一种可视化检测水稻条纹花叶病毒的试剂盒

1.本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地，涉及一种可视化检测水稻条纹花叶病毒的试剂盒。


背景技术：

2.水稻条纹花叶病毒(rice stripe mosaic virus，rsmv)，是2017年在我国华南地区首次发现的一种新型水稻病毒，并鉴定为弹状病毒科(rhabdoviridea)细胞质弹状病毒属(cytorhabdovirus)的一个新种。rsmv病毒粒子呈杆状，具包膜，直径为45～55nm，长度300～375nm；基因组全长12774nt，反义互补链有七个orf，排列顺序和其他弹状病毒类似，为3
’‑
n-p-p3-m-g-p6-l-5’。orf1编码结构蛋白n；orf2编码结构蛋白p，并且具有潜在的磷酸化位点；orf3编码一个非结构蛋白p3，它起到运动蛋白的作用；orf4编码一个膜蛋白m；orf5编码一个结构蛋白g，该蛋白的n端拥有一个信号肽，c端存在跨膜结构域；orf6编码一个功能未知的辅助蛋白p6，包含一段跨膜结构域；orf7编码蛋白l，该蛋白推测为rna病毒的依赖于rna的rna聚合酶。
3.该病毒通过电光叶蝉(recilia dorsalis)取食水稻传播，不能通过机械摩擦或种子传播。病毒在叶蝉体内可复制增殖，并使叶蝉终身带毒，属持久增殖型传播。
4.感染rsmv的水稻略微矮缩，叶片呈黄色条纹花叶，发育后期抽穗不完整，且籽粒空瘪，对水稻的生产造成严重危害。水稻条纹花叶病毒目前在我国华南稻区大面积发生并对水稻生产造成严重危害。因此快速、准确的检测rsmv非常必要。
5.raa(recombinase aided amplification)技术是一种新型等温扩增技术。它不需要在较高温度下进行，在37℃～42℃由酶介导打开模板链就能完成扩增，整个反应5～30min内即可完成。灵敏度好且特异性高，与经典的pcr方法相比并无明显差异，且不受场地限制，在野外缺少设备时可以利用手握保温进行检测。与此同时raa试剂以冻干形式提供，增加了稳定性，运输和储藏过程不需要冷藏。目前raa检测技术已经被应用到多种病原物的检测中，表现出不错的检测效果。
6.crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统是指在cas(crispr-associated)效应蛋白和引导rna(crrna)的协助下，特异性结合靶标核酸，是原核生物的获得性免疫系统防御病毒和其他外来的dna侵入的方式。根据cas蛋白的序列、结构、功能及其参与的反应，可将crispr/cas系统分为2大类，6小类。其中，一类crispr/cas系统使用多亚基效应器复合物，包含ⅰ类、ⅲ类、ⅳ类cas蛋白，另一类crispr/cas系统效应器复合物的功能由单个蛋白完成，包含ⅱ类、
ⅴ
类、ⅵ类cas蛋白。因不同的cas蛋白具有不同的分子结构和催化活性，使得crispr系统被开发出强大的基因编辑功能的同时，也被开发成为灵敏度高、特异性强的核酸检测有力工具。其中ⅱ类cas9系统、
ⅴ
类cas12系统及ⅵ类cas13系统已被广泛应用于核酸检测领域。
7.属于二类
ⅴ
型crispr系统的效应蛋白cas12，是rna引导的核酸内切酶，其家族成员主要包括cas12a～cas12e。与cas9蛋白类似，cas12a能够通过识别富含t碱基的pam
(protospacer adjacent motif)序列并催化自身引导rna的成熟靶向双链dna并在ruvc核酸酶结构域处进行切割产生粘性末端，根据该一特性也被应用于基因编辑。同时研究发现cas12a除了具有靶向双链dna的切割活性外，也能够对单链dna进行切割，而对单链dna进行切割时不需要pam序列进行识别。此外，cas12a蛋白在切割目标dna后，还能对附近的非靶标单链dna进行切割，这种对非特异性靶标的切割活性被称之为反式切割。基于这种反式切割活性，在体系中加入两端连有荧光基团和荧光淬灭基团的单链dna报告基因，当体系中靶标序列存在时，cas12a蛋白的反式切割活性被激活，将单链dna报告基因切碎，体系发出荧光，完成检测过程。反之，当靶标序列不存在时，cas12a蛋白的反式切割活性便不会被激活，即体系不发荧光。当前广泛使用且效率较高的为来自lachnospiraceae bacterium的cas12a蛋白(lbcas12a)。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种可视化检测水稻条纹花叶病毒的试剂盒，其基于rt-raa与crispr-cas12a的结合。
9.本发明的第一个目的在于提供一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测水稻条纹花叶病毒的组合物。
10.本发明的第二个目的在于提供任一所述的组合物在制备水稻条纹花叶病毒检测试剂盒中的应用。
11.本发明的第三个目的在于提供一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测水稻条纹花叶病毒的试剂盒
12.本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
