征，具体如下：
66.树脂类型：环氧树脂(epoxy resin)lxte-600，氨基树脂(amino resin)lxte-700，氨基环氧树脂(amino-epoxy resin)lxte-706、羧基树脂(carboxyl resin)lxte-800、离子交换树脂(ion exchange resin)lxte-901和大孔树脂(macrosporous resin)lxte-1000。
67.使用带有数码相机的显微镜(evos m5000)监测树脂的球形度和形状，结果见图3所示，几种树脂的化学结构示意图如图4。
68.2、不同种类树脂对kmakr固定化评价
69.将表1中的6种树脂分别用磷酸钠缓冲液(0.2m，ph 7.0)洗涤三次。将0.5g清洗后的树脂加入5ml实施例1方法制备的kmakr纯酶液中(蛋白浓度为0.5g/l)，28℃，200rpm振荡18小时，用0.2m、ph 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤三次，即获得醛酮还原酶-树脂固定化复合物，记为kmakr@epoxy resin，kmakr@amino resin，kmakr@amino-epoxy resin，kmakr@carboxyl resin，kmakr@ion exchange resin，kmakr@macrosporous resin。此外，采用数码相机的显微镜(evos m5000)附带的软件检测树脂尺寸。
70.酶活单位(u)定义：在35℃、ph 7.0条件下，催化每分钟产生1μmol产物6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为1u。
71.酶活检测方法：反应体系10ml：200mm、ph7.0磷酸钠缓冲液、1.0mm nadp
+
、20g/l6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、30g/l葡萄糖(作为bmgdh催化实现nadph循环的底物)、5％(v/v)二甲基亚砜(dmso)，醛酮还原酶-树脂固定化复合物(0.5g)。在200rpm，40℃条件下振荡孵育20min，然后取出100μl反应混合液，向其中加入900μl无水乙醇以淬灭反应。将该混合液高速离心(12,000rpm,5min)后，取上清液用0.22μm滤膜过滤后，使用高效液相色谱(hplc)检测产物6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的生成量。根据酶活定义，计算游离酶和固定化酶的活力。
72.液相检测条件：色谱柱c18(4.6
×
250mm，acchrom,china)柱，流动相乙腈:水体积比为1:3，流速1.0ml/min，检测波长210nm，进样量10μl，柱温40℃。6-氰基-(5r)-羟
基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯保留时间分别为：13.6min，10.3min。根据底物和产物对应的标准曲线，可以计算6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的消耗和6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的生成量。
73.固定化率、酶活回收率、固定化酶活力的计算公式如下：
[0074][0075][0076][0077]
表1、不同树脂对醛酮还原酶kmakr的固定化效率影响
[0078][0079]
如表1显示，kmakr@macrosporous resin的固定化率达到了100％，但由于在洗脱过程中，酶分子很容易从树脂的大孔结构中泄漏，所以没有检测到酶活。kmakr@aminoepoxy resin和kmakr@epoxy resin分别只显示了15.6％和几乎检测不到的酶活回收率。kmakr@amino resin和kmakr@ionexchange resin的固定化率分别为45.1％和61.1％，而且两者的酶活回收率分别为34.3％和38.0％，也相对高于其他组。优选氨基树脂lxte-700和离子交换树脂lxte-901作为固定化载体。
[0080]
3、物理化学性能检测
[0081]
