易分散的贮存稳定的生物活性颗粒的制作方法

1.所描述的组合物和方法涉及在易分散的分层颗粒中稳定并递送生物活性剂例如微生物和酶。分层颗粒包含被涂层包围的核心，该涂层包含分布在保护剂基质内的至少一种生物活性剂，其中该保护剂基质包括至少一种多羟基化合物和至少一种磷酸盐化合物，并且其中该核心是水溶性的和快速溶解的。


背景技术：

2.在向农业、畜牧业和人类健康等应用递送有益生物活性剂(例如微生物和酶)时，需要贮存稳定的固体配制品，这些配制品随着最小的搅拌在大约一分钟或更短的时间内容易溶解或分散在水或水性介质中，并且不会产生可能在容器中沉淀或堵塞在喷雾和灌溉系统中使用的筛网、过滤器或喷嘴的不溶性残余物。贮存稳定的生物活性配制品应在环境温度和湿度下维持生存力和功效至少一个月，优选地至少6个月或更长时间，而不需要通过冷冻干燥、干燥剂、或特殊包装等措施使储存湿度或水活度降低至非常低的水平，例如，小于约20％rh或0.20aw。此外，固体配制品优选地是可流动的和无尘的。颗粒优于细粉，细粉分散在水中时往往尘土飞扬或结块。
3.虽然一些酶具有固有热稳定性，但在其他方面适合于在工业或治疗应用中使用的许多有效酶展现出差的热稳定性、氧化稳定性，或除此之外在储存期间容易失去活性。稳定化通常可以通过配制成稳定的液体或颗粒来改善。贮存稳定的酶颗粒是本领域熟知的。已经发现通过不同技术生产的酶颗粒可用于衣物洗涤剂、动物饲料、纺织品加工等，这些酶颗粒在环境或超环境温度和湿度下储存期间展现出优异的酶活性保留，而无需使用专门的包装或干燥剂。
4.可用于赋予改善的储存稳定性的酶造粒工艺和配制方法包括流化床造粒、高剪切造粒、挤出和颗粒化(pfilling)。这些技术描述于文献[1，2]中。例如，wo 1993/07263描述了展现出改善的稳定性以及延迟的释放特征的涂层酶颗粒，该涂层酶颗粒包含核心、酶层和外层，其中至少一层包含乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇。衣物洗涤剂中的颗粒在储存期间展现出优异的稳定性。wo 2007/44968a2描述了稳定持久的具有活性剂(例如酶)的颗粒，这些颗粒包含核心、至少一种活性剂、以及至少一种涂层。所描述的颗粒在环境储存期间表现出优异的稳定性，并且在动物饲料中的蒸汽造粒中也能保持活性。wo 1989/08694描述了在旋转混合器中应用的酶颗粒，该酶颗粒包含含有核心的酶，以及含有脂肪酸的甘油单酯和/或甘油二酯的涂层。洗涤剂中的酶稳定性由于涂层而增强，即使是在包含强漂白剂的洗涤剂中。
[0005]
然而，上述用于生产稳定的酶颗粒同时有利于保护并稳定酶的技术和配制方法采用涂层、粘合剂或赋形剂、一种或多种缓慢溶解高分子量聚合物(例如聚乙烯醇)、疏水化合物(例如甘油单酯和甘油二酯)、不溶性颜料(例如二氧化钛)、和/或不溶性矿物质加工助剂和阻隔材料(例如滑石)，其中任何一种都容易溶解或缓慢分散，或留下易沉淀或在水中分散时可能堵塞或弄脏筛网、过滤器和喷嘴的残余物。
[0006]
微生物的某些微生物结构具有固有稳定性，如强健的营养细胞、或孢子。美国专利号5,929,507描述了一种组合物，通过将微生物和可溶性未交联多糖(如褐藻胶)组合，该组合物适合于稳定用作植物种子接种剂(inoculant)的微生物。褐藻胶包封的效用仅限于热稳定的微生物结构。
[0007]
很多其他有益微生物对温度、湿度和氧气以及其他环境压力敏感，因此有时易于在数小时或数天内迅速失去生存力。通常，已知可以通过在冷藏下、以干燥形式、以低水活度或在湿度和渗透性受控包装中储存来确保或延长活微生物的贮存期。通过干燥工艺(如冻干或冷冻干燥)，通常结合保护剂稳定剂的添加，可将微生物的水活度降低至低水平，如低于0.4、0.2或甚至低于0.1。美国专利号9,469,835描述了一种通过玻璃化工艺稳定各种微生物(包括细菌和真菌)的手段。该专利描述了一种两步干燥工艺，首先是在真空下，在接近零度以下温度从部分冻结浆状物开始干燥，然后在高于40℃的温度干燥，直至达到非常低的含水量和低水活度。已确认此工艺可生产具有显著升高的玻璃化转变温度(tg)的机械稳定泡沫，从而使生物决不会经受和tg一样高的温度。
[0008]
美国专利公开号20140004083公开了用来保存微生物(例如乳酸菌)的冷冻保护体系，通过添加与肌醇按特定范围的比率组合的非还原糖(例如海藻糖)，并且随后冷冻、真空干燥或冷冻干燥组合物以干燥储存。美国专利号9,308,271描述了冷冻保护体系，该体系通过在不存在褐藻胶的情况下添加海藻糖、菊粉和水解酪蛋白，然后冷冻干燥该组合物，并在温度高达35℃且水活度为0.3或更小条件下储存该组合物，从而保存乳酸菌。在微生物组合物已经被冷冻干燥或真空干燥的情况下，可以通过将微生物组合物包装在由具有低水蒸气渗透性的阻隔材料制成的胶囊、瓶子或小袋中来维持其低水活度。
[0009]
已经做出了一些尝试，以提供在环境温度和湿度下而无需冷冻干燥或特殊包装储存期间可保持微生物生存力的组合物。美国专利公开号2012014253描述了组合物和方法，该组合物和方法通过生产包含干燥生物的核心粒子并用吸湿性盐(如磷酸盐的混合物)对该核心粒子进行涂覆来稳定经脱水的微生物。吸湿性盐涂层实际上起着水诱饵的作用，其可以在水分扩散至核心粒子中的经脱水的微生物之前从环境中吸收并捕获水分。尽管这些实例提供了在中等湿度条件下在储存期间稳定性增强的一些证据，但吸湿性盐层将逐渐被所吸收的水份饱和，并最终失去保护湿度敏感微生物不吸收水分进而失去生存力的能力。因此，仍然需要稳健且持久的方式来保持在环境温度和湿度条件下储存的微生物的生存力，而无需特殊包装或采取其他措施来冷冻和维持微生物的低水活度。
[0010]
例如，在农作物应用中，希望提供旨在刺激植物生长或控制植物有害生物和疾病的配制为干燥配制品的生物活性产品，该干燥配制品可以在开放环境中在没有冷藏或防潮包装的情况下储存，然后根据需要首先在水溶液中溶解应用，并然后经由叶面喷雾或滴灌应用于作物。
[0011]
用于在农业中使用的典型的干燥配制品包括可湿性粉末和颗粒，可直接在田间应用或首先稀释以形成可喷至植物上的溶液或悬浮剂。然而，此类粉末和颗粒通常用不溶性材料(如粘土、二氧化硅、云母、滑石、纤维素纤维等)配制，或用高分子量的天然或合成聚合物和粘合剂(如褐藻胶或聚乙烯醇)配制，产生缓慢或不完全分散或溶解的粒子。此类不完全可溶的或缓慢分散的颗粒和粉末易于留下不溶性残余物，该残余物在罐中沉淀或堵塞在农业喷雾和灌溉系统中常用的筛网、过滤器和喷嘴。可湿性粉末通常难以在水中分散，在润
湿时形成块状，并且往往表现出较差的流动性和含尘量。农业中的粉尘是有问题的，因为它们可能代表吸入危险，并且可能需要专门的个人防护设备来确保工人的安全。
[0012]
在畜牧业应用中，有益微生物可以改善健康或预防疾病。希望提供稳定、干燥形式的有益微生物，在将微生物引入饮用水之前，无需特殊包装或冷藏即可在环境温度和湿度下储存数周或数月，或者将微生物混合到具有显著的游离水含量的由玉米或大豆谷物组成的干燥动物饲料糊状物中。用于将有益微生物引入饮用水的干燥配制品应随着最小的搅拌快速溶解，并且不会留下可能在水管中沉淀或堵塞饮水器喷嘴的不溶性残余物。