13.一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测水稻条纹花叶病毒的组合物，包括核苷酸序列如seq id no:1～2所示的检测引物和核苷酸序列为cccccccc所示的ssdna荧光探针。
14.优选地，所述ssdna荧光探针5’端标记fam基团，3’端标记bhq1基团。
15.优选地，所述组合物还含有核苷酸序列如seq id no:3所示的crrna。
16.任一所述的组合物在制备水稻条纹花叶病毒检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围
17.本发明还要求保护一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测水稻条纹花叶病毒的试剂盒，所述试剂盒中含有任一所述组合物。
18.优选地，所述试剂盒中含有植物粗提液buffer、rt-raa扩增试剂、和/或cripsr-cas12a检测试剂的中的一种或几种。
19.更优选地，所述试剂盒中含有植物粗提液buffer、rt-raa扩增试剂、和cripsr-cas12a检测试剂。
20.优选地，植物粗提液buffer为含有60ml/l peg 200和20mm naoh的ddh2o。
21.优选地，rt-raa扩增试剂为rt-raa反应干粉、buffer a和/或buffer b中的一种或几种。
22.更优选地，所述rt-raa反应干粉含有逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、atp、dntp mix和氯化镁。
23.更优选地，所述buffer a含有200ml/l聚乙二醇。
24.更优选地，所述buffer b含有280mm醋酸镁。
25.优选地，cripsr-cas12a检测试剂为lbcas12a和/或10
×
enhanced buffer的一种或两种。
26.作为一个具体的实施方案，所述试剂盒含有以下组分：
27.rt-raa反应干粉(组成成分为逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、atp、dntp mix和氯化镁(mgcl2))、成分为200ml/l聚乙二醇的buffer a；成分为280mm醋酸镁(mg ac2)的buffer b、raa上下游引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)；ddh2o；lbcas12a(10μmol/l)；crrna(10μmol/l)；ssdna荧光探针(10μmol/l)；10
×
enhanced buffer，其中，
28.raa-rsmv-f1：tcttctaacttcttcttgaccgattacctgcc(seq id no:1)，
29.raa-rsmv-r1：cttctttgaatcctcatctccgatagcctcat(seq id no:2)，
30.crrna：uaauuucuacuaaguguagaucgacgugacagaagucaaga(seq id no:3)，
31.ssdna荧光探针：fam-cccccccc-bhq1。
32.其使用方法为：
33.1、植物粗提液的制备
34.植物粗提液的制备步骤为，取一定量的植物叶片放入1.5ml试管，并在试管中加入2颗直径为3.175mm的钢珠和400μl配置好的粗提液buffer(ddh2o中含有60ml/l peg 200和20mm naoh)，放在组织研磨机上研磨30s，得到的即为植物粗提液。
35.2、rt-raa反应
36.在rt-raa反应干粉管中加入buffer a 19μl，ddh2o 19μl，充分振荡混匀后，瞬时离心10s，然后等体积分装为两管，每管19μl，随后加入raa上下游引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)各1μl，粗提液2μl，充分混匀后，在管盖上加入buffer b 2μl，盖上盖子，离心混匀，37℃左右水浴反应20min。检测体系如下：
[0037][0038]
3、crispr-cas12a检测体系
[0039]
取2μl rt-raa反应产物加入至crispr-cas12a检测体系，37℃左右水浴反应10min，反应结束后放在蓝光下观察荧光。
[0040]
crispr-cas12a检测体系：lbcas12a(10μmol/l)0.4μl，crrna(10μmol/l)0.4μl，ssdna荧光探针(10μmol/l)2μl，10x enhanced buffer 2μl，rt-raa反应产物2μl，用ddh2o补齐20μl。检测体系如下：
[0041][0042]
4、结果判读
[0043]
反应结束后，反应产物若在蓝光下发出绿色荧光，即该检测样品为阳性，反之则为阴性。
[0044]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0045]
本发明建立了一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测的试剂盒，其具有检测特异性好，灵敏度高，可视化，无需专业实验室仪器设备等优点；能对感病水稻和单头传毒昆虫进行检测，操作简单，检测效果均优于rt-pcr，适合田间检测。