根据酶活回收率和固定化率比较(表1)，以及对合适填充的尺寸(＞300μm)的筛选，对优选的氨基树脂lxte-700和离子交换树脂lxte-901的比表面积用bet(brunauer-emmett-teller)方法进行测定，孔性能特征(孔隙体积、孔隙宽度、平均孔隙)用bjh(barret-joyner-halenda)方法检测，结果如表2所示，氨基树脂lxte-700和离子交换树脂lxte-901的平均孔径为25.11nm和112.22nm；孔体积分别为0.80和0.12cm3/g，研究结果表明合适的孔径和孔体积有利于促进底物对酶的活性部位的可及性。
[0082]
表2氨基和离子交换树脂的表面积和孔性能表征(基于bet和bjh方法检测)
[0083][0084]
因此，综合考虑酶活回收率、树脂材料的直径和孔径大小，我们选择了氨基树脂lxte-700进行后续的批次使用实验研究。
[0085]
实施例3：不同来源醛酮还原酶对于固定化酶酶活的影响
[0086]
(1)将0.5g氨基树脂lxte-700加入5ml含体积浓度0.5％的戊二醛的磷酸钠缓冲液
(0.2m，ph 7.0)中，37℃搅拌1h对氨基树脂进行活化，然后用0.2m，ph 7.0磷酸钠缓冲液冲洗树脂去掉未反应的戊二醛，获得戊二醛修饰的氨基树脂(amino resin-gla)。
[0087]
(2)将全部步骤(1)戊二醛修饰的氨基树脂添加到10ml体积浓度6％(v/v)的聚丙烯酰胺(pei)水溶液中，在28℃、200rpm下孵育过夜，并用0.2m、ph 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，加入实施例1方法制备的5ml醛酮还原酶kmakr纯酶液纯酶液(蛋白浓度0.5g/l)，在28℃、200rpm下孵育12小时，获得醛酮还原酶kmakr固定化酶0.5g，记为kmakr@aminoresin-pei。
[0088]
同上，将醛酮还原酶kmakr纯酶液替换为同样方法制备的醛酮还原酶kdakr纯酶液(蛋白浓度0.5g/l)，获得固定化酶kdakr@aminoresin-pei。
[0089]
采用实施例2方法检测酶活，结果见图5，表明kmakr@amino resin-pei和kdakr@amino resin-pei固定化酶活力分别为13.6、3.9u/g。kmakr@aminoresin-pei的固定化酶活力是kdakr@aminoresin-pei的近2.5倍，因此选择醛酮还原酶kmakr纯酶液用于后续实验。
[0090]
实施例4：醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固化酶的制备
[0091]
戊二醛(gla)和聚乙烯亚胺(pei)功能化的氨基树脂用于葡萄糖脱氢酶和醛酮还原酶的共固定化研究。
[0092]
(1)戊二醛修饰氨基树脂
[0093]
将0.5g氨基树脂lxte-700(amino resin c6)加入5ml含体积浓度0.5％的戊二醛的磷酸钠缓冲液(0.2m，ph 7.0)中，37℃搅拌1h对氨基树脂进行活化，然后用0.2m，ph 7.0磷酸钠缓冲液冲洗树脂去掉未反应的戊二醛，获得戊二醛修饰的氨基树脂(amino resin-gla)。
[0094]
(2)葡萄糖脱氢酶的固定化
[0095]
将全部步骤(1)戊二醛修饰的氨基树脂中加入到实施例1方法制备的5ml葡萄糖脱氢酶bmgdh纯酶液(蛋白浓度0.5g/l)中，28℃、200rpm孵育3小时。用0.2m、ph 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤三次后，获得葡萄糖脱氢酶酶-树脂固定化复合物，记为bmgdh@aminoresin-gla。
[0096]
(3)pei修饰
[0097]
将全部步骤(2)葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合物添加到10ml体积浓度6％(v/v)的pei水溶液中，28℃、200rpm孵育过夜，并用0.2m、ph 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，从而实现对氨基树脂表面进行pei修饰，使得树脂表面局部形成了带正电的微环境，获得pei修饰树脂。同样条件下，将葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合物替换为amino resin c6，制备得到amino resin-pei。
[0098]
(4)醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶
[0099]
