一种生物除臭复合菌剂及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及环境保护治理技术领域，具体涉及一种生物除臭复合菌剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.在臭气处理技术领域中，生物滴滤塔因其成本低、能耗低、运行管理方便等优点而被广泛使用。生物滴滤塔去除恶臭污染物的原理是：臭气中的恶臭污染物质被附着在生物滴滤塔填料表面的微生物捕获利用，一部分转化成co2、h2o等小分子物质，一部分转化为能量供微生物自身增长繁殖，从而达到去除臭气中恶臭污染物的目的。
3.生物滴滤塔去除效率的高低取决于微生物对恶臭污染物的降解利用能力。
4.当前生物滴滤塔的菌种来源多为自然驯化而来，由于微生物世代周期长，驯化周期长，而存在调试周期长的问题；同时臭气污染组分单一容易造成驯化后的菌群结构单一，生物多样性较低，稳定性较差，造成生物滴滤池抵抗异常工况(停水、停电、长时间检修等)或高温、寒冷、冰冻等恶劣环境能力较差。
5.因此，亟需提供一种生物除臭复合菌剂，以便克服生物滴滤塔驯化调试启动周期长、抵抗异常工况能力较差、抗恶劣环境能力较差的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种生物除臭复合菌剂及其制备方法与应用，以便解决生物滤池启动周期长、稳定性差等问题。
7.一方面，本发明提供了一种生物除臭复合菌剂，由第一菌剂和第二菌剂按照体积比(1～5)：(3～10)组成；
8.其中，所述第一菌剂包括枯草芽孢杆菌和嗜酸硫杆菌，菌液浓度是1
×
106～1
×
109cfu/ml；所述第二菌剂包括分枝杆菌，菌液浓度是1
×
104～1
×
106cfu/ml。
9.可选地，所述第一菌剂与所述第二菌剂的体积比是(1～2)：(5～10)，优选是2:5。
10.可选地，所述第一菌剂的菌液浓度是1
×
106～1
×
108cfu/ml，优选是1
×
107cfu/ml。
11.可选地，所述第二菌剂的菌液浓度是5
×
104～6
×
105cfu/ml，优选是1
×
105cfu/ml。
12.可选地，在所述第一菌剂中，枯草芽孢杆菌和嗜酸硫杆菌的菌落比例是(7～8)：(1～5)，优选是(7～8)：(2～3)。
13.另一方面，本发明提供了一种生物除臭复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
14.(1)分别进行发酵培养获得分枝杆菌培养液、枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液；
15.(2)将枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液混合，向得到的混合菌液中加入经过灭菌的炭质填料，进行培养，得到第一菌剂；
16.(3)将经过灭菌的炭质填料加入到分枝杆菌培养液中，进行培养，得到第二菌剂。
17.可选地，在步骤(2)中，枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液的体积百分比分别是70-80％和20-30％，枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液之和为100％，炭质填料的加入比例是每升混合菌液加入50～100克炭质填料；在步骤(3)中，炭质填料的加入比例是每升分枝杆菌培养液加入50～100克炭质填料。
18.可选地，所述炭质填料的直径是5～10mm，比表面积不低于250m2/g，表面为亲水性。
19.另一方面，本发明提供了一种生物除臭复合菌剂的使用方法，依次包括如下步骤：
20.步骤一，将第一菌剂接种至生物滤池靠近进气侧的下半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第一菌剂；
21.步骤二，将第二菌剂接种至生物滤池远离进气侧的上半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第二菌剂；
22.优选地，所述使用方法依次包括如下步骤：
23.步骤一，将第一菌剂中的炭质填料分散在生物滤池靠近进气侧的下半层，将第一菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行1天至2天；
24.步骤二，将第二菌剂中的炭质填料分散在生物滤池远离进气侧的上半层，将第二菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行3天至4天。