[0013]
有益微生物也作为益生菌提供，以促进人类健康并预防或对抗疾病。益生菌补充剂通常以干燥形式提供，无论是粉末还是单位剂量形式，如小袋或胶囊。无论哪种特定形式，益生菌补充剂都包装在湿度受控的密封容器中，通常通过使用干燥剂包来维持，并且典型地建议冷藏储存或储存在阴凉干燥的地方。对于通过在水或饮料中添加粉末或其他干燥形式来服用的补充剂，快速溶解和不结块将是有利的。
[0014]
对于食品应用，通常掺入微生物以提供益生菌益处。在潮湿或点心棒等食物中，掺入的微生物必须在环境条件下保持存活，持续数月或更长时间。益生菌微生物也可以掺入宠物食品(如粗磨食物)中。在这些应用中，通常不提供冷藏储存或特殊包装来防潮。
[0015]
在上述应用中适合用作有益试剂的微生物包括任何细菌、酵母或真菌，并且可以包含多种不同的细胞形态(包括营养细胞、菌丝体、芽孢/孢子或孢囊)。根据特定的物种，这些形态中的某些形态可以具有显著增强的储存稳定性。例如，许多细菌和真菌物种产生的孢子可在长时间的休眠期(数月甚至数年)期间保持生存力，直到在萌发条件下重新活化。
[0016]
但是，许多微生物结构在环境条件下，即，温度高于约10℃(最典型为20℃-30℃)以及湿度高于约10％rh(最典型为30％-60％rh)，在长时间储存时，即超过一天(最典型为3-52周)不能保持活力。例如，很多营养细菌细胞、真菌孢子和真菌微核菌在这些条件下均未显示延长的生存力。
[0017]
需要用于微生物和酶等生物活性剂的贮存稳定的配制品，以及生产此类配制品的工艺，以确保在环境条件下储存期间，例如在不需要冷藏、湿度控制或特殊包装的条件下，生物活性剂的改善的生存力和稳定性，并且同时例如，随着最小的搅拌在不到一分钟的时间内，提供快速溶解或分散的方便产品形式，并且不会留下在罐中沉淀或堵塞在工业应用中常用的筛网、过滤器和喷嘴的残余物。


技术实现要素：

[0018]
描述了与涂覆的颗粒有关的组合物和方法，这些颗粒由被涂层包围的核心组成，该涂层含有分布在保护剂基质内的至少一种生物活性剂，该保护剂基质包括至少一种多羟基化合物以及至少一种磷酸盐化合物。核心和保护剂基质是水溶性的和快速溶解的。
[0019]
颗粒的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
[0020]
1.在一个方面，分层颗粒，其包含被涂层包围的核心，该涂层包含分布在保护剂基质内的至少一种生物活性剂，其中该保护剂基质包含：(a)至少一种多羟基化合物；以及(b)至少一种磷酸盐化合物；并且其中该至少一种多羟基化合物、该至少一种磷酸盐化合物、以及该核心是水溶性的且快速溶解的。
[0021]
2.在如段落1所述的颗粒的一些实施例中，该核心在20℃下在去离子水中具有至
少1克/升的溶解度。
[0022]
3.在如段落1或2所述的颗粒的一些实施例中，当在25℃下，以500rpm搅拌，在100ml烧杯中将0.5克的颗粒添加至50ml的水中时，该核心在不到一分钟内完全溶解或分散。
[0023]
4.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该核心是蔗糖。
[0024]
5.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该至少一种多羟基化合物是麦芽糖糊精。
[0025]
6.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该至少一种多羟基化合物是蔗糖或海藻糖。
[0026]
7.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，至少一种磷酸盐化合物是磷酸钾盐。
[0027]
8.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该核心包含该颗粒的至少25％w/w。
[0028]
9.在一些实施例中，如前述段落中任一项所述的颗粒包含在该保护剂基质之上或之下的另外的快速溶解的一个或多个涂层。
[0029]
10.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该颗粒是流化床喷涂的颗粒。
[0030]
11.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该至少一种生物活性剂是微生物。
[0031]
12.在如段落11所述的颗粒的一些实施例中，该微生物是属于选自由以下组成的组的属中的任一个的一个或多个：芽孢杆菌属(bacillus)、类芽孢杆菌属(paenibacillus)、乳杆菌属(lactobacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、埃希氏菌属(escherichia)、葡糖杆菌属(gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(gluconacetobacter)、醋酸杆菌属(acetobacter)、链球菌属(streptococcus)、甲基杆菌属(methylobacterium)、泛菌属(pantoea)、假单胞菌属(pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、短小杆菌属(curtobacterium)、诺尔氏菌属(knoellia)、马赛菌属(massilla)、土地杆菌属(pedobacter)、斯科曼氏球菌属(skermanella)、梭菌属(clostridia)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、科萨克氏菌属(kosakonia)、螺菌属(spirillum)、链霉菌属(streptomyces)、盾壳霉属(coniothyrium)、螺旋聚孢霉属(clonostachys)、或无色杆菌属(achromobacter)、酵母属(saccharomyces)、有孢汉逊酵母属(hanseniaspora)、毕赤酵母菌属(pichia)、威克汉姆酵母属(wickerhamonmyces)、棒孢酵母属(clavispora)和/或德巴利氏酵母属(debaryomyces)、木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)、短梗霉属(aureobasidium)、细基格孢属(ulocladium)、产气霉属(muscodor)、绿僵菌属(metarhizium)、白僵菌属(beauveria)、拟青霉属(paecilomyces)、棒束孢属(isaria)、和蜡蚧菌属(lecanicillium)。
[0032]