将步骤(3)全部pei修饰树脂加入到实施例1制备的5ml的醛酮还原酶kmakr纯酶液(蛋白浓度0.5g/l)，在28℃、200rpm下孵育18小时，通过pei和醛酮还原酶酶分子静电吸附作用，有效固定醛酮还原酶，用0.2m、ph 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤3次，最终获得0.5g醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶，记为kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei。
[0100]
(5)酶活检测
[0101]
采用实施例2方法检测酶活，反应混合物(10ml)由ph 7.0、200mm磷酸钠缓冲液、1.0mm nadp
+
、20g/l(5r)-1、30g/l葡萄糖、5％(v/v)二甲基亚砜(dmso)和适量的游离酶(实
施例1方法制备的纯酶液，以蛋白含量计为1.2mg kmakr和0.4mgbmgdh)或0.5g共固定化酶组成。将反应混合物以35℃，200rpm振荡孵育20分钟，然后取出100μl反应混合物，向其中加入900μl无水乙醇以猝灭反应。将混合物以12000rpm离心5分钟，随后用0.22μm膜过滤上清液，并通过高效液相色谱法检测产物6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯生成量。游离/固定化kmakr酶活性的一个单位被定义为催化每分钟产生1μmol产物6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯所需的游离/固定酶的量。结果显示：游离kmakr酶活是23u/mg，0.5g/l bmgdh操作浓度下，固定化酶bmgdh@amino resin-gla酶活是31u/g，0.5g/lkmakr操作浓度下，kmakr&bmgdh@amino resin(c6)-pei酶活是19u/g。
[0102]
实施例5：树脂表面修饰的戊二醛和聚乙烯亚胺比例对固定化酶的影响
[0103]
1、戊二醛和聚乙烯亚胺(pei)浓度对共固定化酶酶活回收率及固定化率的影响
[0104]
通过调节戊二醛和聚乙烯亚胺的比例，分析在不同戊二醛(gla)和聚乙烯亚胺(pei)浓度下醛酮还原酶的固定化率和酶活回收率，筛选最佳的修饰比例，如图6所示，横坐标中0.5-0代表将实施例4步骤(3)省略，即不添加pei；1-0代表将实施例4步骤(1)中戊二醛体积浓度改为1％，同时步骤(3)省略；2-0代表将实施例4步骤(1)中戊二醛体积浓度改为2％，同时步骤(3)省略；0-0代表将实施例4步骤(1)中戊二醛体积浓度改为0％，同时步骤(3)省略；依次类推，横坐标分别代表实施例4步骤(1)中戊二醛浓度和步骤(3)中pei浓度。其他操作同实施例4。
[0105]
如图6示，当pei体积浓度为0％时，通过戊二醛共价固定的醛酮还原酶(席夫碱反应)，固定化率接近100％，但是该固定化方法下的酶回活收率很低，这表明戊二醛交联极容易导致醛酮还原酶失活。因此，通过引入强阳离子聚合物pei上的氨基与戊二醛上的醛基反应，pei功能化的氨基树脂总体呈电正性，通过醛酮还原酶(电负性)与载体之间的静电吸附(pei和酶在不同ph下的zeta电位见表3)，在树脂表面实现了醛酮还原酶的有效固定。通过适当调节戊二醛和聚乙烯亚胺的添加浓度发现，当gla和pei浓度分别为0.5％和6％时，kmakr@amino resin-pei酶活回收率最高为39.7％(图6)。进一步增加聚乙烯亚胺浓度(＞6％)并不能提高固定化醛酮还原酶的酶活回收率，因此6％为最佳pei浓度。
[0106]
2、不同ph下的酶和聚乙烯亚胺的zeta电位
[0107]
将游离的醛酮还原酶(实施例1方法制备的kmakr，0.5g/l)和葡萄糖脱氢酶(实施例1方法制备的bmgdh，0.5g/l)以及pei的水溶液(6％,v/v)，分别置于柠檬酸-na2hpo4缓冲液(ph 4-6,200mm)、磷酸钠缓冲液(ph6-8,200mm)，tris-hcl(ph 8-10，200mm)中，室温静置两分钟，使用zetasizer nano zs仪器(malvern，he-ne激光，λ＝632nm)测量pei和酶的zeta电位。在2分钟的平衡时间后，在25℃下进行测量，测量三次，结果见表3所示。
[0108]
表3不同ph下的酶和聚乙烯亚胺的zeta电位
[0109][0110]
