转录因子MdWRKY71或MdWRKY71基因在调控植物花青苷积累中的应用

转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在调控植物花青苷积累中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在调控植物花青苷积累中的应用。


背景技术：

2.花青苷对植物果实着色具有重要的作用，花青苷含量对果实品质有双重影响，一是，在外观方面，花青苷决定了果皮的鲜艳程度，在很大程度上决定了消费者的购买欲望、果实的商业价值和市场竞争力；二是，在营养方面，花青苷是人们饮食中天然抗氧化剂，具有抗癌、保护心血管、改善肥胖和糖尿病等重要作用，对人体健康具有积极影响。例如苹果，苹果是我国栽培面积最大、产量最高的水果。优质苹果利于对人体健康，且种植优质苹果能够提升苹果产业的经济效益。因此研究花青苷的合成调控机制对提高苹果果实品质，促进苹果产业的健康发展具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的提供转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在调控植物花青苷积累中的应用，利用转录因子mdwrky71或mdwrky71基因调控植物花青苷的合成能够对提高苹果果实品质，促进苹果产业的健康发展具有重要意义。
4.为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
5.本发明提供了转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在调控植物花青苷积累中的应用，所述转录因子mdwrky71的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述mdwrky71基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
6.优选的，所述植物包括活体植物或者离体植物组织。
7.优选的，所述调控包括正调控或负调控；所述正调控通过转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达实现；所述负调控通过抑制转录因子mdwrky71或mdwrky71基因表达实现。
8.优选的，所述转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达通过构建过表达载体或5-氨基乙酰丙酸诱导实现。
9.优选的，所述5-氨基乙酰丙酸的诱导浓度为0.1～250mg/l。
10.优选的，所述正调控通过转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达进而正调控花青苷合成关键酶基因表达实现；所述花青苷合成关键酶基因包括mddfr基因和/或mdans基因。
11.优选的，所述抑制转录因子mdwrky71或mdwrky71基因表达通过构建抑制表达载体实现。
12.本发明还提供了转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在构建花青苷含量高的转基因植物中的应用，所述转录因子mdwrky71的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述mdwrky71
基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
13.优选的，所述植物包括桃、荔枝、葡萄和苹果中的一种或几种。
14.本发明还提供了一种促进离体植物组织花青苷积累的方法，包括以下步骤：
15.将离体植物组织置于含有5-氨基乙酰丙酸的培养体系中进行培养。
16.本发明的有益效果：本发明提供了转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在促进植物花青苷积累中的应用，所述转录因子mdwrky71的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述mdwrky71基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。本发明所述转录因子mdwrky71由mdwrky71基因编码合成，通过转基因及功能鉴定证实本发明所述的mdwrky71基因合成的转录因子mdwrky71作为一个新的调控苹果花青苷积累的转录因子，能够正向调节花青苷合成关键酶基因mdans及mddfr表达，促进5-氨基乙酰丙酸(ala)诱导的苹果花青苷积累，在农林生产和科学研究上能够产生重要作用。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