附图说明
[0046]
图1为关于rsmv的rt-raa引物选择和最适反应体系建立：(a)确定最适引物，各反应引物组合分别为f1/r1(225bp)，f1/r2(240bp)，f2/r3(285bp)，f3/r3(270bp)，f4/r4(274bp)，f4/r5(372bp)，f5/r5(128bp)，f6/r6(271bp)；(b)确定最适引物浓度，各反应引物浓度分别为0.1μm，0.2μm，0.4μm，0.6μm，0.8μm；(c)确定最适反应温度。各反应温度分别为30℃，32℃，34℃，37℃，42℃，46℃，48℃，50℃；(d)确定最适反应时间，各反应时间分别为15min，20min，25min，30min，35min，40min，45min，m为核酸marker。
[0047]
图2为用考马斯亮蓝对蛋白样品进行染色。m：蛋白marker；1：加诱导剂iptg之前的菌液；2：诱导4h后的菌液；3：菌体破碎离心后的上清；4：菌体破碎离心后的沉淀；5：用elution buffer洗脱的lbcas12a蛋白；6：用置换buffer置换后得到的lbcas12a蛋白。
[0048]
图3为基于rt-raa和crispr/cas12a检测的工作原理和设计；(a)rt-raa结合crispr/cas12a检测系统的工作模式图。首先通过rt-raa反应得到足够量的dsdna靶标基因，然后dsdna靶标基因与cas12a、crrna形成3元复合物，激活了cas12a蛋白的反式切割活性，进而切割体系中连接有fam荧光基团和bhq1荧光淬灭基团的报告基因，在蓝光的照射下阳性样品发出绿色荧光，阴性样品不发光。“f”表示fam荧光基团，“q”表示bhq1荧光淬灭基团；(b)crispr/cas12a检测方法的验证，在不同组分缺失情况下，反应30min的实时荧光信号记录图；(c)不同组分缺失情况下，反应30min在蓝光下的视觉观察结果。误差线表示三次重复实验的平均值。
[0049]
图4为crispr/cas12a最适检测体系的建立：(a)cas12a蛋白的浓度不变，改变体系中crrna的浓度；(b)crrna的浓度不变，改变体系中cas12a蛋白的浓度。(c)等比例改变cas12a蛋白浓度与crrna的浓度。(d)不同浓度的ssdna荧光探针报告基因实时荧光信号分析。(e)不同浓度的ssdna荧光探针报告基因终点荧光视觉检测。(f)以标准质粒为模板进行crispr/cas12a检测灵敏度的实时荧光信号分析结果。(g)以标准质粒为模板进行crispr/cas12a检测灵敏度的终点荧光信号检测结果。误差线表示三次重复实验的平均值。
[0050]
图5为用植物粗提液验证检测rsmv的反应灵敏度与特异性；(a)将植物粗提液连续稀释10倍后用rt-raa进行检测，其中清水为空白对照；(b)将植物粗提液连续稀释10倍后用rt-pcr进行检测，其中清水为空白对照；(c)将植物粗提液连续稀释10倍后用基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化方式进行检测，其中清水为空白对照，记录其各反应的荧光信号强度；(d)终点荧光视觉检测反应灵敏度。(e)检测含不同水稻病原物时的荧光信号；(f)终点荧光视觉检测反应特异性；(g)rt-pcr检测电光叶蝉带毒情况；(h)基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测电光叶蝉的带毒情况；(i)终点荧光视觉检测电光叶蝉带毒情况；其中，rsmv：水稻条纹花叶病毒；srbsdv：南方水稻黑条矮缩病毒；rgdv：水稻瘤矮病毒；rrsv：水稻齿叶矮缩病毒；rolp：水稻橙叶植原体；healthy：没有感染病毒的水稻样品；1～10：表示10头不同的电光叶蝉；“+”阳性对照。
“‑”
阴性对照。误差线表示三次重复实验的平均值。
[0051]
图6为田间样品检测；基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测方法检测田间样本的流程示意图：首先提取植物粗提液；然后取2μl粗提液加入到rt-raa(25μl)反应体系中，37℃左右水浴反应20min；反应结束后取2μl反应产物加入至crispr-cas12a(20μl)检测体系中37℃左右水浴反应10min，反应结束后放在蓝光下观察荧光情况。
具体实施方式
[0052]
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0053]
1、样品
[0054]
携带rsmv的水稻毒株由本实验室保存。
[0055]
2、主要试剂
[0056]
rt-raa扩增试剂为rt-raa反应干粉，组成成分为(逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、atp、dntp mix、氯化镁(mgcl2))；成分为200ml/l聚乙二醇的buffer a；成分为280mm醋酸镁(mg ac2)的buffer b；rt-raa反应干粉、buffer a与buffer b购自杭州众测生物科技有限公司，货号为s003zc的rt-raa核酸扩增试剂中的组分。
[0057]