实施例6：氨基树脂表面碳链长度对双酶固定化效率的影响
[0111]
将实施例4步骤(1)中氨基树脂lxte-700(amino resin c6)分别替换为表4中不同型号的氨基树脂，其他操作相同，如表4，kmakr&bmgdh@amino resin-pei(c6)固定化率高于两个碳连接的氨基树脂kmakr&bmgdh@amino resin(c2-1,c2-2,c2-3)。同时，kmakr&bmgdh@amino resin(c6)的酶活回收(39.7％)也明显高于kmakr&bmgdh@amino resin(c2)(均不到20％)组的。
[0112]
氨基树脂(amino resin(c6),lxte-700)，相比其他几种氨基树脂(amino resin(c2)lxte-703、lxte-704、lxte-705)也具有作为填充材料更适合的尺寸(＞300μm)，lxte-703,lxte-704,lxte-705的尺寸均小于300μm(表4)。
[0113]
因此kmakr&bmgdh@amino resin(c6)-pei是最佳的双酶-树脂固定化复合物，可以选择作为连续流反应器良好的填充介质。
[0114]
表4不同碳链长度的氨基树脂对双酶固定化的效率影响
[0115][0116]
实施例7:酶浓度优化
[0117]
1、葡萄糖脱氢酶浓度
[0118]
在固定化过程中，通过调节加入至戊二醛修饰的氨基树脂(resin-gla)中葡萄糖脱氢酶的操作浓度(体积均为5ml)，探究酶不同操作浓度下的固定化活力。
[0119]
将实施例4步骤(2)葡萄糖脱氢酶bmgdh纯酶液的蛋白浓度分别调整为0、0.1、0.25、0.5、1、2g/l，体积均为5ml，制备得到bmgdh@aminoresin-gla，酶活力见图7所示，如图7所示，当葡萄糖脱氢酶浓度为0.25g/l时，最高固定化酶的活力为34u/g，更高的葡萄糖脱氢酶浓度并没有提升固定化酶的活力，是因为在0.25g/l操作浓度下，固定化葡萄糖脱氢酶已足够催化反应所需的辅因子再生。
[0120]
2、醛酮还原酶浓度
[0121]
将实施例4步骤(4)醛酮还原酶kmakr纯酶液的蛋白浓度分别调整为0、0.25、0.5、2、4、5g/l，体积均为5ml，其他操作同实施例4，分别得到kmakr&bmgdh@amino resin(c6)-pei，酶活力见图8所示，醛酮还原酶的固定化活力随着操作浓度的增加而提高，浓度大于4g/l后，固定化酶的活力并没有显著提高，这主要是因为醛酮还原酶在树脂上的负载量达到了饱和，因此当最佳操作浓度为4g/l，最高的共固定化酶的活力达到73u/g。
[0122]
实施例8：树脂和共固定化酶的红外和热重表征
[0123]
将amino resin(c6)与实施例4方法制备的bmgdh@aminoresin(c6)-gla和kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei，以及amino resin(c6)-pei分别采用傅里叶变换红外光谱(ftir)(nicolet 6700ftir-atr分析仪，thermo fisher scientific，usa)和热重分析(tga)(tga q5000，ta instruments，usa)表征。以1cm-1
波数的分辨率记录了400至4000cm-1
的ftir光谱。样品的tga检测在氮气流下进行，温度范围为30-800℃，频率为10℃/min。
[0124]
图9红外光谱(ftir)图显示，共固定化酶存在明显的酰胺ⅱ带，而单纯的树脂本身和pei功能化的树脂并没有酰胺ⅱ带，因此可以判断酶可以有效固定化于树脂表面，形成了葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合物(bmgdh@aminoresin-gla)和双酶-树脂共固化复合物(kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei)。
[0125]
图10，tga图显示，600℃以后酶-树脂固定化复合物质量百分比低于单纯的树脂本身，这主要是因为酶占据了固定化复合物的一定比例。红外及热重图谱都表明了，通过戊二醛交联，葡萄糖脱氢酶可以首先共价固定于氨基树脂上，醛酮还原酶可以通过静电吸附于pei功能化的氨基树脂表面，实现了双酶共固化于同一树脂载体。
[0126]
实施例9：游离/固定化酶ph优化
[0127]
将游离酶(实施例1方法制备的蛋白浓度0.25g/l的葡萄糖脱氢酶bmgdh纯酶液5ml，蛋白浓度4g/l的醛酮还原酶kmakr纯酶液5ml)、实施例4方法制备的kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei，采用实施例2酶活检测方法，在不同ph条件(柠檬酸-na2hpo4缓冲液(ph 4-6)、磷酸钠缓冲液(ph 6-8)，tris-hcl(ph 8-10)，离子浓度均为200mm)下检测活力，以对应的最适ph下的活力为100％，计算并归一化其他ph下的相对活力，如图11示。游离酶在ph 6
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8范围内表现出较高活性，最适ph条件为200mm,ph 7磷酸钠缓冲液。对于共固定化酶，在ph 5-7范围内表现出较高活性(相对活力大于80％)，最适反应ph条件为200mm,ph 6磷酸钠缓冲液，与游离酶相比，固定化酶的最适ph偏低，阳离子聚合物pei改变了共固定化酶催化的局部微环境，导致最适ph略向酸性偏移。因此我们将磷酸钠缓冲液(200mm，ph 6)，作为连续流反应器的最佳反应条件。
[0128]
实施例10、游离/固定化酶温度优化
[0129]
将游离酶(实施例1方法制备的蛋白浓度0.25g/l的葡萄糖脱氢酶bmgdh纯酶液5ml，蛋白浓度4g/l的醛酮还原酶kmakr纯酶液5ml)、按实施例4方法制备kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei，采用实施例2酶活检测方法，在反应温度25-65℃范围内进行测定，游离/固定化酶的相对活性是通过与它们的最高水平活性相比较来评估的，以对应的最适温度下的活力为100％，计算并归一化得到其他温度下的相对活力。结果如图12示，游离酶和共固定化酶均在35-45℃的范围内，表现了较高的相对活力(大于80％)，这表明共固定化酶并没有明显改变酶自身催化的温度范围，设计的固定化方法能有效的保留该温度范围内的催化活性，对酶的空间构象改变较少。对比最适温度，游离酶的最适反应温度为35℃，共固定化酶的最适反应温度为40℃，固定化酶的最适温度增加了5℃，推测是因为表面功能化的树脂载体对酶的保护作用和pei良好的粘性对醛酮还原酶具有稳定的作用，使其在更高的温度下表现了更可观的活性。因此，将40℃作为构建的连续流反应器的最佳反应温度。
[0130]
实施例11、共固定化酶的批次使用
[0131]
将实施例4方法制备的kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei，以及实施例2方法制得的kmakr@amino resin(c6)、kmakr@ion exchange resin，采用实施例2方法检测酶活，反应结束后，离心(12,000rpm,5min)，沉淀用200mm,ph 7的磷酸钠缓冲液冲洗3遍，作为催化剂进行下一轮反应。
[0132]
在每个循环中，酶-树脂固定化复合物对应的活性被归一化为它们在第一个循环中的相对活力。结果如图13示，经过pei修饰的葡萄糖脱氢酶-醛酮还原酶双酶-树脂共固定化酶(kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei)相比不修饰的氨基树脂和离子交换树脂固定的
醛酮还原酶(kmakr@aminoresin，kmakr@ionexchangeresin)，具有更好的重复批次使用稳定性，在重复使用10次后，其相对活力仍有80.7％。该结果显示，将kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei的共固定化酶作为填充材料，构建连续流反应器是可行且有效的。
[0133]
综上所述，我们通过在氨基树脂表面使用戊二醛交联葡萄糖脱氢酶，pei功能化的葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合体，进一步吸附醛酮还原酶，成功实现了同载体、异方法共固化双酶，制备得到的醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶(kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei)，作为填充介质，构建双酶介导的连续流反应器，应用于后续的生物法不对称合成6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯的实验。
[0134]
