一种基于蛋白N端改造来提高外源蛋白表达水平的方法

一种基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法。


背景技术：

2.现阶段针对蛋白自身n端的研究主要集中在绿色荧光蛋白egfp n端的定点突变，随机突变，其中随机突变包括几bp到几十bp不等的核苷酸序列突变；其研究结果大多部分围绕在外源蛋白自身n端突变后，对宿主细胞生长的影响，以及对宿主细胞毒性的影响。但通过蛋白自身n端序列改造来提高外源蛋白的表达水平，相关研究主要集中在对蛋白自身的n端进行突变，缺乏在n段对于蛋白序列进行表达的相关技术。


技术实现要素：

3.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
4.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
5.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其包括如下步骤：构建负载目的基因的质粒：将空载质粒进行酶切处理；对于目的蛋白基因设计上下游引物，进行pcr扩增，然后对pcr扩增后的目的基因酶切处理，使用连接酶连接剪切后空载质粒和扩增后目的蛋白基因；
7.负载目的基因的质粒转入受体菌中：负载目的基因的质粒转入感受态细胞中进行培养；
8.荧光定量分析：将转入成功的受体菌在具有抗生素的培养基中进行培养，通过高通量荧光检测仪测试荧光强度。作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：构建目的基因的质粒中，上下游引物包括原始上下游引物和加工后上下游引物，加工后上下游引物为上游引物中增加n.m序列片段。
9.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：构建目的基因的质粒中，上下游引物包括原始上下游引物和加工后上下游引物，加工后上下游引物为上游引物中增加n.m序列片段。
10.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：原始上下游引物分别如seq id no.6和seq id no.9所示。
11.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：目的基因为蛋白表达基因，其包括egfp和ifna中的一种或两种。
12.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选
方案，其中：空载质粒为pxmj19组成型空载质粒。
13.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：构建负载目的基因的质粒中，剪切酶为hindⅲ和ecorⅰ。
14.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：荧光定量分析中，培养基为lbb+氯霉素抗性的液体培养基。
15.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：构建负载目的基因的质粒中，目的蛋白基因与空载载体的物质的量比为10：1。
16.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：受体菌为杆菌。
17.作为本发明所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法的一种优选方案，其中：受体菌为大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌。
18.本发明有益效果：
19.通过对蛋白n端进行改造，(插入一段9bp长度的核苷酸序列)来改变外源蛋白的表达水平，实现外源蛋白的可调控表达。
20.通过对绿色荧光蛋白egfp的n端第3-5个氨基酸所对应的核苷酸序列(即第7-15bp核苷酸序列)的突变，使得绿色荧光蛋白egfp的荧光表达强度从100000提升到450000，荧光强度提升了4.5倍左右，在针对外源蛋白ifna的表达中，通过western-bblot检测蛋白表达量也有明显提升。
21.区别于对宿主基因、蛋白表达元件如启动子，信号肽等的改造，本发明着眼于蛋白自身n端的核苷酸序列的调控，在常见的调控目的蛋白表达能力技术手段之外，提供了对于n段序列进行修改实现蛋白表达能力提高的方案。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
23.图1为本发明实施例中中制得的pxmj19-egfp质粒图谱；
24.图2为本发明实施例中制得的pxmj19-n.m-egfp质粒图谱；
25.图3为本发明实施例3中制得的荧光试验测定数值；
26.图4为本发明实施例6中测得的凝胶成像系统。
具体实施方式
27.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
28.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
29.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方