axyprep pcr清洁试剂盒与质粒提取试剂盒，美国axygen公司；
[0058]
rna提取试剂rna isolater total rna extraction reagent(r401-01)与one step rt-pcr试剂盒，南京诺唯赞(vazyme)生物科技有限公司；
[0059]
平末端载体试剂盒-blunt zero cloning kit，北京全式金生物技术有限公司(transgen biotech)。
[0060]
实施例1rt-raa引物的设计和最适引物的确定
[0061]
一、实验方法
[0062]
1、引物设计
[0063]
根据本实验室测序得的华南地区rsmv全基因组序列，在病毒表达量最高的n基因中寻找保守序列设计raa引物，得到8对不同的引物组合，见表1。
[0064]
表1：
[0065][0066][0067]
3、rt-raa反应
[0068]
在含有rt-raa反应干粉的离心管中加入buffer a 19μl，ddh2o 19μl，充分振荡混匀后，瞬时离心10s，然后等体积分装为两管，每管19μl。
[0069]
向反应管中依次加入raa上下游引物各1μl，含有感染rsmv的水稻rna2μl，并在管盖上加入buffer b 2μl(每管反应总体系为25μl)，盖上管盖并瞬时离心5s，充分振荡混匀后再次瞬时离心5s，42℃置于金属浴中反应25min。反应结束后，用pcr清洁试剂盒对反应产物进行处理，得到20μl清洁产物，吸取10μl用2％琼脂糖凝胶电泳分析，观察电泳结果。
[0070]
二、实验结果
[0071]
结果如图1(a)，8对引物组合中，raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1的组合扩增效果最好，用于后续的检测使用。
[0072]
实施例2最适rt-raa反应体系的建立
[0073]
一、实验方法
[0074]
使用raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1引物，进行rt-raa反应，考察反应体系中的各个因素对于扩增效果的影响：
[0075]
1、在体系中分别加入引物的量分别为0.1μm、0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μm，设定反应温度为42℃，反应时间为25min，确定最适引物浓度；
[0076]
2、在最适引物浓度下，利用pcr仪设置梯度温度，从低到高分别为30℃、32℃、34℃、37℃、42℃、46℃、48℃、50℃，确定最适反应温度；
[0077]
3、再在最适反应引物浓度与温度的条件下，设置反应时间梯度：15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min，确定适宜反应时间。
[0078]
二、实验结果
[0079]
结果如图1(b)、图1(c)和图1(d)，当在反应体系中加入上下游引物各1μl时，扩增出的目的条带最亮；当反应在30℃～42℃条件下均能扩增出较亮的目的条带，超过42℃后目的条带开始变暗甚至没有明显条带，为了方便适应室外条件，选用接近人体温度的37℃；当随着反应时间的增加，20min后条带的亮度没有显著区别，为了缩短检测时间，该反应进行20min即可。最终优化后的反应条件为25μl体系中加入上下游引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)各1μl并在37℃条件下反应20min。
[0080]
实施例3lbcas12a蛋白的表达及纯化
[0081]
一、实验方法
[0082]
1、表达lbcas12a蛋白的原核表达载体的构建
[0083]
将lbcas12a蛋白基因构建到含有6
×
his标签的pet28a原核表达载体上得到原核表达载体pet28a-lbcas12a，测序正确的质粒保存备用。
[0084]
2、lbcas12a蛋白的诱导
[0085]
将测序正确的原核表达载体pet28a-lbcas12a转化至rosetta(de3)感受态细胞中，检测并挑选阳性单菌落至5ml新鲜含卡那霉素的lb液体培养基中，放入37℃摇床，220rpm培养过夜，得到的为种子菌。将过夜种子菌按照1﹕100的比例转接到100ml新鲜含卡那霉素的lb液体培养基中，37℃摇床，220rpm培养。待菌液浓度达到od600为0.6～0.8时，加入iptg至终浓度为0.5mm放置于37℃摇床，220rpm诱导4h。
[0086]
3、lbcas12a蛋白的纯化
[0087]
诱导好的菌液在4℃条件下，8000rpm离心10min，用预冷的25ml lysis buffer(50mm tris-hcl(ph8.0)；600mm nacl；1mm dtt；5％甘油)悬浮菌体，然后用超声细胞破碎仪破碎菌体，程序为超声3s，间隔5s，功率30％，总共破碎15min。
[0088]
将破碎好的菌液在4℃，12000rpm条件下离心20min。离心后，将上清液与1ml吸附his标签蛋白的磁珠novagen ni-nta his
·