实施例12、连续流反应器的构建
[0135]
1、参照图14，将实施例4方法制备的共固定化酶kmakr&bmgdh@amino(c6)-pei作为填充材料，构建双酶介导的连续流反应器，所述连续流反应器包括反应液储罐、流量泵、填充式反应柱、液体收集罐，所述填充式反应柱设有进液口和出液口。所述反应液储罐通过流量泵与填充式反应柱进液口连接；所述填充式反应柱出液口分别与液体收集罐和反应稀释液连通，其中反应稀释液体与高效液相色谱仪连通，液体收集罐与反应液储罐连通构成循环。
[0136]
2、将3.7g的共固定化酶装载到6ml容积的填充式反应柱中，直至填充式反应柱都被装满，并将柱温保持在40℃。使用注射泵(slp01-02a，兰格，中国)将含有底物6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(5r)-1(终浓度20g/l)、nadp
+
(终浓度1mm)和葡萄糖(终浓度30g/l)的ph 6.0、200mm的磷酸盐缓冲液，在不同的注射泵设置的流速下(0.25、0.5、1、2、5、7、10ml/h)，连续流加到填充柱中，从填充式反应柱出液口定期取出反应混合液，通过hplc监测转化率和de
p
(产物的非对映体过量)。收集的反应液在不再次添加辅因子，作为进料混合液循环泵入填充柱，以验证闭环系统的可行性，为工业上实现自闭合、无废循环的技术革新进行了实验证明。结果见图15所示。
[0137]
3、考察了关键工艺参数，包括柱体积(1.5，3.5和6ml)和流速(0.25-10.0ml/h)，并检测相应工艺参数下的转化率，时空产率和操作稳定性。同样条件下，分别将0.8g的共固定化酶装载到1.5ml的填充式反应柱，2.0g的共固定化酶装载到3.5ml的填充式反应柱，其他操作相同，结果见表5。
[0138]
图15和表5，显示了连续流反应最佳的柱体积为6ml，流速为5ml/h，当转化率＞99％，时空产率高达374.7g/l/d。将未反应完的混合液二次循环泵入，检测发现第二次反应的转化率明显高于第一次反应(图15)，这为更高浓度的底物在高流速下实现完全转化，提供可能性，提高了生产效率。
[0139]
因此本发明设计的对传统树脂材料进一步表面修饰，结合化学和物理的方法实现了葡萄糖脱氢酶和醛酮还原酶的共固化，为氧化还原类酶的固定化及应用提供了方法创新和参考，构建的循环式双酶介导的连续流反应器，为工业上利用多酶偶联催化实现辅酶循环、无废、绿色、连续、自动化合成医药中间体的技术革新提供了实验基础，且具备更高效生产医药中间体、工艺放大的潜力。
[0140]
表5不同柱体积和流速下的时空产率及转化率
[0141][0142]
实施例13：酶-树脂固定化复合物的电镜表征
[0143]
釜式反应模式：将含有1.5g醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶(kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei)、底物6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(5r)-1(终浓度20g/l)、nadp
+
(终浓度1mm)和葡萄糖(终浓度30g/l)的ph 6.0、200mm的磷酸盐缓冲液，总体积10ml，投料到釜式反应器中，200rpm，40℃，反应4h。
[0144]
通过扫描电子显微镜(sem)(s-4700(ⅱ)，日立，日本)观察将实施例12步骤2流速5ml/h下反应90h后的以及釜式反应模式反应4h的的醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶(kmakr&bmgdh@aminoresin(c6)-pei)的显微形态。使用在15kv的加速电压下操作的检测器拍摄sem图像。共固定化酶在釜式和连续流反应器中的形态表征如图16，在釜式模式下仅使用4小时后，共固定化酶表面出现明显的损坏和凹坑(图16)，这主要是由固体物质之间(树脂载体和反应器)的碰撞造成的。相反，共固定化酶在构建的连续流反应器连续流动反应长达90小时没有出现损坏现象，保留了共固定化酶的球形度、完整性和表面光滑程度，表明流体与固体载体之间的接触不易导致微球的磨损，有利于共固定化酶在连续流反应中的长期使用。因此，我们设计的双酶介导的连续流生物反应器，能够为生物催化、医药合成等领域提出新的思路和技术支持。
[0145]