25.另一方面，本发明提供了一种生物除臭复合菌剂的使用方法，依次包括如下步骤：
26.步骤一，将第一菌剂接种至生物滤池靠近进气侧的上半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第一菌剂；
27.步骤二，将第二菌剂接种至生物滤池远离进气侧的下半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第二菌剂；
28.优选地，所述使用方法依次包括如下步骤：
29.步骤一，将第一菌剂中的炭质填料分散在生物滤池靠近进气侧的上半层，将第一菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行1天至2天；
30.步骤二，将第二菌剂中的炭质填料分散在生物滤池远离进气侧的下半层，将第二菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行3天至4天。
31.由上述技术方案可知，本发明的生物除臭复合菌剂及其制备方法与应用，至少具有如下有益效果：
32.本发明的生物除臭复合菌剂与炭质填料的生物相容性好，接种之后容易成为优势菌种。
33.与自然驯化的生物滤池相比，接种本发明生物除臭复合菌剂的生物滤池能够快速完成驯化和启动，并且，除臭效率可提高20％～40％。
34.接种本发明的生物除臭复合菌剂可以显著缩短生物滤池调试周期，增强生物滤池对寒冷、炎热等恶劣环境和长时间闲置、停水停电、检修等异常工况的抵抗能力。
附图说明
35.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明
的限制。在附图中：
36.图1是实施例1筛选得到的3株纯菌，即分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌，降解硫单质过程中硫单质浓度的变化曲线；
37.图2是实施例1筛选得到的3株纯菌，即分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌，降解硫单质过程中硫酸根离子浓度的变化曲线；
38.图3是实施例1筛选得到的3株纯菌的生长曲线；
39.图4是实施例1中接种生物除臭复合菌剂的生物滤池与自然驯化塔对硫化氢去除情况的对比图；
40.图5是实施例1中接种生物除臭复合菌剂的生物滤池与自然驯化塔对抗冬季恶劣天气影响的对比图。
具体实施方式
41.为充分了解本发明之目的、特征及功效，借由下述具体的实施方式，对本发明做详细说明，但本发明并不仅仅限于此。为了充分了解本发明的目的、特征及功效，通过下述具体实施方式，对本发明作详细说明。本发明的工艺方法除下述内容外，其余均采用本领域的常规方法或装置。
42.第一方面，本发明提供了一种生物除臭复合菌剂，可应用于生物滤池中。该生物除臭复合菌剂由第一菌剂和第二菌剂组成。第一菌剂和第二菌剂的体积比是(1～5)：(3～10)，优选是(1～2)：(5～10)，更优选是2:5。
43.第一菌剂中的除臭菌是枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和嗜酸硫杆菌(sulfobacillus)，二者的菌落比例是(7～8)：(1～5)，优选是(7～8)：(2～3)。第一菌剂的菌液浓度是1
×
106～1
×
109cfu/ml，优选是1
×
106～1
×
108cfu/ml，最优选是1
×
107cfu/ml。
44.第一菌剂中的枯草芽孢杆菌是一种好氧细菌，以有机物、单质硫和连四硫酸盐为电子供体进行生长代谢。枯草芽孢杆菌具有良好的耐酸耐热性能，生存ph值范围2.0～6.0，温度范围20～70℃，当其遭遇不适宜生存的恶劣环境时，便生出芽孢成为休眠体，当环境适宜时再萌生出营养细胞。芽孢可抗干旱，高热，高酸碱、高渗环境。
45.第一菌剂中的嗜酸硫杆菌是一种好氧杆状细菌，具有嗜酸的特性。能够以亚铁、单质硫及硫化物为原料自养生长，在硫氧化过程中，硫化氢、单质硫和亚硫酸盐逐步被氧化降解。
46.第二菌剂中的除臭菌是分枝杆菌(mycobacterium)。第二菌剂的菌液浓度是1
×
104～1
×
106cfu/ml，优选是5
×
104～6
×
105cfu/ml，最优选是1
×
105cfu/ml。
47.第二菌剂中的分枝杆菌是一种好氧放线菌，细胞壁含有大量的脂类，也称为抗酸杆菌，能抵抗强酸环境。分枝杆菌能够利用多种碳源，在少量补充有机养分的情况下就能够矿化降解蒽、菲等多环芳烃。另外，分枝杆菌会产生芳基磺酸酶可以将有机恶臭分子中的硫酸盐官能团降解为游离酚酞和剩余盐。