18.图1为实施例1中ala诱导苹果花青苷积累，增强mdwrky71启动子活性的结果；其中a代表ala不同处理时间下的叶片颜色差异比较；b代表花青苷含量比较；c代表mdwrky71基因的表达量差异比较；d代表mdwrky71基因启动子插入到gus基因编码区之前；e代表转入promdwrky71::gus基因对外源ala处理的响应，叶片蓝色加深说明ala促进mdwrky71启动活性诱导gus基因表达；f代表不同处理组的gus基因相对表达量；
19.图2为mdwrky71定位于细胞核；
20.图3为mdwrky71在ala诱导花青苷积累中发挥关键作用；其中，a为ala处理对转入不同mdwrky71基因的
‘
王林’苹果愈伤组织着色程度比较；oe-mdwrky71为超表达细胞系，rnai-mdwrky71为干扰表达细胞系；b代表愈伤组织花青苷含量测定结果图；c代表ala处理对不同基因型苹果叶片颜色的影响；d代表叶片花青苷含量测定结果图；
21.图4为mdwrky71对花青苷生物合成结构基因的转录调控作用；其中，a代表mdwrky71转录因子能够与mdans和mddfr两个基因启动子结合，从而促进它们基因表达；b代表烟草叶片中过表达mdwrky71能够提高mdans和mddfr启动子表达活性从而导致luc基因表达，荧光强度上升；c代表荧光强度值；d代表在烟草叶片中过表达mdwrky71能够提高mdans和mddfr启动子表达活性从而导致gus基因表达上升，叶片颜色加深；e代表gus基因相对表达量；
22.图5为bp反应重组原理示意图。
具体实施方式
23.本发明提供了转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在调控植物花青苷积累中的应用，所述转录因子mdwrky71的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述mdwrky71基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
24.本发明发现了一个转录因子，经进化树分析发现，该转录因子与拟南芥atwrky71具有高度同源性，因而，命名为mdwrky71。
25.本发明所述的转录因子mdwrky71与调控植物花青苷积累相关，该转录因子蛋白由327个氨基酸组成，位于10号染色体，分子量为35.94kda，等电点为6.46，消光系数为0.865，稳定系数为59.02。该转录因子的氨基酸组成中，丝氨酸(ser)和甘氨酸(gly)含量最多，分别占11.3％和9.2％，总平均亲水性指数为-0.871，为亲水蛋白。亚细胞定位分析显示，mdwrky71蛋白(转录因子mdwrky71)定位在细胞核内。
26.本发明的mdwrky71基因为转录因子mdwrky71的编码基因，mdwrky71基因在ncbi上登录号为xp_008383508.2，cds长度984bp(碱基对)。过表达mdwrky71基因，可以促进花青苷积累，而干扰mdwrky71基因表达，则可以抑制花青苷积累。
27.在本发明中，seq id no:1所示氨基酸序列具体为：
28.msdqepkdlyyhdlfqyedhdggmvsinnqpnlqgfdvnpsymnlteclkgsmdynslatafglssstsealfssiegdqkpanhlgysggggggdvetpltpnssmssssaeagadedcgknkkdrqpkgssedggdsskkvsklakkkgekkqreprfafmtksevdhledgyrwrkygqkavknspyprsyyrcttqkcgvkkrversyedpstvittyegqhnhplpatlrgnaaaalfppsmlnlapatrtfstlagggpssafsqeflfqmpqymisnnanqgssrnpnyhlqqyqlphgaadqygllqdlvpsmflkqep。
29.在本发明中，seq id no:2所示核苷酸序列具体为：
30.atgtctgatcaggaaccgaaagacctttactaccatgacctatttcagtatgaagatcatgatggtgggatggtcagcatcaacaaccagccaaatttgcaagggtttgatgtgaatccttcatacatgaacttaacagagtgtttgaaaggatctatggactataattcacttgcaacggcttttggcttgtcatcttcgacctctgaagcactattttcgtctattgaaggcgatcaaaagcctgctaatcatcttggatattcaggtggtggcggaggcggtgatgtggaaactcctttgacgccaaactcttccatgtcgtcttcttcagctgaggctggtgctgatgaggactgtggtaagaataagaaagataggcagccaaaagggtcatcagaagatggaggagatagctctaagaaagtgagcaaactagcaaagaagaagggagagaaaaagcaaagagagccacgatttgccttcatgaccaagagtgaggttgatcatctagaagatggatacagatggagaaaatatgggcagaaagctgtgaaaaatagcccatatccaagaagctactaccggtgtacgacacaaaaatgcggggtcaagaaacgcgtagagaggtcgtacgaggacccatccactgtgattacgacatacgaaggtcagcacaaccacccacttccagcaacccttagaggaaatgcggctgcagcattgttcccaccttctatgctaaacctagcacccgccacgcgtacattctcaaccttggctggtggtggcccgagctctgccttttctcaggaattcttgtttcaaatgccccaatacatgatcagtaacaatgctaatcagggatcgtcacgaaaccctaattatcatctgcagcagtatcaactgcctcatggagctgctgatcagtatggacttttgcaggacttggttccttccatgttcctcaaacaagagccttga。
31.在本发明中，所述植物优选的包括活体植物或者离体植物组织。
32.在本发明中，所述植物优选的包括桃、荔枝、葡萄和苹果中的一种或几种，进一步优选为桃、葡萄和苹果中的一种或几种，更优选为苹果。
33.在本发明中，所述离体植物组织优选的包括叶片或愈伤组织。
34.在本发明中，所述调控优选的包括正调控或负调控。
35.在本发明中，所述正调控优选的通过转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达实现。
36.在本发明中，所述转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达优选的通过构建过表达载体或ala诱导实现。
37.在本发明中，所述过表达载体的骨架质粒优选的包括pcambia1302；所述mdwrky71
基因在pcambia1302上的插入位点优选为bglⅱ和spei。本发明对所述过表达载体的构建方法没有特殊限定，采用本领域常见的重组质粒构建方法即可。
38.在本发明中，转录因子mdwrky71或mdwrky71基因是ala促进花青苷积累的关键调控因子。在本发明中，所述ala的工作浓度优选为0.1～250mg/l。在瞬时gus活性检测分析中，ala能促进mdwrky71基因的启动子的表达，从而启动gus表达。这说明，ala能够正调控mdwrky71基因启动子活性。在本发明中，所述5-氨基乙酰丙酸的工作浓度优选为25mg/l。
39.在本发明中，所述正调控优选的通过转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达进而正调控花青苷合成关键酶基因表达实现；所述花青苷合成关键酶基因优选的包括mddfr基因和/或mdans基因。转录因子mdwrky71能结合并增强mdans基因及mddfr基因启动子活性。这说明，转录因子mdwrky71能够正调控mdans基因及mddfr基因表达。因此，mdwrky71可以作为一个新的调控苹果花青苷积累的转录因子，正向调节mdans及mddfr基因表达，促进ala诱导的苹果花青苷积累。这在农林生产和科学研究上都有重要作用。
40.在本发明中，所述负调控优选的通过抑制转录因子mdwrky71或mdwrky71基因表达实现。
41.在本发明中，所述抑制转录因子mdwrky71或mdwrky71基因表达优选的通过构建抑制表达载体实现。
42.在本发明中，根据mdwrky71基因核苷酸序列(ncbi上登录号为xp_008383508.2)，借助于smart在线网站预测保守结构域序列如seq id no:3所示，具体为：
43.atgcagagcgctgccttcactctcacgccctcactcggccttccgaagcttcggaggccgtcagtgagctccgccgtgaaacctagattcgatccgatacttgtttcggcctcctcgaagccgaacaatttcaatgatgcggtctccgcttctttgccgcgccgatcctggtctctctcttcgtcttcctctgatttcaagctcaggccgtggacttccgtgccgttagtcgattccgatgcccgtacaaaggtttttgaggtacgcgccactgcggaaaccgccggcgagagctccgagtccggcagcagcatattcaaaacgcttgagctcggggcgttgtttggcctctggtacctcttcaacatctggttcaatatctacaacaagcaggtcttg。
