基于FAP启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法

4381)，近期在nature(aghajanian et al.nature,2019,573(7774):430-433)及science(rurik et al.science,2022,375:91-96)等期刊文章阐述以fap作为靶点的心肌纤维化靶向治疗，效果显著，具有非常好的治疗潜能。
5.综上所述，fap是纤维化相关病理变化重要的标志基因。本发明基于fap在纤维化组织特异性表达这一特点，构建fap启动子调控的fluc报告基因表达的抗心肌纤维化药物筛选方法，同时采用sv40启动子控制的rluc报告基因作为内参，进一步优化了筛选数据的可靠性，可操作用。而目前已有抗心肌纤维化药物筛选方法是基于特异性心肌纤维化病理基因模块以及构建具有转录组学数据的药物数据集，然后根据基因表达推演法预测对应药物的抗心肌纤维化能力，该过程操作繁琐，工作量大，分析过程复杂，效率低。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供基于fap启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法，以解决上述技术背景中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
8.第一方面的，本发明提供了一种基于fap启动子的表达载体，该表达载体，包含sv40启动子控制的海参荧光素酶(renilla luciferase,rluc)基因表达框，以及fap启动子控制的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)基因表达框。
9.所述表达载体中sv40启动子控制rluc报告基因的表达，其中sv40启动子核酸序列如seq id no:1所示，rluc报告基因核酸序列如seq id no:2所示；
10.所述表达载体中fap启动子控制fluc报告基因的表达，其中fap启动子核酸序列如seq id no:3所示，fluc基因核酸序列如seq id no:4所示；
11.上述技术方案中，所述表达载体的构建方法为：
12.(1)先通过pcr方法将质粒psicheck2上的synthetic poly(a)与fap启动子拼接形成synthetic poly(a)-fap promoter融合片段，5’端为not i限制性内切酶识别位点，3’端为apa i限制性内切酶识别位点；
13.(2)将载体psicheck2通过not i/apa i双酶切线性化之后，琼脂糖凝胶电泳回收大片段，在t4 dna连接酶作用下与步骤(1)所得的synthetic poly(a)-fap promoter融合片段片段链接，转化dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆并测序鉴定，即获得表达载体psicheck2-fap-promoter-fluc。
14.上述技术方案中，所述表达载体以sv40启动子控制下rluc作为内参报告基因，fap启动子控制下fluc作为报告基因，用于评价药物对fap活性的影响。
15.上述技术方案中，所述表达载体通过转染细胞获得基因工程细胞株；
16.或者所述表达载体亚克隆至慢病毒载体获得双荧光素酶表达慢病毒颗粒lenti_sv40p-rluc-fapp-fluc，或所述表达框亚克隆至腺病毒颗粒ad_sv40p-rluc-fapp-fluc通过感染细胞获得基因工程细胞株。
17.第二方面的，本发明提供了基于fap启动子的表达载体的心肌纤维化药物筛选方法，包括以下步骤：
18.(1)以psicheck2为基础骨架，将psicheck2中的hsv tk启动子替换为fap启动子而获得表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc；
19.(2)将以上表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc转染mcfs细胞建立心肌纤维化药物筛选细胞模型；
20.(3)模型中采用sv40启动子控制rluc基因作为内参报告基因，以fap启动子控制fluc基因作为药物活性评价报告基因，通过计算fluc活性与rluc活性比值初步评价药物抑制fap启动子活性的效果，以此简介评价药物可能抗心肌纤维化的作用。
21.上述技术方案中，步骤(2)中所采用转染的细胞为原代小鼠心肌成纤维细胞或atcc来源人心肌成纤维细胞细胞。
22.上述技术方案中，所述筛选方法是以fap启动子活性调控为核心的药物筛选方法。