bindtm resin(lot：d00143767，cat：70666)混合，在4℃下15rpm孵育1h。孵育结束后将混合液倒入30ml的纯化柱中于在4℃条件下进行过柱，并用washing buffer(50mm tris-hcl(ph8.0)；600mm nacl；1mm dtt；5％甘油；30mm咪唑)洗三遍，每次10ml，清洗完用3.2ml elution buffer(50mm tris-hcl(ph8.0)；600mm nacl；1mm dtt；5％甘油；600mm咪唑)洗脱目的蛋白，然后用置换buffer(50mm tris-hcl(ph8.0)；600mm nacl；2mm dtt；5％甘油)对lbcas12a蛋白中的elution buffer进行置换。最后，收集蛋白质并稀释至终浓度为10μm，在-80℃下保存。
[0089]
二、实验结果
[0090]
用sds-page分析验证lbcas12a蛋白的表达与纯化效果见图2，结果显示，分别选取加诱导剂iptg之前的菌液、诱导4h后的菌液、菌体破碎离心后的上清、菌体破碎离心后的沉淀、用elution buffer洗脱的lbcas12a蛋白和用置换buffer置换后得到的lbcas12a蛋白。从考马斯亮蓝染色的结果可以看出，用置换buffer置换处理后在151kda大小处得到了较单一lbcas12a蛋白。
[0091]
实施例4基于lbcas12a反式切割活性的荧光测定体系的建立
[0092]
一、实验方法
[0093]
1、crrna的设计
[0094]
根据raa引物确定的序列区域，来设计crrna。在crispr-cas系统中，cas12a蛋白crrna具有识别5
′
端富含t的pam位点(tttn，n为任意一种核苷酸)的特性，于是在确定序列区域挑选符合条件的序列，同时为了使所设计的crrna具有较强的特异性，将crrna的长度设计为20nt左右，并通过ncbi进行blast分析，选择特异性较好的crrna并合成，命名为rsmv-crrna，序列如下：uaauuucuacuaaguguagaucgacgugacagaagucaaga。
[0095]
2、阳性标准品质粒的制备
[0096]
提取被rsmv侵染的水稻植株的总rna，采用rt reagent kit(takara)方法合成cdna，以cdna为模板，用筛选的最佳raa引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)扩增出
目的基因片段并克隆至平末端载体-blunt zero，得到重组质粒-blunt zero-rsmv，经测序验证后用核酸蛋白检测仪测定所提取的质粒浓度，并计算其拷贝数作为实验的阳性标准品质粒-blunt zero-rsmv。
[0097]
3、基于lbcas12a反式切割活性的荧光测定
[0098]
设计报告探针序列ssdna荧光探针，其序列为fam-cccccccc-bhq1，由上海生物工程有限公司合成；crispr/cas12a检测反应体系中：10
×
enhanced buffer：100mm tris-hcl(ph 9.0)，100mm nacl，150mm mgcl2，10mm dtt，5％ peg-200。
[0099]
rt-raa/crispr-cas12a检测反应体系为(50μl)：lbcas12a(10μmol/l)1μl，crrna(10μmol/l)1μl，ssdna荧光探针(10μmol/l)5μl，10
×
enhanced buffer 5μl，阳性标准品质粒-blunt zero-rsmv 2μl，用ddh2o补齐50μl；
[0100]
将配制好的体系加入到96孔酶标板中并用酶标仪检测荧光，设置程序为37℃反应30min，每30s测定一次荧光强度(λex：492nm，λem：520nm)，反应结束后，吸取反应产物20μl至透明8连管中，用蓝光照射观察荧光。
[0101]
4、各因素对荧光信号强度的影响
[0102]
首先按照上述步骤对lbcas12a反式切割活性进行荧光测定，检测在分别缺失lbcas12a、crrna、ssdna荧光探针、靶标序列和缓冲液buffer等不同反应组分的情况下体系的荧光信号强度。
[0103]
同时为了使crispr-cas12a检测效果达到最佳，于是对反应体系中各组分进行优化。以阳性标准品质粒-blunt zero-rsmv为模板，分别对反应体系中cas12a蛋白与crrna比例及ssdna荧光探针报告基因的浓度进行优化。比较反应体系荧光强度及到达荧光平台期所用的时间来确定最优反应条件。
[0104]
二、实验结果
[0105]
图3(a)为crispr/cas12a检测体系的一个模式图，dsdna与lbcas12a、crrna形成三元复合物，激活了lbcas12a蛋白的反式切割活性，进而切割体系中两端分别连接有fam荧光基团和bhq1荧光淬灭基团的ssdna荧光探针，使得体系在蓝光的照射下发出绿色荧光。
[0106]
为了说明该检测体系的可行性及各组分对该检测反应的必要性，以构建好的标准质粒-blunt zero-rsmv(4.56
×
109copies/μl)为模板，将反应体系进行单一组分缺失处理，并用酶标仪检测荧光信号强度以及反应结束后在蓝光下观察反应荧光。显示只有在所有组分都存在时才能检测出较强的荧光信号变化并在蓝光下观察到强烈的绿色荧光(图3(b)和图3(c))，即对于crispr/cas12a检测反应体系来说，其每一种组分都必不可少，也表明该检测体系不存在自激活造成假阳性的现象。