44.在本发明中，所述构建抑制表达载体的方法优选为：
45.在bp反应重组酶作用下，所述保守结构域序列的扩增引物对与含有attp1和attp2的供体载体之间发生重组反应，得到重组基因片段；
46.将所述重组基因片段重组进入phellsgate4载体(p4)，同时替换掉可使大肠杆菌普通菌株致死的ccdb基因，获得重组质粒；
47.对所述重组质粒进行酶切验证，当酶切获得电泳条带时，判定为正确重组，若酶切未获得电泳条带时，判定为错误重组；以所述正确重组作为表达干扰型重组质粒p4-mdwrky71；
48.将所述表达干扰型重组质粒p4-mdwrky71转化至农杆菌，得到重组菌。
49.必须对获得的重组质粒进行酶切验证。干扰型重组质粒p4-mdwrky71酶切验证正确，
50.在本发明中，所述保守结构域序列的扩增引物对优选的包括正向引物和反向引物；所述正向引物的5’端添加attb1；所述反向引物的5’端添加attb2；所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，具体为：5
’‑
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct-3’，29bp；所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，具体为：5
’‑
ggggaccactttgtacaagaaagctgggt-3’，29bp。
51.在本发明中，在attb候选基因片段和attp供体载体之间的发生重组反应时，存在两种实验结果：一种是实验所需的正确重组，内含子方向没有发生改变，转化植物体后，能够正常形成发卡结构，发挥剪接功能，并形成有功能的rnai片段；另一种为attb2和attp2之间的跨内含子反应，导致内含子方向转换，成为了失去剪接功能的错误重组。
52.在本发明中，所述农杆菌优选为农杆菌eha105。
53.本发明还提供了转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在构建花青苷含量高的转基因植物中的应用，所述转录因子mdwrky71的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述mdwrky71基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
54.在本发明中，所述应用优选的通过在转基因植物中过表达转录因子mdwrky71或mdwrky71基因实现。
55.本发明还提供了一种构建花青苷含量高的转基因植物的方法，优选的包括以下步骤：
56.构建mdwrky71基因的过表达载体；
57.将所述过表达载体转入农杆菌，得到重组农杆菌；
58.将所述重组农杆菌导入宿主植物中，得到花青苷含量高的转基因植物。
59.本发明还提供了一种促进离体植物组织花青苷积累的方法，包括以下步骤：
60.将离体植物组织置于含有ala的培养体系中进行培养。
61.在本发明中，所述ala的诱导浓度为0.1～250mg/l，优选为25mg/l。
62.在本发明中，将离体植物组织置于含有ala的培养体系中进行培养，外源ala能够正调控离体植物组织中转录因子mdwrky71或mdwrky71基因从而促进花青苷积累，提高离体植物组织中的花青苷含量。
63.在本发明中，所述离体植物组织优选包括叶片或愈伤组织。在本发明中，所述培养体系优选为ms培养基。
64.本发明利用分子生物学手段，从苹果中筛选获得一个能够调控苹果花青苷积累的转录因子mdwrky71。通过酵母单杂交、双荧光素酶，gus报告基因表达系统，生物学信息分析、亚细胞定位，瞬时及稳定表达转化苹果等试验证明，转录因子mdwrky71在ala诱导的花青苷积累中起着正调控的作用。它与mddfr基因启动子及mdans基因启动子结合，正调控mddfr基因及mdans基因表达，促进苹果花青苷积累。此外，外源ala能够诱导mdwrky71基因表达，参与苹果花青苷的积累。合理利用这一基因mdwrky71，可以提高果实品质，为选育植物新品种提供分子基础。
65.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
66.实施例1
67.1.ala诱导苹果花青苷的积累及促进mdwrky71基因表达
68.处理组培养基的组成为在ms培养基中添加质量浓度为25mg/l的ala；对照组培养基为ms培养基。
69.将苹果组培苗离体叶片分别用对照组培养基、处理组培养基在黑暗下预处理24h。之后在17℃及高强光200μmol
·
m-2
·
s-1
下处理72h，每隔24h取样，测定花青苷含量(花青苷