23.上述技术方案中，该细胞模型的建立方法替换成通过包装含所述sv40启动子控制rluc基因表达框和fap启动子控制rluc基因表达框的腺病毒或慢病毒感染的方式建立。其中，所述包装含所述表达载体的慢病毒是基于但不限于plenti-egfp/pspax2/pmd2.g构建而得；所述包装含所述表达载体的腺病毒是基于但不限于admax系统构建而得。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.1、sv40启动子控制的rluc报告基因，其作为内参报告基因，是测试结果不受实验条件变化的干扰，确保检测结果准确，重复性好；
26.2、所述fap启动子，其表达组织细胞特异性强，在正常组织细胞几乎不能检测到表达活性，而仅在纤维化心肌中的肌成纤维细胞或肿瘤组织的肌成纤维细胞或伤口愈合过程中的肌成纤维细胞中能检测到表达活性；
27.3、荧光素酶活性检测技术成熟，检测方法简单，容易操作；
28.4、双荧光素酶的反应产物可采用96孔板在酶标仪上读取其荧光值，适合做抗心肌纤维化药物的高通量筛选；
29.5、在该模型中可以采用不同诱导物(tgfβ1或ang ii或pa等)刺激mcfs而激活fap启动子活性，能够根据不同病理条件模拟心肌纤维化诱导条件，有针对性筛选抗心肌纤维化药物；
30.6、该表达载体在mcfs细胞诱导表达的药物筛选系统也可以可以通过慢病毒、腺病毒等系统构建；
31.7、该表达载体在mcfs细胞诱导表达的药物筛选系统也可以根据筛选需要更换诱导因子来构建；
附图说明
32.图1为实施例1中表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc构建示意图；
33.图2为实施例2载体psv40p-rluc-fapp-fluc经过限制性内切酶hind iii消化后的鉴定结果；泳道m为线性核酸分子marker，泳道1为质粒psv40p-rluc-fapp-fluc被限制性内切酶hind iii消化的产物，泳道2为质粒psv40p-rluc-fapp-fluc；
34.图3为实施例3中dapa抑制pa、tgfβ1及ang ii诱导的胶原蛋白i/iii表达情况，其中a表示dapa预处理对添加pa对col i/iii表达的影响，b表示dapa预处理对添加tgfβ1对col i/iii表达的影响，c表示dapa预处理对添加angii对col i/iii表达的影响；
35.图4为实施例4中棕榈酸(pa)对fap启动子活性影响的柱状图；
36.图5为实施例5中tgfβ1对fap启动子活性影响的柱状图；
37.图6为实施例6中ang ii对fap启动子活性影响的柱状图；
38.图7为实施例7中临床药物达格列净的干扰对棕榈酸(pa)诱导fap启动子活性影响的柱状图；
39.图8为实施例8中临床药物达格列净的干扰对tgfβ1诱导fap启动子活性影响的柱状图；
40.图9为实施例9中临床药物达格列净的干扰对ang ii诱导fap启动子活性影响的柱状图；
41.图10为实施例1中sv40启动子序列示意图；
42.图11为实施例1中rluc基因序列示意图；
43.图12为实施例1中fap启动子序列示意图；
44.图13为实施例1中fluc基因序列示意图；
45.图14为实施例1中sv40p-rluc-fapp-fluc表达框序列示意图。
具体实施方式
46.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
47.实施例1
48.本实施例提供了一种基于fap启动子的表达载体，该表达载体，包含sv40启动子控制的rluc基因表达框，以及fap启动子控制的fluc基因表达框。
49.所述表达载体中sv40启动子控制rluc报告基因的表达，其中sv40启动子核酸序列示于图10中(seq id no:1)，rluc基因核酸序列示于图11中(seq id no:2)；
50.sv40启动子序列(seq id no:1)：
51.所述表达系统中fap启动子控制fluc报告基因的表达，其中fap启动子核酸序列示于图12中(seq id no:3)，fluc基因核酸序列示于图13(seq id no:4)；
52.所述表达载体的构建方法，具体为：
53.(1)先通过pcr方法将载体psicheck2上的synthetic poly(a)与fap启动子拼接形成synthetic poly(a)-fap promoter融合片段，5’端为not i限制性内切酶识别位点，3’端为apa i限制性内切酶识别位点；
54.synthetic poly(a)的核酸序列(seq id no:5)如下：
55.aataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgt
56.(2)将载体psicheck2通过not i/apa i双酶切线性化之后，琼脂糖凝胶电泳回收答辩段，在t4 dna连接酶作用下与synthetic poly(a)-fap promoter融合片段片段链接，转化dh5α感受态细胞，挑选阳性克隆并测序鉴定，即获得表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc。表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc的构建示意图如图1所示；表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc中所含的sv40p-rluc-fapp-fluc表达框核酸序列示于图14中(seq id no:6)。