上述仅为本发明的较佳实施例，并非限定发明的范围，本发明的上述实施例可做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。

技术特征：
1.一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述共固定化酶以氨基树脂为载体，以戊二醛为交联剂，以聚乙烯亚胺为修饰聚合物，以醛酮还原酶纯酶液和葡萄糖脱氢酶纯酶液为活性组分，于0.2m，ph 7.0的磷酸钠缓冲溶液中，在28℃、200rpm条件下搅拌孵育18h，离心，收集沉淀，获得醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。2.如权利要求1所述醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述氨基树脂包括氨基树脂lxte-700，氨基树脂lxte-703，氨基树脂lxte-704，氨基树脂lxte-705。3.如权利要求1所述醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述戊二醛以体积浓度0.5-2％戊二醛的0.2m，ph 7.0磷酸钠缓冲液的形式加入，所述戊二醛的磷酸钠缓冲液体积加入量以载体质量计为5-15ml/g；所述聚乙烯亚胺以体积浓度2-6％聚乙烯亚胺水溶液的形式加入，所述聚乙烯亚胺水溶液体积加入量以载体质量计为10-30ml/g；所述醛酮还原酶纯酶液以蛋白含量计与载体质量比为0.0025-0.05:1；所述葡萄糖脱氢酶纯酶液以蛋白含量计与载体质量比为0.001-0.02:1。4.如权利要求1所述醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述醛酮还原酶纯酶液和葡萄糖脱氢酶纯酶液按如下方法制备：(1)工程菌：将源自马克斯克鲁维酵母的醛酮还原酶kmakr基因人工合成后，连接至pet28a载体的多克隆位点，再将重组载体pet28a转化至大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，获得表达醛酮还原酶kmakr重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28a-kmakr；所述醛酮还原酶kmakr基因核苷酸序列如seq id no.1所示；(2)粗酶液：将步骤(1)重组大肠杆菌接种至lb固体培养基，37℃培养12h，获得活化菌体；将活化菌体接种至lb液体培养基，37℃、200rpm培养12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至含终浓度50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃、200rpm培养2h至od值0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.15mm异丙基硫代半乳糖苷，28℃，200rpm培养12h后，4℃、8000rpm下离心10min，获得相应的湿菌体细胞；按照每1g湿菌体悬浮于20ml的ph 7、20mm磷酸钠缓冲液中制备菌悬液，在功率300w、破碎1s、暂停3s的条件下超声破碎30min，12000rpm、4℃离心10min，收集上清，0.45μm微膜过滤，滤液即为醛酮还原酶粗酶液；(3)纯酶液：镍柱用a液平衡后，上样步骤(2)粗酶液，上样量1-2个柱体积，然后用a液冲洗3-4个柱体积，去除杂质和结合较弱的蛋白；再用b液洗脱目的蛋白并收集后置于冰上保存，再用50mm ph 7.0磷酸钠缓冲液4℃透析12h，收集截留液，即为醛酮还原酶纯酶液；所述a液为含300mm nacl和20mm咪唑的ph 7.0，20mm磷酸钠缓冲液；所述b液为含300mm nacl，500mm咪唑的ph 7.0、20mm磷酸钠缓冲液；所述葡萄糖脱氢酶纯酶液制备步骤和醛酮还原酶纯酶液的步骤相同，葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。5.如权利要求1所述醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶，其特征在于，所述共固定化酶按以下方法制备获得：(1)戊二醛修饰氨基树脂将氨基树脂加入含体积浓度0.5-2％的戊二醛的0.2m，ph 7.0磷酸钠缓冲液中，37℃搅拌1h对氨基树脂进行活化，然后用0.2m，ph 7.0磷酸钠缓冲液冲洗树脂去掉未反应的戊二醛，获得戊二醛修饰的氨基树脂；(2)葡萄糖脱氢酶的固定化