[0107]
由于反应体系中的反应组分会对cas12a反式切割活性造成不同程度的影响，因此为达到较好的检测效果，对体系中各组分的最适反应浓度进行优化。改变反应体系中cas12a与crrna的比例会对cas12a蛋白的反式切割活性造成显著影响，于是首先探究该反应中最适cas12a与crrna的比例。通过调整体系中cas12a与crrna的比例，发现不论是单独提高体系中cas12a蛋白或crrna的浓度还是将cas12a与crrna等比例增加，对cas12a蛋白的反式切割活性都没有明显影响(图4(a)、图4(b)和图4(c))，因此为了节约cas12a蛋白与crrna的用量，将体系中cas12a蛋白与crrna的浓度都定为100nm。
[0108]
另一方面，报告基因ssdna荧光探针对荧光信号强度起着重要作用，于是在体系中加入不同浓度梯度的ssdna荧光探针，实验结果发现随着加入的报告基因ssdna荧光探针量增加，荧光信号也逐渐增强，但与此同时，体系达到最强荧光强度所需要的时间也随之增加(图4(d)和图4(e))。到当体系中ssdna荧光探针浓度为500nm时，反应10min左右即可得到肉眼可见的分辨结果。综合以上结果，为了达到快速可视化且节省材料的目的，最终确定在反应体系中加入100nm的cas12a蛋白、100nm的crrna以及500nm的ssdna荧光探针，并确定crispr检测反应的时间为10min。
[0109]
实施例5一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测rsmv的方法
[0110]
一、实验方法
[0111]
在确定检测体系中各组分的量之后，以浓度为2.28
×
10
10
copies/μl的阳性标准品质粒-blunt zero-rsmv为模板，检测优化体系的最低检测限点，
[0112]
1、rt-raa反应
[0113]
在含有rt-raa反应干粉的反应管中加入buffer a 19μl，ddh2o 19μl，充分振荡混匀后，瞬时离心10s，然后等体积分装为两管，每管19μl，随后加入raa上下游引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)各1μl，阳性标准品质粒-blunt zero-rsmv 2μl，充分混匀后，在管盖上加入buffer b 2μl，盖上盖子，离心混匀，37℃左右水浴反应20min。
[0114]
2、crispr/cas12a检测体系
[0115]
crispr-cas12a检测反应体系为(50μl)：lbcas12a(10μmol/l)1μl，crrna(10μmol/l)1μl，ssdna(10μmol/l)5μl，10
×
enhanced buffer 5μl，不同浓度的质粒标准品2μl，用ddh2o补齐50μl；将配制好的体系加入到96孔酶标板中并用酶标仪检测荧光，设置程序为37℃，每30s测定一次荧光强度(λex：492nm，λem：520nm)，持续测定30min，反应结束后，吸取反应产物20μl至透明8连管中，用蓝光照射观察荧光。
[0116]
二、实验结果
[0117]
实验结果发现，当阳性标准品质粒-blunt zero-rsmv模板稀释至2.28
×
108copies/μl时，其能检测出的荧光信号已经非常弱了，而当稀释至2.28
×
107copies/μl时，已经检测不出明显的荧光信号变化，所以该反应体系检测限点为2.28
×
108copies/μl(图4(f)和图4(g))。
[0118]
实施例6一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测rsmv的试剂盒
[0119]
一、组成
[0120]
rt-raa反应干粉(组成成分为逆转录酶、重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、atp、dntp mix和氯化镁(mgcl2))、成分为200ml/l聚乙二醇的buffer a；成分为280mm醋酸镁(mg ac2)的buffer b、raa上下游引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)；ddh2o；lbcas12a(10μmol/l)；crrna(10μmol/l)；ssdna荧光探针(10μmol/l)；10
×
enhanced buffer，其中，
[0121]
raa-rsmv-f1：tcttctaacttcttcttgaccgattacctgcc(seq id no:1)，
[0122]
raa-rsmv-r1：cttctttgaatcctcatctccgatagcctcat(seq id no:2)，
[0123]
crrna：uaauuucuacuaaguguagaucgacgugacagaagucaaga(seq id no:3)，
[0124]
ssdna荧光探针：fam-cccccccc-bhq1。
[0125]
二、使用方法
[0126]
1、植物粗提液的制备
[0127]
植物粗提液的制备步骤为，取一定量的植物叶片放入1.5ml试管，并在试管中加入2颗直径为3.175mm的钢珠和400μl配置好的粗提液buffer(ddh2o中含有60ml/l peg 200和20mm naoh)，放在组织研磨机上研磨30s，得到的即为植物粗提液。