57.实施例2
58.将实施例1所得载体psv40p-rluc-fapp-fluc经过限制性内切酶hind iii消化后的鉴定结果如图2所示，根据酶切后片段大小初步显示所构建载体为预期载体psv40p-rluc-fapp-fluc。
59.实施例3
60.小鼠心肌成纤维细胞(mouse cardiac fibroblast,mcfs)是介导心肌纤维化病理性改变重要的效应细胞，而其合成及分泌的胶原蛋白i/iii是形成纤维化高级结构的重要物质基础。本实施例以mcfs作为宿主细胞，分别以饱和脂肪酸即0.1mm棕榈酸(palmitic acid，pa)或细胞因子tgfβ1(5ng/ml)或ang ii(1μm)刺激mcfs，检测心肌纤维化过程中重要标记蛋白胶原蛋白i/iii(col i/iii)的表达，拟验证体外诱导心肌纤维化模型的建立。mcfs在临床药物达格列净(dapa)预处理1h后，分别添加pa或tgfβ1或angii刺激24h，收集细胞，提取总蛋白，分析col i/iii表达变化，结果如图3(a表示dapa预处理对添加pa对col i/iii表达的影响，b表示dapa预处理对添加tgfβ1对col i/iii表达的影响，c表示dapa预处理对添加angii对col i/iii表达的影响)所示：
61.由图3(a、b、c)可知，pa、tgfβ1及ang ii均能促进mcfs细胞胶原蛋白i/iii的表达，而dapa的干预能够显著抑制pa、tgfβ1及ang ii诱导的胶原蛋白i/iii的表达，以上结果证实，体外诱导心肌纤维化模型成立。
62.实施例4
63.双荧光素酶活性检测方法
64.采用安迪福诺生物双荧光素酶检测试剂盒abp dual luciferase assay kit(货号：fp309)将冰冻的双重fluc底物(组分a)，双重fluc缓冲液(组分b)，双重rluc底物(组分c)和双重fluc缓冲液(组分d)置于室温水浴中解冻、混匀；准备双重fluc检测试剂：组分a和组分b按照1:100比例进行混合，颠倒混匀几次得溶液ab；准备双重rluc检测试剂：组分c和组分d按照1:100比例进行混合，颠倒混匀几次得溶液cd；从恒温培养箱中取出包含mcfs的培养板，冷却至室温，向每孔的培养基中加等体积的ab溶液(或cd溶液)，置于摇床或振荡器上轻柔振荡或转动不少于10mins，在酶标仪上检测萤火虫(海肾)发光信号；fap相对活性＝(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)。
65.pa诱导不同时间对mcfs中fap启动子活性的影响；
66.①
mcfs在6孔细胞培养板中培养24h，细胞培养基为rpmi 1640(含10％ fbs+1％青霉素-链霉素)，汇合度达到70～80％，根据商业转染试剂盒(genjettm plus in vitro dna transfection reagent，cat#sl100499)说明书转染载体psv40p-rluc-fapp-fluc，然后继续培养24h；
67.②
以上转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc的mcfs，添加0.1mm pa分别处理0h、12h、24h、48h后，从培养箱去除细胞培养板，添加细胞裂解混合液ab或cd，摇床轻微振荡或旋转混匀不少于10mins；
68.③
按照商业双荧光素酶活性检测试剂盒(abp dual luciferase assay kit，fp309)操作说明，分别检测pa处理不同时间点mcfs裂解液中rluc和fluc活性，fap相对活性(fluc/rluc)＝(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)，结果如表1和图4所示。
69.表1
[0070][0071]
表1为棕榈酸(pa0.1mm)处理mcfs 0h、12h、24h、48h后裂解细胞，分别检测fluc测、fluc空白、rluc测及rluc空白的值，并计算(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)比值，即fap相对活性(fluc/rluc比值)。
[0072]
由表1和图4可知：pa能够诱导mcfs中fap启动子的活化，活性在24h时达到峰值，随后略有下降。
[0073]
实施例5
[0074]
转化生长因子-β1(tgfβ1)诱导不同时间对mcfs中fap启动子活性的影响，双荧光素酶活性检测方法如实施例4；
[0075]
①