id no.9所示，通过引物插入酶切位点；使用estaq聚合酶通过pcr对egfp模板进行反应，pcr反应条件为：94℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共35个循环，72℃保温2min。
46.其中，由上游引物seq id no.7，下游引物seq id no.9，得到n.m-egfp片段1，序列如seq id no.11所示；由上游引物seq id no.8，下游引物seq id no.9，得到n.m-egfp片段2，序列如seq id no.12所示。
47.经产物住回收、连接后，分别得到pxmj19-n.m-egfp质粒1、2。pxmj19-n.m-egfp质粒图谱如图2所示。
48.实施例3
49.本实施例的效果为进行荧光定量分析
50.分别取pxmj19-egfp质粒，pxmj19-n.m-egfp质粒1、2各5ul，本实验室谷氨酸棒状杆菌atcc13032感受态100ul，分别将质粒打入atcc13032感受态中，冰浴10-15mim，1800v电击两次，将质粒与atcc13032感受态的混合液打入lbhis培养基中，46℃水浴6min，30℃摇床恢复培养1.5-2.5h，涂布lbhis+氯霉素抗性的固体培养基平板，30℃培养箱培养24h。
51.lbhis培养基：酵母膏2.5g/l，蛋白胨5g/l，nacl 5g/l，脑心浸出液18.5g/l，山梨醇91g/l。
52.培养24h后的平板菌，挑单菌落在lbb+氯霉素抗性的液体培养基中培养12h，作为菌落的活化阶段，12h后，将活化的菌液转入新的lbb+氯霉素抗性液体培养基发酵24h，通过高通量荧光检测仪测试发酵后的荧光。实验数值如图3所示。
53.与未加入n.m序列的pxmj19-egfp质粒相比，两种pxmj19-n.m-egfp质粒的荧光量菌有程度的提升，未加入n.m序列的质粒发酵后的荧光/od的比值在1000000左右，而加入n.m序列的质粒发酵后的荧光/od的比值在450000左右，最高的荧光量较未突变前增强了4.5倍。
54.实施例4
55.本实施例的效果为构建pxmj19-ifna质粒。
56.1.获得质粒载体：应用pxmj19组成型空载质粒通过快切酶双酶切将载体切开，酶切位点为hindⅲ和ecorⅰ。两种快切酶各5ul，载体质量控制在4500-5000ng之间，green buffer 10ul，最终加ddh2o至100ul。
57.2.获得ifna片段：设计上下游引物，上下游引物序列分别如seq id no.4和seq id no.5所示，通过引物插入酶切位点；使用estaq聚合酶通过pcr对ifna模板进行反应，pcr反应条件为：94℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共35个循环，72℃保温2min。
58.得到ifna片段，序列如seq id no.13所示。再应用takara bio宝日医生物公司快切酶，酶切位点为hindⅲ和ecorⅰ，两种快切酶各3.5-4ul，片段质量在3500-4000ng之间，green buffer 10ul，最终加ddh2o至100ul，得到酶切后的ifna片段产物，使用产物进行柱回收。
59.3.连接：用takara bio宝日医生物公司的t4dna连接酶将ifna片段产物和质粒载体连接成pxmj19-ifna质粒，其中，gd片段产物0.3pmol，载体0.03pmol，buffer 2ul，t4dna连接酶为1ul，最终加ddh2o至20ul，在16℃的条件下连接一小时，获得pxmj19-ifna质粒图
谱如图一所示。
60.4.培养：将pxmj19-ifna质粒转化入由翊圣生物公司提供的dh5α大肠杆菌感受态中，冰浴25min后，42℃水浴热激1min，热激后再冰浴2-3min，转入37℃摇床进行45-60min的恢复培养。恢复培养后，涂布氯霉素抗性的lbb培养基平板(lbb培养基：酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，脑心浸出液10g/l，琼脂粉20g/l)。平板培养12-16h，蓝光仪下进行单菌落的初筛选，对有荧光的单菌落进行液体培养基的培养。(液体培养基lbb：酵母膏5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，脑心浸出液10g/l)培养12-16h，提取2ml菌液进行质粒提取，提取纯化后的质粒通过金唯智公司进行质粒序列测序。
61.实施例5
62.本实施例构建pxmj19-n.m-ifna质粒
63.pxmj19-n.m-ifna质粒构建原理和方法与上述pxmj19-egfp质粒构建方法一致，仅步骤2中存在上下游引物的差异，在上游引物中添加n.m序列片段，具体如下。
64.设计上下游引物，上游引物序列分别如seq id no.2、3所示，下游引物序列如seq id no.5所示，通过引物插入酶切位点；使用estaq聚合酶通过pcr对ifna模板进行反应，pcr反应条件为：94℃预变性3min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸，变性、退火、延伸进行共35个循环，72℃保温2min。