[0128]
2、rt-raa反应
[0129]
在rt-raa反应干粉管中加入buffer a 19μl，ddh2o 19μl，充分振荡混匀后，瞬时离心10s，然后等体积分装为两管，每管19μl，随后加入raa上下游引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)各1μl，粗提液2μl，充分混匀后，在管盖上加入buffer b 2μl，盖上盖子，离心混匀，37℃左右水浴反应20min。检测体系如下：
[0130][0131][0132]
3、crispr-cas12a检测体系
[0133]
取2μl rt-raa反应产物加入至crispr-cas12a检测体系，37℃左右水浴反应10min，反应结束后放在蓝光下观察荧光。
[0134]
crispr-cas12a检测体系：lbcas12a(10μmol/l)0.4μl，crrna(10μmol/l)0.4μl，ssdna荧光探针(10μmol/l)2μl，10x enhanced buffer 2μl，rt-raa反应产物2μl，用ddh2o补齐20μl。检测体系如下：
[0135][0136]
4、结果判读
[0137]
反应结束后，反应产物若在蓝光下发出绿色荧光，即该检测样品为阳性，反之则为阴性。
[0138]
实施例7基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测rsmv的试剂盒的灵敏度检测
[0139]
一、实验方法
[0140]
为了更符合田间实际检测的条件，利用感染rsmv水稻的粗提液用于灵敏度检测。
[0141]
植物粗提液为初始样品，并以10为倍数用ddh2o进行梯度稀释，得到稀释10
0-10-8
倍的9个不同浓度的粗提液样品。用(1)rt-pcr、(2)rt-raa和(3)rt-raa与crispr-cas12a结
合的可视化的检测方法分别对不同稀释倍数的粗提液进行检测，其中一份加入清水作为空白对照，从而确定该两种方法对植物粗提液的检测灵敏度。
[0142]
(1)rt-pcr的检测体系为：2
×
one step mix 5μl，raa上下游引物各0.25μl，one step enzyme mix 0.5μl，粗提液0.5μl，补充ddh2o至10μl；
[0143]
rt-pcr的检测程序为50℃反转录30min，95℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min，降温至15℃保存；
[0144]
(2)rt-raa的检测方法为：
[0145]
在含有rt-raa反应干粉的反应管中加入buffer a 19μl，ddh2o 19μl，充分振荡混匀后，瞬时离心10s，然后等体积分装为两管，每管19μl，随后加入raa上下游引物(raa-rsmv-f1和raa-rsmv-r1)各1μl，粗提液2μl，充分混匀后，在管盖上加入buffer b 2μl，盖上盖子，离心混匀，37℃左右水浴反应20min。
[0146]
反应结束后，用pcr清洁试剂盒对反应产物进行处理，得到20μl清洁产物，吸取10μl用2％琼脂糖凝胶电泳分析，观察电泳结果。
[0147]
(3)rt-raa与crispr-cas12a的检测方法：使用实施例6基于rt-raa的检测rsmv的试剂盒，将检测不同稀释倍数粗提液的rt-raa产物直接取2μl加入crispr/cas12a检测体系中，通过酶标仪观察反应荧光的变化情况并在反应结束后于蓝光下观察荧光，从而确定该反应体系的灵敏性。
[0148]
二、实验结果
[0149]
结果显示，rt-raa与rt-pcr只能检测到稀释103倍的植物粗提液(图5(a)和图5(b))，而rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化的检测方法后大大提高了检测灵敏度(图5(c)和图5(d))。
[0150]
实施例8基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化的检测rsmv的试剂盒的水稻叶片样本特异性检测
[0151]
一、实验方法
[0152]
为了考察基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化的检测方法对rsmv检测的特异性，分别选取感染rsmv、srbsdv、rgdv、rrsv、rolp的水稻叶片以及健康对照为没有病毒侵染的水稻叶片。植物粗提液作为样本，通过荧光检测结果和跑胶结果确定其特异性，具体检测方法同实施例7。
[0153]
二、实验结果
[0154]
特异性检测中除感染rsmv的水稻植株外，其他均没有检测出明显的荧光信号，证明了该检测方法对rsmv检测的特异性(图5(e)和图5(f))。因为田间rsmv主要由介体昆虫电光叶蝉传播，因此对田间电光叶蝉进行带毒检测，有助于对病害的发生发展作一个初步的判断。
[0155]
实施例9基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化的检测rsmv的试剂盒的饲毒的电光叶蝉样本的特异性检测
