miR10a-5p作为评估衰老的标志物的应用以及在制备抗衰老药物中的应用

mir10a-5p作为评估衰老的标志物的应用以及在制备抗衰老药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，特别涉及mir10a-5p作为评估衰老的标志物的应用以及在制备减缓衰老和/或抗神经退行性药物中的应用。


背景技术：

2.人类老龄化已经成为全球面临的巨大挑战,并给世界各国带来高昂的财政负担。随着环境的改善、生活方式的改变及医疗技术的进步，过去几十年中人类平均预期寿命已有大幅度提高，然而随着寿命的增加，年龄相关疾病如心脑血管疾病、癌症和神经退行性疾病等的发病率仍呈上升趋势。衰老是诸多疾病的诱发因素，因此如何及早地干预组织器官的衰老，延缓由衰老带来的生理性改变如细胞衰老，才能够延缓老年综合症，同时达到延长人类寿命和生存质量，这也是目前当今老年医学面临的最直接的挑战。
3.现有的抗衰老策略主要包括抑制gh/igf-1轴、tor-s6k通路、炎症通路，蛋白质限制或间歇禁食性饮食，调节特定sirtuin蛋白，以及长期使用二甲双胍。这些方法主要试图延长寿命，或只针对机体特定系统(如代谢系统或免疫系统)的分子通路进行干预，而使在延缓衰老相关的并发症上效果不是很好，如二甲双胍可以显著延长寿命的发生，但长期使用会导致肝肾损伤、胃肠道反应等。
4.micrornas是一类短链的非编码rna，一般会通过与靶向mrna的3'非翻译区(utr)结合来抑制基因表达或影响mrna的稳定性和翻译参与多细胞生物中基因表达的转录后调节。其中，mir10a-5p的序列为uacccuguagauccgaauuugug(5’至3’端)，具有高度的保守性，由人类17号染色体的非编码区编码(编码位置为48579838-48579947)，而在小鼠中由11号染色体的非编码区编码(编码位置为96317165-96317274)。
5.mir10a-5p广泛分布于小鼠及人体的血液和各个器官(包括脑、脾脏等)，有研究表明mir10a-5p参与免疫调控、肿瘤迁移、组织修复等重要细胞生理过程，其表达量的改变与自身免疫性疾病、肿瘤、ⅰ型糖尿病等疾病的发生有密切关系，而在神经系统中，mir10a-5p的表达水平可能与阿尔茨海默症(ad)等神经退行性疾病的发生呈负相关关系。但mir10a-5p在机体衰老中的作用尚未有相关报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的技术问题，本发明提供一种mir10a-5p的新用途。为实现上述目的，本发明的技术方案为：
7.本发明一方面涉及一种用于评估衰老的标志物，所述标志物包括mir10a-5p。
8.本发明另一方面涉及mir10a-5p的定量检测试剂盒在制备评估衰老的检测试剂中的应用。
9.本发明还涉及mir10a-5p抑制剂在制备减缓衰老和/或抗神经退行性药物中的应用。
10.在本发明的一个优选实施方式中，所述mir10a-5p抑制剂包括能够抑制mir10-5p成熟或活性的小分子药物，优选的，所述小分子药物是针对mir10a-5p设计的rna片段，其序列为5’cacaaauucggaucuacagggua 3’。
11.在本发明的一个优选实施方式中，所述模型动物是老鼠或灵长类动物。
12.对于本领域的技术人员来说，mir10a-5p在机体衰老中的作用是本技术的发明人首次发现的，特别是其可以作为评估衰老程度的应用是本技术的发明人首次发现的，本发明对于评估衰老以及开发抗衰老的药物具有显著的意义。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1：小鼠不同年龄段，器官内mir10-5p表达量的变化
15.micrornas测序结果中，年轻(2月龄)和中年(9月龄)小鼠脾脏中mir10a-5p的表达情况；(b)年轻(2-4月龄)和中年(6-9月龄)小鼠脾脏中mir10-5p表达水平的统计图；(c)年轻(2月龄)和中年(6-8月龄)小鼠脑组织中mir10a-5p表达水平的统计图。
16.图2：人的不同年龄段，血液中mir10a-5p表达量的变化
17.年轻(样本年龄范围为18-25岁，实际样本平均年龄：23.16
±
1.70)和中年(样本年龄范围为35-60岁，实际样本平均年龄：41.09
±
4.56)人群的样本中mir10a-5p表达水平的统计图。
18.图3：抑制mir10a-5p表达能逆转细胞衰老