65.其中，由上游引物seq id no.2，下游引物seq id no.5，得到n.m-ifna片段1，序列如seq id no.14所示；由上游引物seq id no.3，下游引物seq id no.5，得到n.m-ifna片段2，序列如seq id no.15所示；
66.实施例6
67.本实施例对于实施例5中制备菌株进行蛋白产物检测分析
68.分别取pxmj19-ifna质粒，pxmj19-n.m-ifna质粒1、2各5ul，atcc13032感受态80-100ul，分别将质粒打入atcc13032感受态中，冰浴10-15mim，1800v电击两次，将质粒与atcc13032感受态的混合液打入lbhis培养基中，46℃水浴6min，30℃摇床恢复培养1.5-2.5h，涂布lbhis+氯霉素抗性的固体培养基平板，30℃培养箱培养24h。
69.lbhis培养基：酵母膏2.5g/l，蛋白胨5g/l，nacl 5g/l，脑心浸出液18.5g/l，山梨醇91g/l。
70.培养24h后的平板菌，挑单菌落在lbb+氯霉素抗性的液体培养基中培养12h，作为菌落的活化阶段，12h后，将活化的菌液转入新的lbb+氯霉素抗性液体培养基发酵24h。取菌液并定量到10od，对定量后的菌液进行细胞破碎的操作(首先将菌液离心，弃上清，用pbs缓冲液清洗；再次离心，弃上清，用pbs缓冲液清洗；利用超声破碎仪进行细胞破碎，破碎周期为3分钟，采用破碎1s，静止2s的破碎方式)，破碎好的蛋白样品按照样品量：buffer＝4:1的比例混合；混合后水浴煮沸5min；利用预制胶进行sds-page的蛋白凝胶电泳实验检测，(120v电压，运行1.5h)；之后进行western-blot实验检测(300ma电压，运行1.5h)。将转模后的模纸用5％的脱脂牛奶孵育1h；再用带有万分之二的his抗体的5％的脱脂牛奶孵育1h，随后用tbst缓冲液清洗3次，可用凝胶成像系统进行成像，如图4所示。
71.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发
明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：包括如下步骤：构建负载目的基因的质粒：将空载质粒进行酶切处理；对于目的蛋白基因设计上下游引物，进行pcr扩增，然后对扩增后的目的基因片段酶切处理，使用连接酶连接剪切后空载质粒和扩增后目的蛋白基因；负载目的基因的质粒转入受体菌中：负载目的基因的质粒转入感受态细胞中进行培养；荧光定量分析：将转入成功的受体菌在具有抗生素的培养基中进行培养，通过高通量荧光检测仪测试荧光强度。2.根据权利要求1所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述构建目的基因的质粒中，所述上下游引物包括原始上下游引物和加工后上下游引物，所述加工后上下游引物为上游引物中增加n.m序列片段。3.根据权利要求2所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述原始上下游引物分别如seq id no.6和seq id no.9所示。4.根据权利要求1所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述目的基因为蛋白表达基因，其包括egfp和ifna中的一种或两种。5.根据权利要求1所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述空载质粒为pxmj19组成型空载质粒。6.根据权利要求1所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述构建负载目的基因的质粒中，剪切酶为hindⅲ和ecorⅰ。7.根据权利要求1所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述荧光定量分析中，所述培养基为lbb+氯霉素抗性的液体培养基。8.根据权利要求1所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述构建负载目的基因的质粒中，目的蛋白基因与空载载体的物质的量比为10：1。9.根据权利要求1所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述受体菌为杆菌。10.根据权利要求9所述的基于蛋白n端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其特征在于：所述受体菌为大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌。

技术总结
本发明公开了一种基于蛋白N端改造来提高外源蛋白表达水平的方法，其包括如下步骤：构建负载目的基因的质粒、负载目的基因的质粒转入受体菌中、荧光定量分析。本发明提供了一种对于蛋白N端改造从而实现对于外源蛋白的表达水平进行提高的方法。水平进行提高的方法。水平进行提高的方法。


技术研发人员：刘秀霞 崔思楠 王雨露 王萌 刘雨婷 吴俊恒 蔡艺庆 杨艳坤 白仲虎
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2022.10.20
技术公布日：2023/8/14