[0156]
一、实验方法
[0157]
挑选实验室饲毒的电光叶蝉10头并提取rna，编号1～10代表不同电光叶蝉。分别用rt-pcr和rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测方法进行检测，具体检测方法同实施例7。
[0158]
二、实验结果
[0159]
结果发现，用rt-pcr检测时，1号和9号没有明显条带(图5(g))，但用基于rt-raa与crispr-cas12a可视化检测方法时发现，1号和9号也能检测到荧光，只是荧光强度相对较弱，阴性对照无明显荧光(图5(h)和图5(i))。以上结果说明基于rt-raa与crispr-cas12a可视化检测方法能有效检测带毒的电光叶蝉，且灵敏度高于传统的rt-pcr检测。
[0160]
实施例9基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测rsmv试剂盒的田间应用
[0161]
一、实验方法
[0162]
在广东广西不同地区采集具有疑似病害症状的水稻样品，用实施例6的试剂盒对样品进行检测，并以rt-pcr结果作为对照，比较两种不同方法的检测效果。
[0163]
取具有疑似病害症状的植株叶片，放入1.5ml试管，并在试管中加入2颗直径为3.175mm的钢珠和400μl配置好的粗提液buffer进行充分研磨，取2μl粗提液实施例6的试剂盒进行检测，检测流程见图6，同时用rt-pcr方法检测，具体检测方法同实施例7。
[0164]
二、实验结果
[0165]
采集疑似感病植株样品，分别用上述方法和rt-pcr进行检测，并统计检测数据。统计结果发现，本发明建立的检测方法与rt-pcr的检出率基本一致，表明该方法具有较高的有效性(表2)。
[0166]
表2两种方法对田间rsmv的检出比对
[0167][0168][0169]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测水稻条纹花叶病毒的组合物，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no:1～2所示的检测引物和核苷酸序列为cccccccc所示的ssdna荧光探针。2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述ssdna荧光探针5’端标记fam基团，3’端标记bhq1基团。3.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述组合物还含有核苷酸序列如seq id no:3所示的crrna。4.权利要求1到3任一所述的组合物在制备水稻条纹花叶病毒检测试剂盒中的应用。5.一种基于rt-raa与crispr-cas12a结合的可视化检测水稻条纹花叶病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1～3任一所述组合物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有植物粗提液buffer、rt-raa扩增试剂、和/或cripsr-cas12a检测试剂中的一种或几种。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有植物粗提液buffer、rt-raa扩增试剂、和cripsr-cas12a检测试剂。8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，植物粗提液buffer为含有60ml/l peg 200和20mm naoh的ddh2o。9.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，rt-raa扩增试剂为rt-raa反应干粉、buffer a和/或buffer b中的一种或几种。10.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，cripsr-cas12a检测试剂为lbcas12a和/或10
×
enhanced buffer的一种或两种。

技术总结
本发明公开了一种可视化检测水稻条纹花叶病毒的试剂盒，所述试剂盒基于RT-RAA与CRISPR-Cas12a结合的，含有基于RT-RAA与CRISPR-Cas12a结合的可视化检测水稻条纹花叶病毒的组合物，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的检测引物、核苷酸序列为FAM-CCCCCCCC-BHQ1的ssDNA荧光探针以及核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的crRNA。该试剂盒具有检测特异性好，灵敏度高，可视化，无需专业实验室仪器设备等优点；对感病水稻和单头传毒昆虫进行检测，检测效果均优于RT-PCR，且适用于田间快速检测。快速检测。快速检测。


技术研发人员：张彤 王俊凯 黄秀琴 杨新 周国辉
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.12.14
技术公布日：2023/8/14