13.在如段落11所述的颗粒的一些实施例中，该微生物是葡萄糖杆菌(gluconobacter cerinus)和/或葡萄有孢汉逊酵母(hanseniaspora uvarum)。
[0033]
14.在如段落1-10中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该至少一种生物活性剂是酶。
[0034]
15.在如段落14所述的颗粒的一些实施例中，该酶是属于选自由以下组成的组的类别中的任一个的一个或多个：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、岩藻糖苷酶、氧化酶、过氧化物酶、还原酶、转移酶和转谷氨酰胺酶。
[0035]
16.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该颗粒包装在具有低水蒸气透过率的包装材料内。
[0036]
17.在如段落16所述的颗粒的一些实施例中，该具有低水蒸气透过率的包装材料是
[0037]
18.在如前述段落中任一项所述的颗粒的一些实施例中，该颗粒与干燥剂一起包装。
[0038]
19.在如段落18所述的颗粒的一些实施例中，该干燥剂是分子筛。
[0039]
根据包括任何附图或图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
附图说明
[0040]
图1展示了本发明的易分散的贮存稳定的生物活性颗粒的结构和组成。颗粒包括被涂层包围的快速溶解的核心，该涂层含有分布在保护剂基质内的生物活性剂。
[0041]
图2展示了具有任选另外的涂层的易分散的贮存稳定的生物活性颗粒的结构和组成。
具体实施方式
[0042]
i.定义和缩写
[0043]
在详细地描述本发明的组合物和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
[0044]
如本文所用，“核心”是可以在流化床喷涂机或其他适合的涂层装置中应用涂层的粒子。
[0045]
如本文所用，“涂覆”或“应用涂层”是指喷洒或以其他方式接触液体进料悬浮剂，以蒸发水和其他挥发性组分，从而在表面或底物上沉积一整层的干燥或凝结的固体。
[0046]
如本文所用，“涂层”是上述工艺产生的层。
[0047]
如本文所用，“保护剂混合物”是包含一种或多种多羟基化合物和一种或多种磷酸盐化合物的水溶液，目的是在颗粒的涂层中稳定一种或多种生物活性剂。
[0048]
如本文所用，“基质”是涂层中的干燥材料，其中生物活性剂分布在该涂层中。
[0049]
如本文所用，“保护剂基质”是在涂层中干燥保护剂混合物而产生的基质。
[0050]
如本文所用，“悬浮剂”是包含溶解和/或不溶解的固体的水溶液和/或分散体。
[0051]
如本文所用，“悬浮固体”或简称“固体”是指根据astm(美国材料与试验协会)的确定生物质中总固体的标准测试方法(standard test method for determination of total solids in biomass)，方法e1756-01或类似方法，通过红外烘箱或微波水分平衡在不过热的情况下操作确定的水性悬浮剂中所有可溶性和不溶性固体的重量(g)或百分比(％w/w)。这也对应于在涂层和干燥后将沉积在流化床涂覆的颗粒上的固体质量，占进料悬浮剂原始质量的百分比。
[0052]
如本文所用，“水分含量”或“水含量”是指根据astm的确定生物质中总固体的标准测试方法，方法e1756-01或类似方法，通过红外烘箱或微波水分平衡在不过热的情况下操作确定的固体材料中水的重量(g)或百分比(％w/w)。
[0053]
如本文所用，“生物活性剂”或“生物活性”是具有生物活性的微生物或酶，例如催化生物化学反应，产生生物活性代谢产物，抑制、杀死或以其他方式控制病原体，促进营养利用，中和毒素或以其他方式相互作用以积极影响活植物、动物或微生物的健康或生存力的能力。
[0054]
如本文所用，“微生物(microorganism或microbe)”是任何细菌、真菌或酵母。
[0055]
如本文所用，“酶”是具有催化活性的蛋白质。
[0056]
如本文所用，“生物活性发酵悬浮剂”或简称“发酵悬浮剂”是发酵肉汤或衍生自发酵肉汤的材料，该发酵肉汤包含一种或多种生物活性剂以及衍生自该发酵肉汤的任何可溶性或不溶性介质组分、代谢物或其他杂质。
[0057]
如本文所用，“生物活性发酵固体”或简称“发酵固体”是在涂层和干燥工艺中水蒸发之前或之后，生物活性发酵肉汤中的悬浮固体。
[0058]
如本文所用，“进料悬浮剂”是在核心上涂覆的悬浮剂或溶液，该悬浮剂或溶液包含生物活性发酵悬浮剂和保护剂混合物的组合。
[0059]
如本文所用，“水溶性”化合物是在20℃下在去离子水中溶解度至少为1克/升的化合物。
[0060]
如本文所用，“完全溶解”是在将固体的水性悬浮剂倒入具有210-μm目(即70号)的筛子后，留下少于1％的原始固体作为残余物。
[0061]
如本文所用，“快速溶解的”化合物或组合物是当在25℃下，以50rpm搅拌，在100ml烧杯中将0.5g的化合物添加至50ml的水中时，在不到一分钟内完全溶解或分散的化合物或组合物。
[0062]
如本文所用，“粒度”是指通过筛分分析或相关技术(如激光散射或图像分析)测量的粒子群体的中位直径。
[0063]
如本文所用，“heubach粉尘”是指iii型heubach粉尘计(heubach粉尘计有限公司(heubach dustmeter gmbh)，萨尔茨堡，奥地利)产生的粉尘。heubach测试通过使用旋转桨将钢球滚动穿过包含在圆柱形室内的颗粒床，并同时通过床渗透气流以去除产生的任何粉尘，从而使粒子经受定义的破碎和流化力。产生的粉尘通过管被真空吸入，并且沉积在heubach室外的过滤垫上。收集的粉尘的重量或活性组分称为heubach粉尘。
[0064]
如本文所用，“包装材料”是指围绕产品(例如本发明的颗粒)的包装或连续外壳的组合物。作为动词，“包装”是封装在包装材料中。
[0065]
如本文所用，“低水蒸气透过率”或“wvtr”是指在37℃和90％rh下水蒸气透过率低于约1g-mm/m2/24小时。具有低水蒸气透过率的包装材料的实例包括：hdpe、pet、和铝。不能提供适当低水蒸气透过率的包装材料的实例包括纸、和铝。不能提供适当低水蒸气透过率的包装材料的实例包括纸、ps、和pvc。
[0066]
如本文所用，“干燥剂”是指用作干燥剂的吸湿性物质，以降低或限制本发明的颗粒等产品的水活度。适合的干燥剂具有在相对湿度低于约30％rh下吸收水的高能力。适合的干燥剂的实例包括分子筛、硅胶、氧化钙和硫酸钙。
[0067]
如本文所用，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“该/所述(the)”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过援引以其全文特此并入。除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