将葡萄糖脱氢酶纯酶液添加到步骤(1)戊二醛修饰的氨基树脂中，在28℃、200rpm下孵育3小时，用0.2m、ph 7.0的磷酸钠缓冲液洗涤后，获得葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合物；(3)pei修饰将步骤(2)葡萄糖脱氢酶-树脂固定化复合物添加到体积浓度2～6％的聚乙烯亚胺水溶液中，在28℃、200rpm下孵育过夜，并用0.2m、ph7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，获得聚乙烯亚胺修饰树脂；(4)醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶将醛酮还原酶纯酶液加入步骤(3)聚乙烯亚胺修饰树脂，在28℃、200rpm下孵育18小时，用0.2m、ph7.0的磷酸钠缓冲液洗涤，获得醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶。6.一种权利要求1所述醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶在不对称还原6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的方法按如下步骤进行：以醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶为催化剂，以6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，添加nadph，ph 4-10的缓冲液为反应介质，在25-65℃下反应反应结束，反应液分离纯化，获得6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述底物添加终浓度10-100g/l；所述葡萄糖添加终浓度10-100g/l；所述催化剂用量以缓冲液体积计为50-200g/l；所述nadph添加终浓度为1-3mm。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应在连续流反应器中进行，所述连续流反应器包括反应液储罐、流量泵、填充式反应柱、液体收集罐，所述填充式反应柱设有进液口和出液口；所述反应液储罐通过流量泵与填充式反应柱进液口连接；所述填充式反应柱出液口分别与液体收集罐和反应稀释液连通，其中反应稀释液与高效液相色谱仪连通，液体收集罐与反应液储罐连通构成循环；将醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶装载到填充式反应柱中，直至填充式反应柱装满，将柱温保持在25-65℃；使用注射泵将含有底物6-氰基-(5r)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、nadp
+
和葡萄糖的ph 4-10的缓冲液，在0.25-10ml/h流速下，连续流加到填充式反应柱中，反应完全后，反应液分离纯化，获得6-氰基-(3r,5r)-二羟基己酸叔丁酯。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述填充式反应柱温度保持在40℃、缓冲液为ph 6.0、200mm的磷酸盐缓冲液，流速为5ml/h。

技术总结
本发明公开了一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共固定化酶及在他汀类药物手性中间体连续流合成中的应用，所述共固定化酶以氨基树脂为载体，以戊二醛为交联剂，以聚乙烯亚胺为修饰聚合物，以醛酮还原酶纯酶液和葡萄糖脱氢酶纯酶液为活性组分，于0.2M，pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液中，在28℃、200rpm条件下搅拌孵育18h，离心，收集沉淀；本发明实现了辅酶循环，0.25-5mL/h流速下完全转化底物，7mL/h及以上流速下未反应的底物二次循环实现更高的转化率，5mL/h的流速下运行90小时的催化反应后保留了95％以上的转化率、实现了产物的连续稳定合成。实现了产物的连续稳定合成。


技术研发人员：王亚军 张文 李树芳 邵紫晴 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/8/13