48.发明人经过研究发现，按照上述浓度和比例将枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌和分枝杆菌制成复合菌剂，各菌在发挥各自功能特性的前提之下还能实现较好的相互配合，从而实现极好的降解硫单质的效果。
49.本发明的生物除臭复合菌剂采用的各菌株可以是在实验室分离纯化得到并进行
保藏与保存的，也可以是通过市场购买获得的商品化的菌株。
50.第二方面，本发明提供了一种生物除臭复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
51.(1)分别进行发酵培养获得分枝杆菌培养液、枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液。
52.分枝杆菌可以采用改良高氏1号液体培养基进行培养。改良高氏1号液体培养基的配方是：硝酸钾1g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，氯化钠0.5g/l，可溶性淀粉20g/l。作为一个实例，分枝杆菌可以采用如下方法进行发酵培养：将分枝杆菌在改良高氏1号液体培养基中转接14次以便进行富集培养，然后按照5％的接种量将富集培养的菌液接种至装有改良高氏1号液体培养基的发酵罐中，在搅拌速度190r/min，温度30℃环境中培养时间0.5天，得到分枝杆菌培养液。当然，分枝杆菌的发酵培养也可以参考现有技术中的其他已知方案。
53.枯草芽孢杆菌可以采用改良高氏2号液体培养基进行培养。改良高氏2号液体培养基的配方是：葡萄糖42g/l，谷氨酸钠14g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水合硫酸亚铁0.15mg/l，水合硫酸锰5mg/l，五水合硫酸铜0.16mg/l，ph7.0。作为一个实例，枯草芽孢杆菌可以采用如下方法进行发酵培养：将枯草芽孢杆菌在改良高氏2号液体培养基中转接14次以便进行富集培养，然后按照5％的接种量将富集培养的菌液接种至装有改良高氏2号液体培养基的发酵罐中，在搅拌速度180r/min，温度32℃环境中培养时间0.5天，得到枯草芽孢杆菌培养液。当然，枯草芽孢杆菌的发酵培养也可以参考现有技术中的其他已知方案。
54.嗜酸硫杆菌可以采9k液体培养基进行培养。9k液体培养基的配方是：硫酸铵3g/l,磷酸氢二甲0.5g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.1g/l，氯化钙6.8mg/l，硝酸钾6.2mg/l，单质硫5g/l，酵母膏0.2g/l。作为一个实例，嗜酸硫杆菌可以采用如下方法进行发酵培养：将嗜酸硫杆菌在9k液体培养基中转接14次以便进行富集培养，然后按照5％的接种量将富集培养的菌液接种至装有9k液体培养基的发酵罐中，在搅拌速度190r/min，温度40℃环境中培养时间4天，得到嗜酸硫杆菌培养液。当然，嗜酸硫杆菌的发酵培养也可以参考现有技术中的其他已知方案。
55.(2)将枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液混合，向得到的混合菌液中加入经过灭菌的炭质填料，进行培养，得到第一菌剂。
56.枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液的投加体积比例分别是70-80％和20-30％，二者之和为100％。
57.炭质填料的直径为5～10mm，比表面积》250m2/g，具有良好的保湿性和透气性，表面为亲水性，具有抗酸性腐蚀，结构稳定，不易板结。炭质填料的灭菌可以是高压蒸汽灭菌。炭质填料的加入比例是每升混合菌液加入50～100克炭质填料。
58.培养条件优选采用枯草芽孢杆菌和嗜酸硫杆菌的最佳培养条件，直至培养至菌液浓度是1
×
106～1
×
109cfu/ml。
59.作为一个优选的实例，采用0.1mpa的压力即103.4kpa(1.05kg/cm2)蒸汽压下，灭菌锅内温度达121℃，维持15～30min的条件对炭质填料进行灭菌，然后，按照50g/l将炭质填料加入到混合菌液(75％枯草芽孢杆菌和25％嗜酸硫杆菌)，在搅拌速度190r/min，温度35℃环境中培养时间约2天，直至培养液中的菌液浓度达1
×
107cfu/ml，得到第一菌剂。
60.(3)将经过灭菌的炭质填料加入到分枝杆菌培养液中，进行培养，得到第二菌剂。