[0068]
aw水活度
[0069]
℃摄氏度
[0070]
cfm立方英尺/分钟
[0071]
cfu菌落形成单位
[0072]d50
重量平均中值直径
[0073]
f进料溶液中的总固体(可溶性和不溶性两者)
[0074]
g克
[0075]
gpm克/分钟
[0076]
hr小时
[0077]
l升
[0078]
mg毫克
[0079]
min分钟
[0080]
ml毫升
[0081]
mm毫米
[0082]
mm毫摩尔
[0083]
psig磅/平方英寸，标准尺寸
[0084]
rh相对湿度
[0085]
rpm转数/分钟
[0086]
sec秒
[0087]
tg玻璃化转变温度
[0088]
％w/w重量/重量百分比，也简单指定为％除非另有定义
[0090]
y喷雾产量，也称为涂层效率
[0091]
um微米
[0092]
hdpe高密度聚乙烯
[0093]
ii.用于稳定微生物的组合物和方法的概述
[0094]
depablo等人的先前专利(us6,653,062和us6,919,172)描述了使用包含至少一种多羟基化合物和磷酸根离子的保护剂混合物以一定的摩尔比在水性介质中或以固体形式保存各种不同的生物材料，例如酶、血细胞或微生物。多羟基化合物可以是例如单糖或单糖。磷酸根离子可以例如以简单的无机磷酸盐(如磷酸钠或磷酸钾)的形式引入。该专利教导了如果需要固体形式，保护剂混合物可以通过多种工艺进行干燥，例如冷冻干燥、环境空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻，并且所得组合物在环境或超环境温度和/或相对湿度下可在延长的时间段内保持稳定。该专利举例说明了使用水溶液保护剂混合物与细菌培养物(例如嗜酸乳杆菌)的组合，并然后进行冷冻、冷冻干燥或真空干燥，并且在37℃或室温下储存在密封小瓶中。包含海藻糖或蔗糖与磷酸盐组合的干燥配制品比单独的细胞显示改善的稳定性。
[0095]
depablo等人假设磷酸根离子经由与羟基相互作用与多羟基化合物形成三维“超
分子结构”。所得保护剂混合物具有比不含磷酸根离子的相应混合物更高的玻璃化转变温度(tg)，导致稳定结构以及水的流动性降低以及涉及游离水的降解机制。ohtake等人[3，4]的出版物进一步证实了这些说法，证明了与纯糖相比，即使在高达37℃的温度和高达40％rh的相对湿度下，摩尔比为0.5∶1或1∶1的蔗糖-磷酸盐和蔗糖-海藻糖混合物在4-9的ph范围内还显示出高达40℃的tg增加，其中残留水分含量高达10％w/w。此外，这些保护剂混合物稳定了细胞上的脂质双层膜。
[0096]
本发明诸位发明人希望确定depablo等人描述的保护剂混合物等组合物是否可以在环境温度和湿度下在延长的储存期间稳定有益微生物，甚至是在密封容器之外。将微生物悬浮剂与多羟基化合物和磷酸盐的混合物组合，并且通过喷雾造粒工艺(可替代地称为喷动床造粒)干燥。
[0097]
在喷雾造粒中，将进料溶液或悬浮剂连续喷入用加热空气供给的流化床中，产生细粒度的初级喷雾干燥粒子。最初的喷雾干燥粒子随后用作核，在其上喷洒、沉积和分层另外的进料，以逐渐堆积并形成干燥颗粒。所得颗粒的最终尺寸可以通过调整工艺条件并且通过连续抽取落在两个筛子之间的所需尺寸截止值范围内的筛分出的颗粒部分来控制。尺寸过小的粒子保留在床中，并且可以将超大的粒子分离、研磨并重新引入床中。因为除了进料之外，没有任何东西被引入喷雾造粒机，所以所得颗粒是均匀的组合物，其只包含由保护剂化合物和微生物悬浮剂的干燥混合物组成的粒子。
[0098]
如实例中所详述的，本发明诸位发明人已经发现喷雾造粒工艺可以生产良好成型的干燥颗粒，这些颗粒包含分布在保护剂基质内的微生物悬浮剂。实例中使用的保护剂基质完全由水溶性多羟基化合物和水溶性来源的磷酸根离子(即蔗糖、麦芽糖糊精、磷酸一钾和磷酸二钾)组成。通过该工艺形成的颗粒具有在约250-2000微米范围内的粒度，并且是自由流动且相对无尘的。这些喷雾造粒的颗粒在环境条件下储存时展现出一个多月的优异的贮存期。
[0099]
然而，尽管各个组分具有溶解度，但使用上述保护剂混合物和微生物悬浮剂生产的干燥微生物颗粒仍然不容易溶解或分散在水或水溶液中。甚至随着搅拌也需要超过一分钟，典型地甚至超过3分钟，才能将喷雾造粒的微生物颗粒甚至随着搅拌完全溶解或分散在水中。对于某些应用，该溶解速率是不够的。
[0100]
本发明提供了颗粒结构和组合物，其同时实现快速溶解或分散性、低残留、在环境条件下延长的贮存期、低粉尘和良好流动性的目的。这一点值得特别注意，因为在水中快速溶解的目标与同时在环境湿度和温度下延长的贮存期的目标之间存在冲突。本发明诸位发明人惊讶地发现，这些同时的目标可以通过分层颗粒来实现，该颗粒包含被涂层包围的核心，该核心包含在保护剂基质内的微生物，其中该保护剂基质包含至少一种多羟基化合物和至少一种磷酸盐化合物。核心可以是任何水溶性和快速溶解的材料，例如蔗糖或硫酸钠。多羟基化合物可以是任何水溶性和快速溶解的多糖、二糖或单糖。例如，多羟基化合物可以是麦芽糖糊精、蔗糖或海藻糖。水溶性磷酸盐可以是任何无机或有机磷酸盐或水溶性和快速溶解的磷酸盐，例如磷酸钾盐，例如磷酸一钾或磷酸二钾。
[0101]
颗粒可以通过任何适合的涂层工艺生产，用于在水溶性基质中应用微生物的涂层。用于产生颗粒的优选的涂层工艺是流化床喷涂。
[0102]
不希望受到理论的束缚，但本发明诸位发明人已经观察到，磷酸根离子和多羟基
化合物的混合物产生水溶液，导致溶液的粘度增加，这与depablo等人根据其升高的玻璃化转变温度推断出的“超分子结构”的形成是一致的。当保护剂混合物干燥成包含生物活性悬浮剂的均匀组合物的粒子时，这种超分子结构仍然存在，并且可以解释再水合时溶解更慢的趋势。
[0103]
本发明的涂覆的结构提供的新元素是掺入水溶性和快速溶解的核心材料如蔗糖。将易分散颗粒加入重力水中后，快速溶解的核心提供强大的驱动力以通过包含保护剂基质的涂层吸入水，从而加速其分散和溶解。如果没有快速溶解的核心，保护剂混合物本身需要显著更长的时间才能水合和完全溶解，因为基质中的保护剂混合物是水溶性的，但自发水合的速度比快速溶解的核心慢。此外，颗粒的分层结构将保护剂基质分布到粒子表面较薄的涂层上，使其比具有单一结构的相应喷雾颗粒更容易且更快溶解，其中大部分保护剂基质埋在粒子表面以下。为了达到这些有益的快速分散和增溶效果，核心应包含涂覆的颗粒的质量的至少25％。
[0104]
应该注意的是，在depablo等人的参考公开中，没有关于使用保护剂混合物生产的固体材料的溶解或分散动力学的观察报告，也没有关于使用涂覆的粒子结构或任何其他非均匀结构来加速或以其他方式改变其溶解和分散动力学的任何建议。因此，本文提供此类数据用于比较。
[0105]
iii.用于在易分散的贮存稳定的颗粒中使用的材料
[0106]
