一株芽孢杆菌及其在制备功能性棕榈粕饲料中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体的是，涉及了一株自然筛选的芽孢杆菌及其在制备功能性棕榈粕饲料中的应用。


背景技术：

2.棕榈粕(palm kernel cake,pkc)是棕榈果实榨油后的残粕。棕榈仁含油量高，是一种良好的油料作物，棕榈油的大量提取带来了大量的pkc。pkc因产量巨大，价格低廉，营养成分适宜，已逐步应用于奶牛、肉牛、猪、兔、家禽饲料工业中。中国是世界第一大肉类消费国。而畜牧业生产过程中对粮食的需求及其巨大，其需求量对粮食生成产生了巨大的压力，因此畜牧业对价格低廉的高品质饲料产生了巨大的需求。由于pkc中的抗营养因子组分含量较高，所以目前在饲料中只能少量添加；降低棕榈粕的纤维素、半纤维素和其它抗营养因子的含量，提升其功能性指标、小分子蛋白、多肽和粗蛋白的含量，是目前迫待解决的问题，目前可用于pkc的主要处理方法有：物理法、化学法、物理化学方法和生物法，采用物理和化学的方法处理易造成环境污染，与其相比，生物法消耗的能量更少，污染更少，而且生物法能够得到许多功能性产物，一定程度上能够提高动物的免疫力和生产指标。因此使用生物法制备棕榈粕饲料对缓解我国饲料资源短缺，降低饲料成本，促进畜牧业可持续发展具有非常重要的意义。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明的目的在于提供了一株芽孢杆菌及其在制备功能性棕榈粕饲料中的应用。
4.技术方案：本发明所述的一株自然筛选的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的序列为序列表中的no.1所示的全基因序列。
5.进一步的，所述芽孢杆菌的筛选步骤：
6.将筛得的31株菌株用对应培养基活化2次，然后用灭菌的牙签在羧甲基纤维素钠培养基和魔芋甘露聚糖培养基平板上分别进行点种试验，37℃下培养48h。在羧甲基纤维素钠平板和魔芋甘露聚糖培养基平板上使用0.5％刚果红溶液染色30min，倒掉刚果红染液，加入1％氯化钠溶液，脱色处理10min，倒掉氯化钠溶液，用蒸馏水冲洗两遍后观察降解圈，测量并计算讲解圈hc值，根据hc值确定选用的菌株(芽孢杆菌)；将筛得菌株进行全基因测序。
7.进一步的，一株芽孢杆菌在制备功能性棕榈粕饲料中的应用。
8.进一步的，使用筛得芽孢杆菌制备功能性棕榈粕饲料：
9.准确称取60℃干燥12h的15g过40目筛棕榈粕置于50ml锥形瓶内，重复数个备用，于121℃灭菌20min；
10.将测序完成芽孢菌株用lb培养基活化2次后,按照菌液与棕榈粕质量比10％，料液比1:1添加适量无菌水，并充分搅匀，并设置相同条件对照组，置于37℃恒温恒湿培养箱中
发酵48h；
11.发酵结束后，分别取1g湿棕榈粕样品测定其活菌数和抑菌活性，取5g湿棕榈粕样品提取功能性产物，测定其dpph自由基清除率、羟基自由基清除率、活菌数、抑菌活性；其余样品60℃干燥12h，测定其还原糖、可溶性蛋白、多肽、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪。
12.有益效果：本发明与现有技术相比，本发明的特点是：1、本发明首次研究该芽孢杆菌的对棕榈粕抗营养因子的降解能力，首次研究该芽孢杆菌对发酵棕榈粕功能性产物的提升能力；2、使用本发明所述方法，可使棕榈粕发酵后产物提取物在1.6mg/ml时dpph自由基清除率达到了88.53％，在3.2mg/ml时羟基自由基清除率达到了62.02％；常规指标方面，相较于对照组，其还原糖提升了76.98％，可溶性蛋白含量提升了23.34％，多肽含量提升了16.06％，粗蛋白含量提升了26％，粗纤维含量降低了16.5％，粗脂肪含量提升了4.09％。
附图说明
13.图1是本发明中dpph自由基清除能力的对比图；
14.图2是本发明中羟基自由基清除能力的对比图。
具体实施方式
15.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
16.试验材料和试剂
17.1、试验菌株：
18.(1)、乳酸菌菌株：双歧杆菌、mf1、mf2、mf3、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌1、植物乳杆菌2；
19.(2)、芽孢杆菌菌株：芽孢杆菌a、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、内源菌1、内源菌2、内源3、解淀粉芽孢杆菌、y8、rf1、lf1、rn3、rn4、2301、2302、gyb6