小鼠心肌成纤维细胞mcfs在6孔细胞培养板中培养24h，细胞培养基为rpmi 1640(含10％ fbs+1％青霉素-链霉素)，汇合度达到70～80％，根据商业转染试剂盒(genjettm plus in vitro dna transfection reagent，cat#sl100499)说明书转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc，然后继续培养24h；
[0076]
②
以上转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc的mcfs，添加终浓度为5ng/ml的tgfβ1分别处理0h、12h、24h、48h后，从培养箱去除细胞培养板，添加细胞裂解混合液ab或cd，摇床轻微振荡或旋转混匀不少于10mins；
[0077]
③
按照商业双荧光素酶活性检测试剂盒(abp dual luciferase assay kit，fp309)操作说明，分别检测tgfβ1处理不同时间点mcfs裂解液中海参荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性，fap相对活性＝(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)，结果如表2和图5所示。
[0078]
表2
[0079]
[0080][0081]
表2为tgfβ1(5nm)处理mcfs 0h、12h、24h、48h后裂解细胞，分别检测fluc测、fluc空白、rluc测及rluc空白的值，并计算(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)比值，即fap相对活性(fluc/rluc比值)。
[0082]
由表2和图5可知：tgfβ1能够诱导mcfs中fap启动子的活化，活性在24h达到峰值，继续诱导，fap启动子的活化保持不变。
[0083]
实施例6
[0084]
血管紧张素ii(ang ii)持续刺激mcfs不同时间对fap启动子活性的影响，双荧光素酶活性检测方法如实施例4；
[0085]
①
小鼠心肌成纤维细胞mcfs在6孔细胞培养板中培养24h，细胞培养基为rpmi 1640(含10％ fbs+1％青霉素-链霉素)，汇合度达到70～80％，根据商业转染试剂盒(genjettm plus in vitro dnatransfection reagent，cat#sl100499)说明书转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc，然后继续培养24h；
[0086]
②
以上转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc的mcfs，添加终浓度为1μm的ang ii分别处理0h、12h、24h、48h后，从培养箱去除细胞培养板，添加细胞裂解混合液ab或cd，摇床轻微振荡或旋转混匀不少于10mins；
[0087]
③
按照商业双荧光素酶活性检测试剂盒(abp dual luciferase assay kit,fp309)操作说明，分别检测ang ii处理不同时间点mcfs裂解液中rluc和fluc活性，fap相对活性＝(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)，结果如表3和图6所示。
[0088]
表3
[0089][0090]
表3为ang ii(1μm)处理mcfs 0h,12h,24h,48h后裂解细胞，分别检测fluc测、fluc空白、rluc测及rluc空白的值，并计算(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)比值，即fap相对活性(fluc/rluc比值)。
[0091]
由表3和图6可知：ang ii能够诱导mcfs中fap启动子的活化，活性随诱导时间的增加而增加；
[0092]
实施例7
[0093]
临床药物达格列净dapa的干扰对棕榈酸(pa)诱导fap启动子活性影响，双荧光素酶活性检测方法如实施例4；
[0094]
①
小鼠心肌成纤维细胞mcfs在6孔细胞培养板中培养24h，细胞培养基为rpmi 1640(含10％ fbs+1％青霉素-链霉素)，汇合度达到70～80％，根据商业转染试剂盒(genjettm plus in vitro dna transfection reagent，cat#sl100499)说明书转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc，然后继续培养24h；
[0095]
②
以上转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc的mcfs，添加终浓度为1μm的达格列净预处理1h，对照组加等体积缓冲液，再加1μm的ang ii分别处理24h，从培养箱去除细胞培养板，添加细胞裂解混合液ab或cd，摇床轻微振荡或旋转混匀不少于10mins；