61.炭质填料的直径为5～10mm，比表面积》250m2/g，具有良好的保湿性和透气性，表面为亲水性，具有抗酸性腐蚀，结构稳定，不易板结。炭质填料的灭菌可以是高压蒸汽灭菌。炭质填料的加入比例是每升分枝杆菌培养液加入50～100克炭质填料。
62.培养条件优选采用分枝杆菌的最佳培养条件，直至培养至菌液浓度是1
×
104～1
×
106cfu/ml。
63.作为一个优选的实例，采用0.1mpa的压力即103.4kpa(1.05kg/cm2)蒸汽压下，灭菌锅内温度达121℃，维持15～30min的条件对炭质填料进行灭菌，然后，按照50g/l将炭质填料加入到分枝杆菌培养液，在搅拌速度190r/min，温度30℃环境中培养时间约1天，直至培养液中的菌液浓度达1
×
105cfu/ml，得到第二菌剂。
64.在此应当说明的是，本发明对上述步骤(2)和(3)的先后顺序不作限定，步骤(2)和(3)可以同步进行，先进行步骤(2)、再进行步骤(3)，或者，先进行步骤(3)、再进行步骤(2)，只要不影响后续的使用即可。
65.本发明的生物除臭复合菌剂可应用于各种类型的生物滤池，生物滤池结构可参考现有技术中的相关方案。
66.需要说明的是，本发明的生物除臭复合菌剂在具体使用时需要结合生物滤池的进气口的位置来确定第一菌剂和第二菌剂的具体接种位置，基本的原则是第一菌剂应接种在靠近进气口的半层填料，第二菌剂应接种在远离进气口的半层填料。
67.对于进气口设置在下部的生物滤池，本发明的生物除臭复合菌剂的使用方法依次包括如下步骤：
68.步骤一：将第一菌剂接种至生物滤池靠近进气侧的下半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第一菌剂。
69.具体地，将第一菌剂中的炭质填料均匀分散在生物滤池的下半层，将第一菌剂中的菌液均匀喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行1天至2天。
70.步骤二，将第二菌剂接种至生物滤池远离进气侧的填料上半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第二菌剂。
71.具体地，将第二菌剂中的炭质填料均匀分散在生物滤池填料上远离进气口的的上半层，将第二菌剂中的菌液均匀喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行3天至4天，出口即可达到稳定状态。
72.对于进气口设置在上部的生物滤池，本发明的生物除臭复合菌剂的使用方法依次包括如下步骤：
73.步骤一，将第一菌剂接种至生物滤池上半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第一菌剂。
74.具体地，将第一菌剂中的炭质填料均匀分散在生物滤池的上半层，将第一菌剂中的菌液均匀喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行1天至2天。
75.步骤二，将第二菌剂接种至生物滤池的填料下半层，具体做法为通过周边视窗将菌剂喷射在填料表面，接种量是每万立方米臭气3～10l第二菌剂。
76.具体地，将第二菌剂中的炭质填料均匀分散在生物滤池填料下半层，将第二菌剂中的菌液均匀喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行3天至4天，出口即可达到稳定状态。
77.发明人根据对运行稳定的生物除臭塔不同高度填料层上菌群进行16srrna基因高通量测序结果，第一菌剂中的枯草芽孢杆菌和嗜酸硫杆菌在靠近进气口一侧的半边填料上丰度明显高于远离进气口一侧的半边填料，而第二菌剂中的分支杆菌则相反。基于此，在使用本发明的生物除臭复合菌剂时，将第一菌剂接种至生物滤池靠近进气口的半层、将第二菌剂接种至生物滤池远离进气口的半层。
78.实施例
79.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
80.下述实施例中采用的培养基的配方如下：
81.改良高氏1号液体培养基：硝酸钾1g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸亚铁0.01g/l，氯化钠0.5g/l，可溶性淀粉20g/l，ph7.0。改良高氏1号固体培养基在改良高氏1号液体培养基基础上添加琼脂15g/l。