本发明的适合的核心是水溶性的和快速溶解的。由可溶性或不溶性无机盐和/或糖和/或小的有机分子组成的粒子可以用作核心。用于掺入至核心中的适合的水溶性成分包括：糖，例如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖或乳糖；糖醇，例如山梨醇、或甘露醇；多糖，例如麦芽糖糊精或可溶性淀粉；无机盐，例如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、硫酸锌、氯化钠或氯化钾；有机酸，例如柠檬酸、琥珀酸或乳酸；以及渗透剂，例如尿素和甜菜碱等。
[0107]
在保护剂混合物中使用的多羟基化合物包括水溶性化合物、非多糖、二糖和单糖。多糖包括麦芽糖糊精和可溶性淀粉，或衍生自以下的淀粉水解产物：玉米、高粱、竹芋、稻、小麦、黑麦、大麦、燕麦、马铃薯、山药、木薯、树薯、和西米。单糖和二糖包括糖，例如蔗糖、海藻糖和乳糖；或糖醇，例如山梨醇或甘露醇。
[0108]
在保护剂混合物中使用的磷酸盐化合物包括水溶性、快速溶解的无机和有机磷酸盐化合物，例如磷酸钠盐和磷酸钾盐，例如磷酸一钠和磷酸二钠。
[0109]
颗粒可以包含在保护剂基质之上或之下另外的一种或多种涂层，如图2所示。任选的涂层必须包含快速溶解的材料。
[0110]
颗粒包含至少一种生物活性剂。生物活性剂是展现出生物活性的活生物体、或衍生自活生物体的化合物，例如催化生物化学反应，产生生物活性代谢产物，抑制、杀死或以其他方式控制病原体，促进营养利用，中和毒素或以其他方式相互作用以积极影响活植物、动物或微生物的健康或生存力的能力。生物活性剂包括微生物和酶。
[0111]
iv.适合于在易分散的贮存稳定的颗粒中递送的生物活性剂
[0112]
微生物包括任何细菌、酵母或真菌。适合的细菌包括革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，其包括但不限于以下属的细菌：芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、乳杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、葡糖杆菌属、葡糖醋杆菌属、醋酸杆菌属、链球菌属、甲基杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、短小杆菌属、诺尔氏菌属、马赛菌属、土地杆菌属、斯科曼氏球菌
属、梭菌属、克雷伯氏菌属、科萨克氏菌属、螺菌属、链霉菌属、盾壳霉属、螺旋聚孢霉属、和/或无色杆菌属。
[0113]
基质，如图2所示。任选的涂层必须包含快速溶解的材料。
[0114]
适合的酵母包括但不限于以下属的酵母：酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤酵母菌属、威克汉姆酵母属、棒孢酵母属和/或德巴利氏酵母属。
[0115]
适合的真菌包括但不限于以下属的真菌：木霉属、曲霉属、短梗霉属、细基格孢属、产气霉属、绿僵菌属、白僵菌属、拟青霉属、棒束孢属、和/或蜡蚧菌属。
[0116]
适合于在易分散的贮存稳定的颗粒中递送的酶包括但不限于：任何蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、岩藻糖苷酶、氧化酶、过氧化物酶、还原酶、转移酶或转谷氨酰胺酶。酶可以在例如以下的应用中使用：衣物洗涤剂和餐具洗涤剂、纺织品加工、农作物保护、动物健康和营养、或人类健康和营养。
[0117]
v.适合于产生易分散的贮存稳定的颗粒的涂层工艺和设备
[0118]
一般而言，任何涂层工艺或设备都可以用于将进料悬浮剂涂覆至核心上。涂层工艺可以是流化床喷涂工艺，首先在流化气流中引入并悬浮核心，并且喷洒包含有益试剂和可交联聚合物的雾化涂层进料溶液或悬浮剂，以便在涂层进料中的水或其他溶剂蒸发时接触连续的干燥材料层并将其沉积至核心上，从而形成连续的涂层或“外壳”。核心可以是不含有益剂的惰性粒子，或者可替代地包含一种或多种有益剂。
[0119]
流化床喷涂工艺可以使用不同的流化床喷涂涂覆机设备配置进行，其包括顶部喷雾流化床，底部喷雾(也称为wurster)流化床，喷雾团聚，其中这些涂覆核心通过再循环和桥接进一步建立以形成更大的团簇或团聚物，借此将该涂层溶液干燥以产生包含多个核心的粒子，这些粒子通过干燥的涂层溶液桥接。这些流化床工艺可以以分批模式运行，其中将所有核心一次引入流化床，或以连续模式运行，其中连续或定期添加新核心材料并取出。
[0120]
涂层工艺可以通过机械涂覆机经由混合或搅拌工艺进行，其中通过将涂层溶液喷洒或使其流动到通过各种方式(例如在摩擦处翻滚或旋转)进行剧烈搅拌的核心上来涂覆核心粒子，以实现涂层的沉积、铺展和干燥。机械涂覆机包括可以使用不同设备配置进行的混合和搅拌过程，例如鼓式造粒机、混合造粒机、带式共混机、v型共混机、双壳共混机、锥形共混机、圆锥(nauta)混合机和其他锥形螺旋混合机、高剪切造粒机、搓圆机、旋转造粒机等。
[0121]
实例
[0122]
以下实例旨在说明但不限制本发明的组合物和方法。
[0123]
实例1.含有生物活性剂的颗粒的生产
[0124]
第一批颗粒，指定为“颗粒a”，通过流化床批量喷涂生产。颗粒a由葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的发酵固体以及赋形剂蔗糖、麦芽糖糊精、kh2po4、k2hpo4和ca3(po4)2组成。
[0125]
为了制备颗粒，进行了葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的共发酵，并使用离心机将大约30l所得发酵肉汤浓缩2.8倍，将干燥固体百分比从6％提高到17％。vector vfc-lab1流化床喷涂机(freund-vector，马里恩，爱荷华州，美国)装有650g颗粒蔗糖核心，中值直径(d
50
)为410μm。将含微生物的浓缩物与蔗糖、麦芽糖糊精、kh2po4和k2hpo4的灭菌溶液混合。用于溶液制剂的麦芽糖糊精是glucidex premium 12麦芽糖糊精(罗盖特，莱斯特雷姆，法国)。
组成。
[0135]
为了制备颗粒，进行了葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的共发酵，并使用离心机将大约20l所得发酵肉汤浓缩2.5倍，将干燥固体百分比从6％提高到15％。glatt procell labsystem 5组件(格拉特公司(glatt gmbh)，魏玛，德国)装有100g麦芽糖糊精。将在离心机上制备的含微生物的浓缩物与蔗糖、麦芽糖糊精、kh2po4和k2hpo4的灭菌溶液混合。用于溶液制剂的麦芽糖糊精是glucidex premium 12麦芽糖糊精(罗盖特，莱斯特雷姆，法国)。使用procell labsystem 5使用15-22g/min之间的喷雾速率将所得混合物在连续流化床工艺中喷雾造粒。在喷雾造粒工艺期间，流化床中的温度保持在50℃-55℃之间，并且相对湿度保持在10％-25％之间。流化空气保持在140-150m3/h之间，并且雾化气压保持在4.2-4.7巴之间。将颗粒从喷雾造粒组件中取出到塑料容器中，并且与1g ca3(po4)2作为抗结块剂一起振荡。