[0096]
③
按照商业双荧光素酶活性检测试剂盒(abp dual luciferase assay kit,fp309)操作说明，分别检测ang ii处理不同时间点mcfs裂解液中rluc和fluc活性，fap相对活性＝(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)，结果如表4和图7所示。
[0097]
表4
[0098][0099]
表4为达格列净预处理mcfs 1h后，补充pa(0.1mm)继续处理mcfs 24h后裂解细胞，分别检测fluc测、fluc空白、rluc测及rluc空白的值，并计算(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)比值，即fluc/rluc比值。
[0100]
由表4和图7可知：pa能够诱导mcfs中fap启动子的活化，fluc/rluc比值增加，而达格列净的干预能够减轻fap启动子活性，相对pa组，fluc/rluc比值呈现下降趋势。
[0101]
实施例8
[0102]
临床药物达格列净dapa的干扰对tgfβ1诱导fap启动子活性影响，双荧光素酶活性检测方法如实施例4；
[0103]
①
小鼠心肌成纤维细胞mcfs在6孔细胞培养板中培养24h，细胞培养基为rpmi 1640(含10％ fbs+1％青霉素-链霉素)，汇合度达到70～80％，根据商业转染试剂盒(genjettm plus in vitro dna transfection reagent，cat#sl100499)说明书转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc，然后继续培养24h；
[0104]
②
以上转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc的mcfs，添加终浓度为1μm的达格列净预处理1h，对照组加等体积缓冲液，再加5nm的tgfβ1分别处理24h，从培养箱去除细胞培养板，添加细胞裂解混合液ab或cd，摇床轻微振荡或旋转混匀不少于10mins；
[0105]
③
按照商业双荧光素酶活性检测试剂盒(abp dual luciferase assay kit,fp309)操作说明，分别检测ang ii处理不同时间点mcfs裂解液中rluc和fluc活性，fap相对
活性＝(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)，结果如表5和图8所示。
[0106]
表5
[0107][0108]
表5为达格列净预处理mcfs 1h后，补充tgfβ1(5nm)继续处理mcfs 24h后裂解细胞，分别检测fluc测、fluc空白、rluc测及rluc空白的值，并计算(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)比值，即fluc/rluc比值。
[0109]
由表5和图8可知：tgfβ1能够诱导mcfs中fap启动子的活化，fluc/rluc比值增加，而达格列净的干预能够减轻fap启动子活性，相对tgfβ1组，fluc/rluc比值呈现下降趋势；
[0110]
实施例9
[0111]
临床药物达格列净dapa的干扰对ang ii诱导fap启动子活性影响，荧光素酶活性检测方法如实施例3；
[0112]
①
小鼠心肌成纤维细胞mcfs在6孔细胞培养板中培养24h，细胞培养基为rpmi 1640(含10％ fbs+1％青霉素-链霉素)，汇合度达到70～80％，根据商业转染试剂盒(genjettm plus in vitro dna transfection reagent，cat#sl100499)说明书转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc，然后继续培养24h；
[0113]
②
以上转染质粒psv40p-rluc-fapp-fluc的mcfs，添加终浓度为1μm的达格列净预处理1h，对照组加等体积缓冲液，再加1μm的ang ii分别处理24h，从培养箱去除细胞培养板，添加细胞裂解混合液ab或cd，摇床轻微振荡或旋转混匀不少于10mins；
[0114]
③
按照商业双荧光素酶活性检测试剂盒(abp dual luciferase assay kit,fp309)操作说明，分别检测ang ii处理不同时间点mcfs裂解液中rluc和fluc活性，fap相对活性＝(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)，结果如表6和图9所示。
[0115]
表6
[0116][0117]
表6为达格列净预处理mcfs 1h后，补充ang ii(1μm)继续处理mcfs 24h后裂解细胞，分别检测fluc测、fluc空白、rluc测及rluc空白的值，并计算(fluc测-fluc空白)/(rluc测-rluc空白)比值，即fluc/rluc比值。