20.(3)、酵母菌菌株：布拉氏酵母、安琪酵母、酿酒酵母、yf1、yf2、pf3、yf4；
21.2、培养基：
22.(1)、mrs培养基：蛋白胨1.0％，酵母膏0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2.0％，磷酸氢二钾0.2％，乙酸钠0.5％，柠檬酸三铵0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％，吐温-80 0.1％；
23.(2)、mrs改良培养基(mrs-碳酸钙)：mrs培养基中添加2.0％无水碳酸钙；
24.(3)、ypd培养基：蛋白胨2.0％，酵母膏1.0％，葡萄糖2.0％；
25.(4)、lb培养基：蛋白胨1.0％，酵母膏0.5％，氯化钠1.0％；
26.(5)、羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素钠(cmc-na)1.5％，硝酸铵0.1％，酵母膏0.1％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸镁0.05％；
27.(6)、甘露聚糖培养基：魔芋粉1％、硝酸钠0.3％、硫酸镁0.5％、氯化钾0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸亚铁0.001％；
28.(7)、刚果红溶液：准确称取刚果红固体粉末0.5g，放入100ml蒸馏水中，搅拌溶解，过滤除菌后，置于4℃冰箱中备用；
29.(8)、氯化钠溶液：准确称取5.85g的氯化钠，放入100ml蒸馏水中，搅拌溶解；
30.上述所有培养基配制完成后，mrs培养基和ypd培养基于115℃、其余于121℃灭菌20min。
31.实施例1：纤维素和甘露聚糖降解菌株筛选
32.将上述31株菌株用对应培养基活化2次，然后用灭菌的牙签在羧甲基纤维素钠培养基和魔芋甘露聚糖培养基平板上分别进行点种试验，37℃下培养48h；在羧甲基纤维素钠平板和魔芋甘露聚糖培养基平板上使用0.5％刚果红溶液染色30min，倒掉刚果红染液，加入1％氯化钠溶液，脱色处理10min，倒掉氯化钠溶液，用蒸馏水冲洗两遍后观察降级圈，测量并计算讲解圈hc值，根据hc值确定选用的菌株；如表1所示，该菌株具有良好的纤维素和甘露聚糖降解能力，其纤维素降解圈hc值达到2.28，甘露聚糖降解圈hc值达到2.03，显著高于其它菌株。
33.表1本专利芽孢杆菌对纤维素和甘露聚糖降解能力
[0034][0035]
实施例2：本发明所示芽孢杆菌制备功能性棕榈粕饲料
[0036]
准确称取60℃干燥12h的15g过40目筛棕榈粕置于50ml锥形瓶内，重复数个备用，于121℃灭菌20min；将测序完成芽孢菌株用lb培养基活化2次后，按照菌液与棕榈粕质量比10％，料液比1:1添加适量无菌水，并充分搅匀，并设置相同条件对照组，置于37℃恒温恒湿培养箱中发酵48h。
[0037]
实施例3：发酵样品的功能性产物制备
[0038]
将本发明所示芽孢杆菌进行活化，待菌体生长到对数期时，于lb培养基中，于37℃、180rpm摇床振荡，培养16h，得到培养液；将培养液按照与棕榈粕质量比10％，料液比1:1添加适量无菌水，并充分搅匀，置于37℃恒温恒湿培养箱中发酵48h；所得发酵产物用去离子水于60℃等按照1:10的体系水浴浸提3h，使用冷冻离心机4℃、8000rpm离心20min，取上清，将上清置于旋转蒸发仪浓缩至约10ml，将浓缩液倒入一次性无菌平板，在-80℃冰箱冷冻3h，然后立即取出使用预冷至-55℃的真空冷冻干燥机内冷冻干燥24h，得到本发明所示芽孢杆菌发酵棕榈粕后的功能性产物，使用密封袋并置于0℃冰箱内于干燥保存。
[0039]
实施例4：发酵产物功能性指标测定
[0040]
dpph自由基清除率测定：将冷冻干燥保存的功能性产物分别稀释为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml、4.8mg/ml、6.4mg/ml的水溶液，取各梯度1ml样品和1ml配置完成的0.2mm/l的dpph溶液10mlep管中，并使用去离子水设置空白组，避光反应30min，在od
517
下测定吸光度；如图1，发酵后产物提取物在1.6mg/ml时dpph自由基清除率达到88.53％，具有较好的dpph自由基清除能力。其清除率计算如下：
[0041]
dpph
·
自由基清除率(％)＝[1-a/b]
·
100
[0042]
a：样品组；b：空白对照组
[0043]