82.改良高氏2号液体培养基包括：葡萄糖42g/l，谷氨酸钠14g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水合硫酸亚铁0.15mg/l，水合硫酸锰5mg/l，五水合硫酸铜0.16mg/l，ph7.0。2号固体培养基在改良高氏2号液体培养基基础上添加琼脂15g/l。
83.9k液体培养基包括：硫酸铵3g/l,磷酸氢二甲0.5g/l，七水合硫酸镁0.5g/l，氯化钾0.1g/l，氯化钙6.8mg/l，硝酸钾6.2mg/l，单质硫5g/l，酵母膏0.2g/l，ph2.0。9k固体培养基在9k液体培养基基础上添加琼脂15g/l。
84.实施例1
85.(一)菌株的培养和鉴定
86.(1)初始菌种悬浮液样品的制备
87.在运行状态良好的生物滴滤塔床层上、中、底部分别取1g炭质填料，依次标记为填料a、填料b、填料c，用无菌生理盐水浸泡后置于超声波清洗机中超声振动10分钟，过滤去除大块炭质填料后，制得富含除臭菌种的悬浮液a、悬浮液b、悬浮液c。
88.(2)菌种的富集
89.分别取步骤(1)中悬浮液a、b、c中的上清液涂布于改良高氏1号培养基、改良高氏2号培养基、9k培养基中培养3-5d，培养条件30℃，150r/min。3-5d后取5ml液体培养基转接到新鲜的改良高氏1号培养基、改良高氏2号培养基、9k培养基中，相同培养条件培养3-5d，转接14次后得到富集菌液。
90.(3)菌种的初筛
91.取0.1ml步骤(1)中转接14次后的富集菌液接种在固态培养基平板上，用三角涂布棒涂布均匀，在恒温培养箱中培养2天后从平板上挑取有差异的菌落画线，画线分离两次后得到纯菌落并编号。
92.(4)菌种的复筛
93.用挑取步骤(3)中的纯菌落并于液体培养基中培养，48h后制成od
600
值为0.8的菌悬液(取一定量菌液离心分离，并用0.9％生理盐水洗涤2次，然后用生理盐水制成od
600
的菌悬液)。取5ml菌悬液转接到含5g/l硫单质的液体培养基(改良高氏1号培养基、改良高氏2号培养基中分别加入5g/l硫单质，9k液体培养基不额外添加5g/l硫单质)中，另外取5ml灭菌
的生理盐水转接到含5g/l硫单质的液体培养基中，4组培养基置于30℃，150r/min培养箱中培养14天，期间每天测定硫单质浓度和硫酸根离子浓度。
94.(5)菌种的鉴定
95.取富集纯化后的菌液委托上海迈浦生物科技有限公司进行鉴定，改良高氏1号培养基中富集生长的纯菌被鉴定为分枝杆菌属(mycobacterium)，改良高氏2号培养基中富集生长的纯菌被鉴定为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，9k培养基中富集生长的纯菌落被鉴定为嗜酸硫杆菌(sulfobacillus)。
96.将筛选得到的3株纯菌保存于实验室冰箱中。
97.(二)性能检测
98.(1)单质硫去除实验
99.硫单质浓度测定方法：亚甲基分光光度法，其原理是硫离子与对氨基二甲基苯胺在含高铁离子的酸性溶液中生成亚甲蓝染料，在波长665nm处进行吸光度测定，其蓝色与水样中硫离子含量成正比。
100.硫酸根离子浓度测定方法：比浊法，其原理是水中硫酸盐与在酸性介质下与钡离子反应生成硫酸钡悬浮晶体，使溶液浑浊，在波长410nm处进行吸光度测定，其浑浊程度与硫酸根离子浓度成正比。
101.第(一)部分步骤(4)中改良高氏1号培养基、改良高氏2号培养基、9k培养基中富集的分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌对初始浓度为5g/l的单质硫降解效果如图1和图2所示。其中，图1为3种纯菌降解硫单质过程中硫单质浓度的变化曲线，图2为3种纯菌降解硫单质过程中硫酸根离子浓度的变化曲线。
102.由图1可以看出，在第4天，分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌对初始浓度为5g/l的单质硫去除效率分别为62％、70％、100％。
103.(2)最佳发酵条件
104.通过控制变量法研究了3种纯菌的发酵罐培养的最佳工艺参数：
105.分枝杆菌发酵罐培养的最佳工艺参数是搅拌速度190r/min，ph值6，温度30℃，最佳培养时间1天；
106.枯草芽孢杆菌发酵罐培养的最佳工艺参数是搅拌速度180r/min，ph值6.5，温度32℃，最佳培养时间1天；
107.嗜酸硫杆菌发酵罐培养的最佳工艺参数是搅拌速度190r/min、ph值2.0，温度40℃，最佳培养时间5天。
108.(3)生长曲线
109.方法：
110.步骤一，分别测定分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌在改良高氏1号液体培养基、改良高氏2号液体培养基、9k液体培养基中不同时间对应的od