19.在脑内给予对照试剂和mir10a-5p的抑制剂后，脑内β-半乳糖苷酶标记出的衰老细胞数目的情况，左图为示例图，右图为衰老细胞比例的统计图。
具体实施方式
20.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
21.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
22.实施例1:
23.(1)采用大数据分析的方式对microrna基因组表达谱(microrna-seq)进行分析。分别提取2月龄和9月龄的正常c57小鼠脾脏的rna,然后进行mirnaseq测序分析发现mir10a-5p的表达量在9月龄小鼠中增加，图1(a)显示mir10a-5p的测序结果。进一步，取年轻(2-4月龄)和中年(6-9月龄)小鼠脾脏，加入适量的trizol裂解组织，而后加入氯仿进行萃取，离心后取水相，加入等体积的异丙醇置于-80℃过夜；第二天离心弃去上清，清洗沉淀晾干后得到rna。利用反转录试剂盒合成cdna,再通过加尾法检测脾脏组织、脑组织中mir10a-5p的表达量，图1(b-c)的结果分别显示脾脏、脑中mir10a-5p的表达量随年龄的增
加而增加。
24.(2)检测随年龄增长，人的血液中mir10a-5p表达量的变化。以人为观察对象，分别取18-25岁，35-60岁健康人群(无基础疾病，心理健康，能够适应工作需要)，对mir10a-5p表达量进行检测。具体而言，在全血中加入trizol，4℃裂解半小时后，加入氯仿进行萃取，离心后取上层水相。向水相中加入等体积的异丙醇，置于-80℃过夜；第二天离心弃去上清，利用70％乙醇清洗沉淀后晾干，加入depc水，利用nanodrop检测rna浓度。随后，利用反转录试剂盒合成cdna,再通过加尾法检测不同年龄人的血液中mir10a-5p的表达量。结果显示，人的血液样本中mir10a-5p的表达量在35-60岁的人群中显著增加。图2显示mir10a-5p在人的血液中变化情况。
25.(3)为确定mir10a-5p调控机体衰老的关系，在10月龄的c57小鼠(每组6只)中，分别给予mir10a-5p的抑制剂(microff
tm
mirna antagomir,其序列为5’cacaaauucggaucuacagggua 3’)和对照药物(microff antagomir nc#22,其序列为5’caguacuuuuguguaguacaaa 3’)，持续给药七天后灌注小鼠，取小鼠的脑组织，切片，取有皮层脑区的脑片，利用细胞衰老检测的金指标β-半乳糖苷酶染色，利用共聚焦显微镜拍摄获得免疫荧光图片，分析统计皮层脑区对照组和抑制剂组大脑中细胞衰老的情况。实验结果显示，与对照组相比，给予抑制剂组的皮层中累积的衰老细胞数目的比例明显减少，参见图3a。同时，检测了脑内mir10a-5p的表达水平，发现得到了明显的抑制，参见图3b。
26.以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，在没有做出创造性劳动前提下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种用于评估衰老的标志物，所述标志物包括mir10a-5p。2.mir10a-5p的定量检测试剂盒在制备评估衰老的检测试剂中的应用。3.mir10a-5p抑制剂在制备减缓衰老药物中的应用，所述mir10a-5p抑制剂包括具有抑制mir10a-5p成熟/活性的小分子药物。4.根据权利要求3所述的应用，所述动物是老鼠或灵长类动物。5.根据权利要求3所述的应用，所述小分子药物是针对mir10a-5p设计的rna片段，其序列为5’cacaaauucggaucuacagggua 3’。

技术总结
本发明公开了miR10a-5p作为评估衰老的标志物的应用以及在制备抗衰老药物中的应用。对于本领域的技术人员来说，miR10a-5p在机体衰老中的作用是本申请的发明人首次发现的，特别是其可以作为评估衰老程度的应用是本申请的发明人首次发现的，本发明对于开发抗衰老的药物具有显著的意义。物具有显著的意义。


技术研发人员：权利要求书1页说明书3页序列表（电子公布）附图2页
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.04.14
技术公布日：2023/8/14