羟基自由基清除率测定：取各梯度溶液1ml，分别加入1ml浓度为9mm的硫酸亚铁溶液，1ml浓度为9mm水杨酸-乙醇溶液(70％)，混匀后加入1ml浓度为9mm的h2o2溶液，并使用去离子水设置空白组，37℃避光反应30min，在od
510
下测定吸光度；如图2，在3.2mg/ml时羟基自由基清除率达到了62.02％，相对于对照组具有显著提升；其清除率计算如下：
[0044]
羟基自由基清除率(％)＝[1-a/b]
·
100
[0045]
a：样品组；b：空白对照组
[0046]
发酵产物的抑菌活性测定：取od
600
为0.4-0.6大肠杆菌液体培养基200ul涂布在lb平板上，干燥后放置直径为6mm滤纸片；取1g湿棕榈粕加2ml灭菌生理盐水，混匀后取20ul滴定在滤纸片上,并设置3组平行，37℃静置倒放培养24h，测定抑菌活性；发酵产物对大肠杆菌的三个平行抑菌圈为：12.2mm、10.9mm、9.9mm，其抑菌圈比值分别为：2.03、1.82、1.65，平均比值为1.83，棕榈粕发酵产物对大肠杆菌具有较好的抑制作用。
[0047]
发酵后棕榈粕cmc酶活测定：称量1g的发酵样品，向其中加入10ml的柠檬酸缓冲液，在28℃下以180rpm的转速下振荡1h，在转速为8000rpm的离心机中4℃离心10min，得到粗酶液，取4支25ml刻度试管编号(1号为空白对照，2、3、4号为试验组三个平行)，各加入1.5mlcmc-na柠檬酸缓冲液(ph5.0)。1号试管中加入0.5ml灭活后的适当稀释的粗酶液，作为空白对照，2、3、4号试管各加入0.5ml适当稀释的粗酶液；将4支试管振荡混匀后同时在50℃水浴保温30min，取出立刻加入3mldns溶液终止酶解反应，并置于沸水中加热5min，结束后流水中冷却至常温，加蒸馏水定容至25ml，在540nm处测定2、3、4号试管液的吸光值，根据绘制的葡萄糖标准曲线，计算出各试液中反应生成的还原糖含量及其cmc酶活；如表2，发酵完成后其cmc酶活为6.73u/g。
[0048]
发酵后棕榈粕滤纸酶活测定：测定取4支25ml刻度试管编号(1号为空白对照，2、3、4号为试验组三个平行)，各加入一枚定性滤纸条(1cm
×
5cm)、1.5mlph5.0柠檬酸缓冲液；1号试管中加入0.5ml灭活后的适当稀释的粗酶液作为空白对照，2、3、4号试管各加入0.5ml适当稀释的粗酶液。将4支试管振荡混匀后同时在50℃水浴保温60min，其余步骤同cmc酶活测定；根据绘制的葡萄糖标准曲线，计算出各试液中反应生成的还原糖含量及其滤纸酶活；如表2，发酵完成后其滤纸酶活为1.74u/g；
[0049]
表2本专利芽孢杆菌对棕榈粕cmc酶活和甘露聚糖酶活
[0050][0051]
发酵后棕榈粕甘露聚糖酶活：取4支25ml刻度试管编号(1号为空白对照，2、3、4号
为试验组三个平行)，各加入1.5ml角豆胶缓冲液。1号试管中加入0.5ml灭活后的适当稀释的粗酶液，作为空白对照，2、3、4号试管各加入0.5ml适当稀释的粗酶液，50℃预热5min；将4支试管振荡混匀后同时在50℃水浴保温30min，取出立刻加入3mldns溶液终止酶解反应，并置于沸水中加热5min，结束后流水中冷却至常温，加蒸馏水定容至25ml，保鲜膜封口上下颠倒摇晃5次左右混匀；在反应中有可能出现浑浊，如果出现浑浊需要离心后再测空白对照组调零，在540nm处测定2、3、4号试管液的吸光值，根据绘制的甘露糖标准曲线，计算出各试液中反应生成的还原糖含量及其甘露聚糖酶活；如表2，发酵完成后其甘露聚糖酶活为0.56u/g。
[0052]
发酵后湿棕榈粕的活菌数测定：发酵完成后在超净工作台取1g湿棕榈粕加已灭菌并装有10ml生理盐水和4-5颗玻璃珠的50ml锥形瓶内，37℃、250rpm振荡60min，取匀溶液1ml，稀释至10-7
涂布在lb固体培养平板上，并设置3组平行，37℃静置倒放培养24h，测定其活菌数；其单菌数分别为124、86、94，取均值101.33，可得每克发酵完成的棕榈粕中活菌数为：1.0133x109个/g，具有较高的活菌数。
[0053]
实施例5：发酵产物常规指标测定
[0054]
发酵产物的还原糖测定：将发酵完成的棕榈粕样品去纱布置于60℃烘箱烘干12h；取1g烘干样品，加入10ml沸水，混匀后置于37℃，180rpm摇床振荡15min，取出混匀后取2ml置于ep管中，4000rpm离心10min，取0.5ml上清液置于试管中，加入0.5ml去离子水，再加入0.75mldns，混匀后沸水浴5min，冷却后定容至12.5ml，混匀后取200ul置于96孔酶标板，测定其od
540
的读数，根据还原糖标曲计算样品的还原糖含量；如表3，其还原糖产量为49.1mg/ml，相对于对照组其还原糖提升了76.98％。
[0055]