600
值；
111.步骤二，用生理盐水将步骤一中已测定od
600
值的3种不同菌悬液制成浓度梯度为10-1
的稀释菌悬液，并挑选适宜稀释倍数的菌悬液，取0.1ml接种在固态培养基平板上，用三角涂布棒涂布均匀，在恒温培养箱(搅拌速度190r/min，温度32℃)中培养2天后挑选能分离出单菌落的平板计数，并根据稀释倍数计算原菌悬液中所含的细菌数量，单位cfu/ml。
112.分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌3种纯菌的生长曲线如图3所示。
113.通过计算，菌悬液od
600
为0.5时，分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌数量分别是4.6
×
104cfu/ml、3.8
×
106cfu/ml、7.3
×
107cfu/ml。
114.(4)分枝杆菌分泌芳基磺酸酶实验
115.通过如下实验判断芳基磺酸酶存在：在改良高氏1号液体培养基中接种5mlod
600
为0.5的分枝杆菌菌悬液，于振荡速度190r/min，温度30℃中培养2d后，加入5ml 0.1mol/l碳酸钠溶液和5ml 0.2mol/l酚酞二硫酸三钾三水合物(cas号62625-16-5)，摇晃均匀后看到溶液从无色变为红色。这是因为分枝杆菌分泌的芳基磺酸酶可以将酚酞二硫酸三钾三水合物中的硫酸盐分子降解为游离酚酞和剩余盐，加入的碳酸钠与酚酞反应并产生易于看到的红色重氮反应。
116.(三)生物除臭复合菌剂的制备
117.(1)单一菌种的制备
118.在发酵罐a中放入改良高氏1号液体培养基，然后接种5％经过14次改良高氏1号液体培养基转接后初筛后的富含分枝杆菌的菌液，在搅拌速度190r/min，温度30℃环境中培养时间0.5d，得到分枝杆菌培养液。
119.在发酵罐b中放入改良高氏2号液体培养基，然后接种5％经过14次改良高氏改良高氏2号液体培养基转接后初筛后的富含枯草芽孢杆菌的菌液，在搅拌速度180r/min，温度32℃环境中培养时间0.5d，得到枯草芽孢杆菌培养液。
120.在发酵罐c中放入9k液体培养基，然后接种5％经过14次9k液体培养基转接后初筛后的富含嗜酸硫杆菌的菌液，在搅拌速度190r/min，温度40℃环境中培养时间4d，得到嗜酸硫杆菌培养液。
121.(2)复合菌剂的制备
122.分别按照枯草芽孢杆菌培养液、嗜酸硫杆菌培养液投加比例为75％、25％加入到发酵罐d中，并按照50g/l的浓度加入经过高压蒸汽灭菌(在0.1mpa的压力即103.4kpa(1.05kg/cm2)蒸汽压下，锅内温度达121℃，维持15～30min)的炭质填料(直径5～10mm，比表面积约280m2/g)，在搅拌速度190r/min，温度35℃环境中培养时间1-2天，直至培养液中的菌液浓度达1
×
107cfu/ml，得到第一菌剂。
123.在发酵罐a中的分枝杆菌培养液中按50g/l的浓度加入经过高压蒸汽灭菌(在0.1mpa的压力即103.4kpa(1.05kg/cm2)蒸汽压下，锅内温度达121℃，维持15～30min)的炭质填料(直径5～10mm，比表面积约280m2/g)，在搅拌速度190r/min，温度30℃环境中培养时间0.5-1天，直至培养液中的菌液浓度达1
×
105cfu/ml，得到第二菌剂。
124.(四)生物除臭复合菌剂除臭性能实验
125.将第一菌剂接种于生物滤池(l2m
×
b2m
×
h3.3m，风量2000m3/h，填料高度1.6m，停留时间t＝12s)填料下半层，接种量为每万立方米臭气2l含炭质填料的第一菌剂，具体做法为：第一菌剂中的炭质填料均匀分散在生物滤池下半层，菌液均匀喷洒在填料顶部。第一菌剂接种完成后，启动生物滤池运行1-2天后，再接种第二菌剂。
126.将第二菌剂接种于生物滤池填料上半层，接种量为每万立方米臭气5l含炭质填料的第二菌剂，具体做法为：第二菌剂中的炭质填料均匀分散在生物滤池上半层，菌液均匀喷洒在填料顶部。第二菌剂接种完成后，启动生物滤池运行3～4天出口即可达到稳定状态。
127.采用空白塔作为对照，对硫化氢的去除情况如图4所示。如图4，采用本发明的生物
除臭复合菌剂只需要4～6天就可完成生物滤池的驯化和启动，实现硫化氢100％去除，而自然驯化至少需要12～14天才能达到相同效果。