[0136]
成品颗粒d含有大约33％发酵固体、17％蔗糖、22％麦芽糖糊精、11％kh2po4、17％k2hpo4和少于1％ca3(po4)2。大约500g的颗粒d通过该工艺产生。颗粒d的d
50
是1,600μm。通过铺板证实了颗粒a中葡萄糖杆菌高于10
10 cfu/g以及葡萄有孢汉逊酵母高于109cfu/g的生存力。
[0137]
另一批颗粒，指定为“颗粒e”，通过流化床连续喷雾造粒生产。颗粒e由葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的发酵固体、以及赋形剂pva、滑石、和海藻糖组成。
[0138]
为了制备颗粒，进行了葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的共发酵，并使用离心机将大约40l所得发酵肉汤浓缩2.6倍，将干燥固体百分比从5％提高到13％。glatt procell labsystem 5组件装有100g麦芽糖糊精。将发酵肉汤与pva、海藻糖和滑石的灭菌悬浮剂混合，并使用procell labsystem 5在连续流化床工艺中以18-25g/min的喷雾速率进行喷雾造粒。在喷雾造粒工艺期间，流化床中的温度保持在45℃-50℃之间，并且相对湿度保持在20％-30％之间。流化空气保持在140-150m3/h之间，并且雾化气压保持在4.2-4.7巴之间。
[0139]
成品颗粒e由大约11％发酵固体、25％pva、51％滑石、和13％海藻糖组成。大约600g的颗粒e通过该工艺产生。颗粒e的d
50
是760μm。通过铺板证实了颗粒e中葡萄糖杆菌高于108cfu/g以及葡萄有孢汉逊酵母高于106cfu/g的生存力。
[0140]
另外的颗粒，指定为“颗粒f”，根据描述于depablo等人的专利(us 6,653,062和us 6,919,172)的方法通过冷冻干燥生产。颗粒由乳酸双歧杆菌(bifidobacterium lactis)的发酵固体、以及赋形剂蔗糖、kh2po4、和k2hpo4组成。将混合物冷冻干燥以产生粒度范围在1-5mm内的颗粒。通过铺板证实了颗粒f中乳酸双歧杆菌的生存力高于10
11
cfu/g。
[0141]
获得另外的颗粒，指定为“颗粒g”。颗粒g是商业固体产品bioworks rootshield plus wp(bioworks公司，维克多，纽约)的样品，其含有微生物哈茨木霉t-22和绿木霉g-41，并且旨在用于农业应用，其包括需要将颗粒分散在水中的应用，包括灌溉或喷洒。
[0142]
另外的颗粒，指定为“颗粒h”，通过流化床批量喷涂生产。颗粒h由基因修饰的过表达植酸酶的里氏木霉变体的发酵固体、以及赋形剂na2so4、聚乙烯醇(pva)和滑石组成。
[0143]
为了制备颗粒，vector vfc-lab1流化床喷涂机装有600g的na2so4核心，d
50
为220μm。床温度在42℃-45℃之间，喷雾速率在8-10gpm之间，流化空气在50-52cfm之间，以及雾化空气在30-35psig之间，将一层与pva混合的发酵固体喷涂到核心上。随后床温度在47℃-52℃之间，喷雾速率在8-12gpm之间，流化空气在51-53cfm之间，以及雾化空气在37-42psig之
间，将一层与滑石混合的pva以18％的总干燥固体比率喷涂到核心上。随后床温度在36℃-55℃之间，喷雾速率在25-30gpm之间，流化空气在53-54cfm之间，以及雾化空气在37-42psig之间，将一层na2so4从25％溶液中喷涂到核心上。随后床温度在47℃-52℃之间，喷雾速率在8-12gpm之间，流化空气在51-53cfm之间，以及雾化空气在37-42psig之间，将一层与滑石混合的pva以18％的总干燥固体比率喷涂到核心上。
[0144]
成品颗粒h由大约8％发酵固体、5％pva、7％滑石、和80％na2so4组成。大约2200g的颗粒h通过该工艺产生。颗粒h的d
50
是240μm。所得植酸酶颗粒展现出的植酸酶活性高于104个植酸酶转移单位/克(ftu/g)，如通过针对植酸酶的标准孔雀石绿磷酸盐测定测量的。
[0145]
实例2.易分散颗粒与可替代的稳定化学成分相比的溶解速率
[0146]
使颗粒a、b、和c经受溶解测试。在溶解测试的单次试验中，将50ml的自来水分配到烧杯中。测量烧杯底部的内径为42mm。使用椭圆形塑料涂覆的磁力搅拌棒，长度为25mm，以500转/分钟(rpm)的搅拌速率搅拌样品。将颗粒的500-mg等分试样一次性添加至烧杯中，并且启动秒表。在预先选择的时间段后，停止磁力搅拌，并且将材料通过210-μm目(即70号)的筛子。如果筛子上没有保留固体材料，则记录颗粒在该时间点“溶解”。如果筛子上保留任何固体材料，则记录颗粒在该时间点“未溶解”。实验是在环境条件下进行的，在实验室中，在实验过程期间温度维持在22℃-24℃之间，并且湿度维持在50％-60％之间。
[0147]
在1至5分钟之间的不同时间点对每个样品重复上述溶解测试五次。记录每个样品在每个时间点的溶解结果数量。认为在较早时间点具有更多溶解结果的样品比具有较少溶解结果的样品更易溶解。颗粒a、b和c的溶解实验结果总结于表1中。
[0148]
表1.颗粒a、b和c的溶解结果
[0149][0150]
表1结果显示颗粒a和颗粒b的溶解速度显著快于颗粒c。在所述条件下，颗粒a和b在搅拌约1分钟内完全溶解，而颗粒c需要混合3分钟或更长时间才能完全溶解。尽管颗粒a(570μm)和颗粒b(610μm)的粒度都比颗粒c(420μm)更大，但这一结果还是如此。尽管颗粒b存在另外的外部保护性na2so4涂层，但这一结果也还是如此。蔗糖-磷酸盐-麦芽糖糊精配制品显然比pva-滑石-海藻糖配制品溶解得更快。因此，蔗糖-磷酸盐-麦芽糖糊精涂覆的颗粒
配制品更适合于一系列应用，包括农业或动物营养，其中商业应用现场的混合能力可能有限，并且快速溶解是至关重要的。
[0151]
实例3.易分散颗粒与使用可替代的干燥方法生产的类似赋形剂化学品相比的溶解速率
[0152]
颗粒a、b、d和f分别使用描述于实例2的溶解方案进行测试。所有四种颗粒均含有微生物固体、蔗糖、和k2hpo4、和kh2po4。结果总结在表2中。
[0153]
表2.含微生物颗粒a、b、d和f的溶解结果
[0154][0155]
表2的结果显示颗粒a和b比颗粒d溶解得更快。在所述条件下，颗粒a和b典型地在搅拌1分钟内完全溶解，而颗粒d需要2-3分钟的搅拌才能完全溶解。显然，单独的赋形剂化学成分并不能决定颗粒的溶解速率。生产方法和颗粒结构也决定了颗粒的溶解速度。事实上，尽管添加了保护性na2so4涂层，但颗粒b的溶解速度至少与颗粒a一样快。在农业或动物营养等应用中，其中应用现场的混合能力可能有限，快速溶解是至关重要的，并且易分散颗粒(如颗粒a或b)显著优于颗粒d。
[0156]