发酵产物可溶性蛋白测定：取1g已烘干棕榈粕置于50ml离心管，加入10ml去离子水，置于37℃，180rpm振荡1h，4000rpm离心10min，留取全部上清。取上清0.1ml，加入5ml考马斯亮蓝g-250蛋白反应试剂，混匀后静止反应2min，取200ul置于96孔酶标板，测定其od
595
的读数，根据可溶性蛋白标曲计算样品的可溶性蛋白含量；见表3，相对于对照组其可溶性蛋白含量提升了23.34％；
[0056]
表3本专利芽孢杆菌发酵棕榈粕前后常规营养指标
[0057][0058]
发酵产物的多肽测定：取1g烘干棕榈粕样品，加入9ml去离子水、10ml浓度为10％的三氯乙酸溶液，混匀静止30min，离心取上清1ml，加入4ml去离子水，5ml双缩脲试剂，混匀避光反应30min，取200ul置于96孔酶标板，测定其od
540
的读数，根据多肽标曲计算样品的多
肽含量；见表3，相对于对照组其多肽含量提高27.77％。
[0059]
发酵产物的粗蛋白测定：参照gb/t 6432-2018。如表3，相对于对照组其粗蛋白提升了26％。
[0060]
发酵后棕榈粕产物的粗纤维测定：参照gb/t 6434-2006。如表3，相对于对照组其粗纤维降低了16.5％。
[0061]
发酵后棕榈粕产物的粗脂肪测定：参照gb/t 6433-2006。如表3，相对于对照组其粗脂肪提高了4.09％。
[0062]
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
[0063]
一株芽孢杆菌及其在制备功能性棕榈粕饲料中的应用1
[0064]
1442
[0065]
dna
[0066]
贝莱斯芽孢杆菌
[0067]1[0068]
tgcggcgtgctatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtt agc60
[0069]
ggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccggg aaa120
[0070]
ccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggct tcg180
[0071]
gctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctca cca240
[0072]
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[0073]
ccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgac gga360
[0074]
gcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaag aac420
[0075]
aagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggcta act480
[0076]
acgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggc gta540
[0077]
aagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccgggga ggg600
[0078]
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[0079]
gaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaa ctg720
[0080]
acgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccg780
[0081]
taaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcatt 840
[0082]
aagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcc 900
[0083]
cgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtct 960
[0084]
tgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtgg1020
[0085]
tgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaa1080