128.由图4还可以看出，当硫化氢浓度由20ppm以下突然升高至80-100ppm时，自然驯化的生物塔(即空白塔)受浓度波动影响较大，表现为出口硫化氢超标；而采用本发明的生物除臭复合菌剂(实验塔)基本不受进气硫化氢浓度波动影响，仍能维持近100％的去除率。可见采用本发明中生物除臭复合菌剂的生物除臭塔具备抗高浓度进气波动能力，抗冲击负荷能力强，除臭性能稳定。
129.当进气浓度为80-100ppm时，自然驯化的生物除臭塔出口硫化氢浓度20-40ppm，除臭效率为60-80％，而采用本发明中生物除臭菌剂的实验塔依旧能维持100％的去除率，相比自然驯化且运行稳定后的生物滤池其除臭效率提高了20％-40％
130.(五)抵抗异常工况性能实验
131.(1)抵抗严寒能力
132.将本发明的复合菌剂应用于冬季某污水处理厂的生物滤池，截取其中运行稳定后某次冰冻天气的数据绘制成如图5所示，第11-25天为零下寒冷天气，由图5可以看出，采用本发明中生物除臭菌剂的实验塔其除臭效率依然能够维持99％以上的去除效率，而未接种复合菌剂的生物滤池(自然驯化塔)，其除臭效率受天气影响较大。
133.(2)抵抗生物塔长时间闲置能力
134.将已经接种上述生物除臭复合菌剂并稳定运行2个月的生物滤池暂停进气供水1个月后，重新启动，仅需2天，即可恢复至稳定状态。
135.实施例2
136.分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜酸硫杆菌购买自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号分别为bio-101896、bio-52790、bio-67436。
137.各菌株的富集培养方法与实施例1中第(三)部分的“(1)单一菌种的制备”相同。
138.复合菌剂的制备过程如下：
139.分别按照枯草芽孢杆菌培养液、嗜酸硫杆菌培养液投加比例为80％、20％加入到发酵罐中，并按照50g/l的浓度加入经过高压蒸汽灭菌(在0.1mpa的压力即103.4kpa(1.05kg/cm2)蒸汽压下，锅内温度达121℃，维持15～30min)的炭质填料(直径5～10mm，比表面积约280m2/g)，在搅拌速度190r/min，温度35℃环境中培养时间1-2天，直至培养液中的菌液浓度达107cfu/ml，得到第一菌剂。
140.在另一发酵罐中，向分枝杆菌培养液中按50g/l的浓度加入经过高压蒸汽灭菌(在0.1mpa的压力即103.4kpa(1.05kg/cm2)蒸汽压下，锅内温度达121℃，维持15～30min)的炭质填料(直径5～10mm，比表面积约280m2/g)，在搅拌速度190r/min，温度30℃环境中培养时间0.5-1天，直至培养液中的菌液浓度达105cfu/ml，得到第二菌剂。
141.按照实施例1中的方法对本实施例获得的生物除臭复合菌剂的性能进行研究，结果表明，在此实施例中，接种该菌剂的生物除臭塔需要8-9天完成生物滤池的驯化和启动，生物除臭效率提升了20-30％；相比于自然驯化的生物除臭塔，接种该菌剂的生物除臭塔在北方严寒地区可以提高除臭效率的稳定性，自然驯化的生物除臭塔在极寒天气除臭效率由稳定状态的100％降至20-60％，而接种该菌剂的生物除臭塔除臭效率为70-85％，比自然驯化的生物除臭塔效率稳定性提升了20-60％。
142.对比例
143.分支杆菌、脂环酸芽孢杆菌和嗜酸硫化杆菌购买自北京百欧博伟生物技术有限公司，编号分别为bio-101896、bio-56652、bio-67436。
144.分支杆菌和嗜酸硫化杆菌采用与上述实施例1和实施例2相同的培养基。
145.脂环酸芽孢杆菌采用ysg培养基(广东环凯微生物科技有限公司)。
146.各菌株的富集培养方法和复合菌剂的制备方法与实施例1基本相同，区别仅在于用脂环酸芽孢杆菌和ysg培养基替换枯草芽孢杆菌和相应的培养基。
147.采用实施例1的方法检测本对比例的复合菌剂的除臭性能和抵抗异常工况性能，结果如下：
148.生物除臭塔需要10-12天完成除臭微生物的驯化和除臭塔的启动，且在对抗进气高浓度硫化氢(从10-20ppm飙升至70-100ppm)冲击时，其除臭效率无法维持100％的稳定，仅为60-80％，相比于稳定状态的100％，下降了20-40％。相比于自然驯化的生物除臭塔，接种该菌剂的生物除臭塔在北方严寒地区可以提高除臭效率的稳定性，自然驯化的生物除臭塔在极寒天气除臭效率由稳定状态的100％降至20-60％，而接种该菌剂的生物除臭塔除臭效率为60-70％，比自然驯化的生物除臭塔效率稳定性仅提升10-30％。