表2的结果另外显示颗粒a和b比颗粒f溶解得更快。尽管化学成分相似，在所述条件下，颗粒a和b典型地在搅拌1分钟内完全溶解，而颗粒f需要10分钟才能完全溶解。大质量分数的颗粒f(至少90％)在溶解测试中似乎快速溶解。然而，在大多数溶解测试中，在210-μm筛子上积聚了一到五个较大的团聚结构。只有在搅拌10分钟后，这些较大的结构才开始分散，在进行溶解测试时使筛子没有固体。
[0157]
含有生物活性剂的颗粒(如颗粒a和f)的实际应用可以涉及分配比这些测试中使用的500mg大得多的量。在颗粒f溶解中观察到的团聚物可能会积聚在混合罐的底部，并导致定量配料问题或需要另外的清洁。在农业喷雾等应用中，团聚物可能会积聚在喷雾罐的网状过滤器上，并导致递送中管线堵塞或喷嘴堵塞。在人类或动物对颗粒的消耗等其他应用、或农业的犁沟内应用中，团聚物的存在可能不构成问题。然而，在许多应用中，颗粒a和b的快速且完全溶解是非常优选的。
[0158]
实例4.易分散颗粒与可替代的生产方法相比的含尘量
[0159]
使用iii型heubach粉尘计(heubach，法里斯山，宾夕法尼亚州)测定颗粒a、b、d、f和g的含尘量。根据体积密度将样品按体积加载至16.25ml填充体积到研磨室中。该程序设
置为以45rpm运行20分钟。气流是20l/min。称量积聚的粉尘并记录为样品重量的百分比。针对颗粒a、b、d、f、和g的测量的粉尘水平总结在表3中。
[0160]
表3.颗粒a、f和g的heubach iii粉尘结果
[0161]
颗粒heubach iii粉尘水平颗粒a0.7％颗粒b0.8％颗粒d1.0％颗粒f2.8％颗粒g7.1％
[0162]
表3的结果显示颗粒a和b是所测试颗粒中粉尘最少的，并且粉尘显著低于颗粒f和g。使用易分散颗粒配制品的配制品比使用冷冻干燥配制品的配制品粉尘更少，冷冻干燥配制品是保持活微生物生存力的常见方法。旨在用于在农业中使用的可商购的颗粒g也是多尘的。在三种颗粒中，具有实例1中所述的分散性的另外的益处的颗粒a和b，也是粉尘最少的颗粒。低粉尘水平对于定量配料、清洁和安全性是优选的。
[0163]
实例5.易分散颗粒与可替代的干燥方法和可替代的化学成分相比的微生物稳定性
[0164]
通过稀释铺板测试颗粒a、d和e中葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的生存力。每个生存力测试都根据以下方案进行。将每个颗粒的0.3-g等分试样溶解在5.7g水中。将所得悬浮剂连续稀释，并且将适当的稀释液均匀分布在含有琼脂介质(针对葡萄糖杆菌，pda琼脂；针对葡萄有孢汉逊酵母，ypd琼脂)的皮氏培养皿表面。将接种的琼脂板在25℃下在培养箱中孵育3天。在此期间，来自发酵固体的活微生物结构在板上形成菌落。对菌落进行计数，并且以菌落形成单位/克颗粒(cfu/g)报告。
[0165]
为了测试颗粒中微生物随时间的稳定性，在25℃和55％的相对湿度下将颗粒的5-g等分试样保存在培养箱中的15-ml管中。根据以上方案定期测试颗粒中微生物的生存力。结果列于下表4和表5中。
[0166]
表4.含葡萄糖杆菌微生物的颗粒a、d和e的微生物稳定性结果
[0167][0168]
表5.含葡萄有孢汉逊酵母微生物的颗粒a、d和e的微生物稳定性结果
[0169][0170]
表4和表5的结果显示与颗粒e相比，颗粒a和d对活生物体具有更好的稳定性。与pva-滑石-海藻糖配制品相比，蔗糖-磷酸盐-麦芽糖糊精配制品为两种微生物提供了改善的稳定性特性。颗粒a和d的生存力主要保持6周，而颗粒e的生存力到第4周已丧失。如上所述，与颗粒d和e相比，颗粒a具有另外的益处，即改善的溶解度和降低的粉尘。
[0171]
实例6.通过包装延长易分散颗粒的微生物稳定性
[0172]
将五份20-g等分试样的颗粒a以五种配置中的每种储存10天：(1)在30℃、75％相对湿度下在敞口容器中；(2)在30℃、75％相对湿度下在密封的、可溶性pva袋子中；(3)在30℃、75％相对湿度下在密封的、可溶性的pva袋子中，该袋子密封在mylar袋子内；(4)在30℃、75％相对湿度下在密封的、可溶性的pva袋子中，该袋子密封在具有硅胶包作为干燥剂的mylar袋子内(uline公司，普莱森特草原(pleasant prairie)，威斯康星州，美国)；(5)在25℃、55％相对湿度下在封闭管中，对照条件。在这些条件下孵育10天后测量颗粒的生存力。生存力结果描述于表6中。
[0173]
表6.在不同储存条件下葡萄有孢汉逊酵母和葡萄糖杆菌的微生物稳定性结果
[0174][0175]
表6的结果显示包装方案可用于在极端、超环境温度和湿度条件下保持易分散颗粒a的生存力，这些条件会对颗粒施加另外的应力。另外，当包装在mylar袋中时，颗粒保留其优秀的流动性和溶解性特性。样品1和2结晶严重，不可流动，并且可溶性差。样品3和4易于流动，并且具有与样品5相当的溶解度特性。包装方案允许在高温、超环境温度和湿度储
存条件下保持易分散颗粒的有利特性。
[0176]
实例7.含酶的易分散颗粒
[0177]
根据实例2中描述的溶解方案测试颗粒a和h。溶解测试的结果描述于表7中。
[0178]
表7.含微生物颗粒a和h的溶解结果
[0179][0180]
表7的结果显示颗粒a比颗粒h更易溶解。颗粒a在1分钟内很容易溶解，而颗粒h需要3-5分钟才能完全溶解。颗粒a的较高溶解度将使该配制品更适合各种应用。
[0181]
将颗粒h的等分试样置于密闭容器中，并在30℃、65％相对湿度条件下储存。在这些条件下储存6周后，使用针对植酸酶的标准孔雀石绿磷酸盐测定来测量植酸酶活性，并且确定保留了80％-85％的酶活性。实例7中的微生物稳定性结果表明，所描述的配制品和包装方案将允许生产具有类似稳定性特性但改善的分散特性的含酶颗粒。
[0182]
实例8.用包装和干燥剂将易分散颗粒的微生物稳定性延长数月
[0183]
将十份20-g等分试样的颗粒a以两种配置储存52周：(1)在25℃、55％相对湿度下在加盖塑料管中(康宁公司，康宁，纽约，美国)；(2)在25℃、55％相对湿度下在密封的mylar袋子中，该袋子还含有一包作为干燥剂的以10％的颗粒质量的量的13x分子筛(wisesorbent公司，马尔顿，新泽西州，美国)。在指定的时间间隔后打开单个等分试样，测量葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的生存力，并且丢弃所采样的等分试样。生存力结果描述于表8中。
[0184]
表8.在25℃、55％相对湿度下在不同储存条件下葡萄有孢汉逊酵母和葡萄糖杆菌的微生物稳定性结果
[0185][0186]
表8的结果显示包装方案(例如储存在具有分子筛的mylar中)可用于在25℃和55％相对湿度下保持易分散颗粒a的生存力。在采样的所有时间点，当颗粒a包装在具有分子筛干燥剂的mylar袋子中时，葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的生存力显著更高。储存52周后，对于葡萄糖杆菌，在加盖塑料管中储存的颗粒中的微生物的生存力下降了1个数量级以上，而对于葡萄有孢汉逊酵母下降了3个数量级以上。相比之下，对于两种微生物，在具有干燥剂的mylar中储存的颗粒中的微生物的生存力都下降了不到半个数量级。