[0118]
由表6和图9可知：ang ii能够诱导mcfs中fap启动子的活化，fluc/rluc比值增加，而达格列净的干预能够减轻fap启动子活性，相对ang ii组，fluc/rluc比值呈现下降趋势。
[0119]
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.基于fap启动子的表达载体，其特征在于，该表达载体，包含sv40启动子控制的海参荧光素酶（renilla luciferase,rluc）基因表达框，以及fap启动子控制的萤火虫荧光素酶（firefly luciferase,fluc）基因表达框。2.根据权利要求1所述的基于fap启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载体的构建方法为：（1）先通过pcr方法将载体psicheck2上的synthetic poly(a)与fap启动子拼接形成synthetic poly(a)-fap promoter融合片段，5’端为not i限制性内切酶识别位点，3’端为apa i限制性内切酶识别位点；（2）将载体psicheck2通过not i/apa i双酶切线性化之后，琼脂糖凝胶电泳回收大片段，在t4dna连接酶作用下与步骤（1）所得的synthetic poly(a)-fap promoter融合片段连接，转化dh5a感受态细胞，挑选阳性克隆并测序鉴定，即获得表达载体psicheck2-fap-promoter-fluc，命名为psv40p-rluc-fapp-fluc。3.根据权利要求1所述的基于fap启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载体以sv40启动子控制下rluc作为内参报告基因，fap启动子控制下fluc作为报告基因，用于评价药物对fap启动子活性的影响。4.根据权利要求1所述的基于fap启动子的表达载体，其特征在于，所述表达载体通过转染细胞获得基因工程细胞株；或者所述表达载体中sv40启动子控制的rluc基因和fap启动子控制的fluc基因表达框亚克隆至慢病毒载体获得双荧光素酶表达慢病毒颗粒plenti_sv40p-rluc-fapp-fluc，或所述表达载体亚克隆至腺病毒颗粒ad_sv40p-rluc-fapp-fluc通过感染细胞获得基因工程细胞株。5.基于权利要求1-3任一项所述基于fap启动子的表达载体的心肌纤维化药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以psicheck2为基础骨架，将psicheck2中的hsv tk启动子替换为fap启动子而获得表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc；（2）将以上表达载体psv40p-rluc-fapp-fluc转染mcfs细胞建立心肌纤维化药物筛选细胞模型；（3）模型中采用sv40启动子控制rluc基因作为内参报告基因，以fap启动子控制fluc基因作为药物活性评价报告基因，通过计算fluc活性与rluc活性比值初步评价药物抑制fap启动子活性的效果，以此简介评价药物可能抗心肌纤维化的作用。6.根据权利要求5所述的心肌纤维化药物筛选方法，其特征在于，步骤（2）中所采用转染的细胞为原代小鼠心肌成纤维细胞或atcc来源人心肌成纤维细胞。7.根据权利要求5所述的心肌纤维化药物筛选方法，其特征在于，所述筛选方法是以fap启动子活性调控为核心的药物筛选方法。8.根据权利要求5所述的心肌纤维化药物筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，该细胞模型的建立方法替换成通过包装含所述表达载体的腺病毒或慢病毒感染的方式建立。

技术总结
本发明公开了基于FAP启动子的表达载体及心肌纤维化药物筛选方法。表达载体包含SV40启动子控制的海参荧光素酶Rluc基因表达框，以及FAP启动子控制的萤火虫荧光素酶Fluc基因表达框。该方法所采用的表达载体基于FAP启动子调控的Fluc表达而建立，以MCFs或HCFs为宿主，通过转化，或基于表达载体构建的慢病毒或腺病毒通过感染MCFs或HCFs而构建得到细胞模型；该细胞模型采用FAP启动子，以Fluc作为报告基因，同时以SV40启动子控制下Rluc的组成型表达作为内参；本发明首次采用心肌纤维化生物标志基因FAP的启动子构建抗心肌纤维化药物筛选方法，能够高度特异性反应心肌纤维化的病理生理变化，同时采用双荧光素酶方法检测，赋予该检测方法简便、可定量、高灵敏度及背景低等特点。高灵敏度及背景低等特点。高灵敏度及背景低等特点。


技术研发人员：杨晓松 周驰
受保护的技术使用者：湖北科技学院
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/8/14