149.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的替代、修饰、组合、改变、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种生物除臭复合菌剂，其特征在于，由第一菌剂和第二菌剂按照体积比(1～5)：(3～10)组成；其中，所述第一菌剂包括枯草芽孢杆菌和嗜酸硫杆菌，菌液浓度是1
×
106～1
×
109cfu/ml；所述第二菌剂包括分枝杆菌，菌液浓度是1
×
104～1
×
106cfu/ml。2.根据权利要求1所述的生物除臭复合菌剂，其特征在于，所述第一菌剂与所述第二菌剂的体积比是(1～2)：(5～10)，优选是2:5。3.根据权利要求1所述的生物除臭复合菌剂，其特征在于，所述第一菌剂的菌液浓度是1
×
106～1
×
108cfu/ml，优选是1
×
107cfu/ml。4.根据权利要求1所述的生物除臭复合菌剂，其特征在于，所述第二菌剂的菌液浓度是5
×
104～6
×
105cfu/ml，优选是1
×
105cfu/ml。5.根据权利要求1所述的生物除臭复合菌剂，其特征在于，在所述第一菌剂中，枯草芽孢杆菌和嗜酸硫杆菌的菌落比例是(7～8)：(1～5)，优选是(7～8)：(2～3)。6.权利要求1～5任一项所述的生物除臭复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分别进行发酵培养获得分枝杆菌培养液、枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液；(2)将枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液混合，向得到的混合菌液中加入经过灭菌的炭质填料，进行培养，得到第一菌剂；(3)将经过灭菌的炭质填料加入到分枝杆菌培养液中，进行培养，得到第二菌剂。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液的体积百分比分别是70-80％和20-30％，枯草芽孢杆菌培养液和嗜酸硫杆菌培养液之和为100％，炭质填料的加入比例是每升混合菌液加入50～100克炭质填料；在步骤(3)中，炭质填料的加入比例是每升分枝杆菌培养液加入50～100克炭质填料。8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述炭质填料的直径是5～10mm，比表面积不低于250m2/g，表面为亲水性。9.权利要求1～5任一项所述的生物除臭复合菌剂的使用方法，其特征在于，依次包括如下步骤：步骤一，将第一菌剂接种至生物滤池靠近进气侧的下半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第一菌剂；步骤二，将第二菌剂接种至生物滤池远离进气侧的上半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第二菌剂；优选地，所述使用方法依次包括如下步骤：步骤一，将第一菌剂中的炭质填料分散在生物滤池靠近进气侧的下半层，将第一菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行1天至2天；步骤二，将第二菌剂中的炭质填料分散在生物滤池远离进气侧的上半层，将第二菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行3天至4天。10.权利要求1～5任一项所述的生物除臭复合菌剂的使用方法，其特征在于，依次包括如下步骤：步骤一，将第一菌剂接种至生物滤池靠近进气侧的上半层，接种量是每万立方米臭气3
～10l第一菌剂；步骤二，将第二菌剂接种至生物滤池远离进气侧的下半层，接种量是每万立方米臭气3～10l第二菌剂；优选地，所述使用方法依次包括如下步骤：步骤一，将第一菌剂中的炭质填料分散在生物滤池靠近进气侧的上半层，将第一菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行1天至2天；步骤二，将第二菌剂中的炭质填料分散在生物滤池远离进气侧的下半层，将第二菌剂中的菌液喷洒在炭质填料表面，启动生物滤池运行3天至4天。

技术总结
本发明公开了一种生物除臭复合菌剂，由第一菌剂和第二菌剂按照体积比(1～5)：(3～10)组成；其中，第一菌剂包括枯草芽孢杆菌和嗜酸硫杆菌，菌液浓度是1


技术研发人员：黄丹 刘启凯 孙贤波 刘依文 鞠庆玲
受保护的技术使用者：西原环保（上海）股份有限公司
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/8/14