[0187]
实例9.用包装和干燥剂延长易分散颗粒在极端应力条件下的微生物稳定性
[0188]
将五份20-g等分试样的颗粒a以两种配置储存52周：(1)在54℃、75％相对湿度下在密封的mylar袋子中；(2)在54℃、75％相对湿度下在密封的mylar袋子中，该袋子还含有一包作为干燥剂的以10％的颗粒质量的量的13x分子筛(wisesorbent公司，马尔顿，新泽西州，美国)。在指定的时间间隔后打开单个等分试样，测量葡萄糖杆菌和葡萄有孢汉逊酵母的生存力，并且丢弃所采样的等分试样。生存力结果描述于表9中。
[0189]
表9.在54℃、75％相对湿度下在不同储存条件下葡萄有孢汉逊酵母和葡萄糖杆菌的微生物稳定性结果
[0190][0191]
表9的结果显示包装方案(例如储存在具有分子筛的mylar袋子中)可用于在54℃
research，21(9)(2004)1615-1621.
[0203]
[4]s.ohtake，c.schebor，s.p.palecek，j.j.de pablo，cryobiology 48(2004)81-89.

技术特征：
1.一种分层颗粒，其包含被涂层包围的核心，所述涂层包含分布在保护剂基质内的至少一种生物活性剂，其中所述保护剂基质包含：a.至少一种多羟基化合物；以及b.至少一种磷酸盐化合物：并且其中该至少一种多羟基化合物、该至少一种磷酸盐化合物、以及该核心是水溶性的且快速溶解的。2.如权利要求1所述的颗粒，其中所述核心在20℃下在去离子水中具有至少1克/升的溶解度。3.如权利要求1或2所述的颗粒，其中当在25℃下，以500rpm搅拌，在100ml烧杯中将0.5克的颗粒添加至50ml的水中时，所述核心在不到一分钟内完全溶解或分散。4.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述核心是蔗糖。5.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述至少一种多羟基化合物是麦芽糖糊精。6.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述至少一种多羟基化合物是蔗糖或海藻糖。7.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中至少一种磷酸盐化合物是磷酸钾盐。8.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述核心包含至少25％w/w的所述颗粒。9.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其包含在所述保护剂基质之上或之下的另外的快速溶解的一个或多个涂层。10.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒是流化床喷涂的颗粒。11.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述至少一种生物活性剂是微生物。12.如权利要求11所述的颗粒，其中所述微生物是属于选自由以下组成的组的属中的任一个的一个或多个：芽孢杆菌属(bacillus)、类芽孢杆菌属(paenibacillus)、乳杆菌属(lactobacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、埃希氏菌属(escherichia)、葡糖杆菌属(gluconobacter)、葡糖醋杆菌属(gluconacetobacter)、醋酸杆菌属(acetobacter)、链球菌属(streptococcus)、甲基杆菌属(methylobacterium)、泛菌属(pantoea)、假单胞菌属(pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、短小杆菌属(curtobacterium)、诺尔氏菌属(knoellia)、马赛菌属(massilla)、土地杆菌属(pedobacter)、斯科曼氏球菌属(skermanella)、梭菌属(clostridia)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、科萨克氏菌属(kosakonia)、螺菌属(spirillum)、链霉菌属(streptomyces)、盾壳霉属(coniothyrium)、螺旋聚孢霉属(clonostachys)、或无色杆菌属(achromobacter)、酵母属(saccharomyces)、有孢汉逊酵母属(hanseniaspora)、毕赤酵母菌属(pichia)、威克汉姆酵母属(wickerhamonmyces)、棒孢酵母属(clavispora)和/或德巴利氏酵母属(debaryomyces)、木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)、短梗霉属(aureobasidium)、细基格孢属(ulocladium)、产气霉属(muscodor)、绿僵菌属(metarhizium)、白僵菌属(beauveria)、拟青霉属(paecilomyces)、棒束孢属(isaria)、和蜡蚧菌属(lecanicillium)。13.如权利要求11所述的颗粒，其中所述微生物是葡萄糖杆菌和/或葡萄有孢汉逊酵母。14.如权利要求1-10中任一项所述的颗粒，其中所述至少一种生物活性剂是酶。
15.如权利要求14所述的颗粒，其中所述酶是属于选自由以下组成的组的类别中的任一个的一个或多个：蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、岩藻糖苷酶、氧化酶、过氧化物酶、还原酶、转移酶和转谷氨酰胺酶。16.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒包装在具有低水蒸气透过率的包装材料内。17.如权利要求16所述的颗粒，其中所述具有低水蒸气透过率的包装材料是18.如前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒与干燥剂一起包装。19.如权利要求18所述的颗粒，其中所述干燥剂是分子筛。

技术总结
描述了与分层颗粒有关的组合物和方法，这些颗粒包含被涂层包围的核心，该涂层含有分布在保护剂基质内的生物活性剂，其中该保护剂基质包括至少一种多羟基化合物以及至少一种磷酸盐化合物。该核心和该保护剂基质是水溶性的且快速溶解的。且快速溶解的。且快速溶解的。


技术研发人员：N
受保护的技术使用者：丹尼斯科美国公司
技术研发日：2021.10.06
技术公布日：2023/8/13