[0086]
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[0087]
cggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgt 1200
[0088]
gctacaatgggcagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatct 1260
[0089]
gttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatc 1320
[0090]
gcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacacc 1380
[0091]
acgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggagccagccgccgaagtg 1440
[0092]
aa1442

技术特征：
1.一株芽孢杆菌，其特征在于：其全基因序列如序列表中的no.1所示。2.根据权利要求1所述的一株芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌的筛选过程具体如下：首先，将筛得的31株菌株用对应培养基活化2次；然后，用灭菌的牙签在羧甲基纤维素钠培养基和魔芋甘露聚糖培养基平板上分别进行点种试验，37℃下培养48h；接着，在羧甲基纤维素钠平板和魔芋甘露聚糖培养基平板上使用0.5％刚果红溶液染色30min，倒掉刚果红染液，再加入1％氯化钠溶液，脱色处理10min，后倒掉氯化钠溶液，用蒸馏水冲洗两遍后观察降解圈；最后，测量并计算讲解圈hc值，根据hc值确定选用的菌株，即芽孢杆菌；再将筛得的芽孢杆菌进行全基因测序。3.如权利要求1所述的一株芽孢杆菌在制备功能性棕榈粕饲料中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述功能性棕榈粕饲料的制备方法如下所示：(1)、首先，将芽孢杆菌进行活化，待菌体生长到对数期时，于lb培养基中振荡并进行培养，从而制得培养液；(2)、将步骤(1)中制得的培养液与预备的棕榈粕原料进行混合，后加入无菌水并进行搅匀，然后置于37℃的恒温恒湿培养箱中进行发酵，得到发酵后的棕榈粕饲料；(3)、将步骤(2)所得的发酵后的棕榈粕饲料用去离子水于60℃的温度中进行浸提，后通过旋转蒸发仪浓缩后，再使用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，最终制得功能性棕榈粕饲料，将制得的产物置于干燥器中保存。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在步骤(1)中，所述振荡的条件是：在37℃、170-190r/min的条件下进行振荡；所述培养的时间是：14-19h。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在步骤(2)中，所述培养液与预备的棕榈粕原料是按质量比10％，料液比1:1的方式进行混合；所述发酵的时间是：48h。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在步骤(3)中，所述发酵后的棕榈粕饲料与去离子水按照1:10的体系浸提3-5h；所述冷冻干燥的时间是：20-26h。

技术总结
本发明公开了一株芽孢杆菌及其在制备功能性棕榈粕饲料中的应用。属于微生物技术领域。该芽孢杆菌在产纤维素酶和甘露聚糖酶筛选试验中的降解圈Hc值分别为2.28、2.03；使用该菌株发酵棕榈粕后各项指标均有提升，在功能性指标方面，其发酵棕榈粕后产物提取物在1.6mg/mL时DPPH自由基清除率达到88.53％，在3.2mg/mL时羟基自由基清除率达到62.02％；发酵完成后，其CMC酶活、滤纸酶活、甘露聚糖酶活分别为6.73U/g、1.74U/g、0.56U/g，活菌数达到1.0133x109个/g，对大肠杆菌的抑菌圈Hc值为1.83；常规指标方面，其还原糖提升了76.98％，可溶性蛋白含量提升了23.34％，多肽含量提升了27.77％，粗蛋白含量提升了26％，粗纤维含量降低了16.5％，粗脂肪含量提升了4.09％。粗脂肪含量提升了4.09％。粗脂肪含量提升了4.09％。


技术研发人员：朱小燕 杨阳 陈伊灵 好善鑫 李相前 刘培 贺帅 金诗语 王士岩
受保护的技术使用者：淮阴工学院
技术研发日：2022.11.25
技术公布日：2023/8/14