测定方法参考：【张静等.苹果乙烯响应因子mderf1b-like的克隆与功能鉴定[j].园艺学报,2019,46(06):1033-1044.】)(见表1和图1中b)及mdwrky71基因的表达量(见表2和图1中c)。对照组(control)和处理组(ala)分别设置3个平行实验，每个平行实验放置3个叶片。
[0070]
表1不同处理的叶片的花青苷含量(单位：nmol
·
g-1
鲜重)
[0071]
处理时间(h)244872对照组(control)9.0411.5040.54处理组(ala)9.0024.3170.75
[0072]
表2不同处理的叶片的mdwrky71基因相对表达量
[0073][0074][0075]
根据图1中a、b、c和表1、表2可知，ala能够促进苹果叶片变红，叶内花青苷含量显著上升。与此同时，ala也能促进mdwrky71基因表达上调，说明mdwrky71表达量与叶片花青苷积累之间存在着密切关系。其中，mdwrky71表达上升较早，叶片花青苷上升较迟，因而，两者变化存在着时间差。
[0076]
2.ala调节mdwrky71基因启动子活性
[0077]
将mdwrky71基因的启动子连接gus报告基因(图1中的d)，得到promdwrky71::gus，通过瞬时转化苹果叶片，并用ala处理。其中图1中的d中的atg为gus基因启始密码子，-2000bp为mdwrky71的启动子。
[0078]
(1)promdwrky71::gus重组载体构建
[0079]
mdwrky71的启动子克隆：模板为
‘
富士’苹果果皮的dna(
‘
富士’苹果果皮dna提取采用改良ctab法)，设计特异性引物对mdwrky71启动子扩增，正向引物序列如seq id no:6所示，具体为：5
’–
gaccatgattacgccaagcttgtcaggggtttt agggacagaga-3’，反向引物序列如seq id no:7所示，具体为：5
’‑
ggactgaccacccgg ggatccggaagaagaacaacaacaaagacaga-3’。扩增的反应体系为50μl中包括100ng dna，2
×
phantamix 25μl，2μl上述引物，加ddh2o至50μl。在pcr仪上按以下程序完成：95℃，预变性5min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸2min，36个循环，72℃延伸5min。pcr扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳后，用axygen小量胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收启动子dna片段，具体实验操作参照使用说明书。使用重组酶clonexpress ii one step cloning kit(诺唯赞生物科技公司，中国，c112-01)进行目标启动子dna片段与双酶切线性化pbi121载体(hindiii/bamhi)的连接反应。获得重组promdwrky71::gus植物表达载体。
[0080]
(2)苹果叶片瞬时转化及ala处理
[0081]
将上述步骤(1)重组载体promdwrky71::gus利用冻融法转化到农杆菌eha105中，
再通过瞬时抽真空法，利用真空泵将农杆菌压入苹果叶片内。真空泵的压强设置为-0.1mpa，每次抽取5min，共抽取2次。之后进行暗培养1d，获得瞬时promdwrky71::gus转基因苹果叶片。
[0082]
处理组(ala)：转基因苹果叶片在含有ala的ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为3d。ms培养基中添加质量浓度为25mg/l的ala。
[0083]
对照组(control)：转基因苹果叶片在ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为3d。
[0084]
处理结束后，将不同处理的苹果叶片浸泡在gus染色液中，在温度为37℃下保持24h。之后用体积浓度为75％乙醇溶液浸泡脱色，去除叶绿素。gus染色液含100mm磷酸缓冲液(ph值为7)，添加有0.1％(v/v)triton x-100，10mm edta，0.5mm k3fe(cn)6，0.5mm k4fe(cn)6和1mm 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷酸。gus基因表达结果见表3和图1中e。
[0085]
结果见表3和图1中d、e、f，可知ala能显著提高基因mdwrky71的启动子活性。根据图1e可知，ala处理导致转入promdwrky71::gus基因的苹果叶片gus染色程度加深；根据表3和图1中f可知，由mdwrky71启动子控制的gus基因表达量明显上调。
[0086]
表3不同处理组的相对gus基因表达量
[0087]
处理gus基因表达量标准误5％差异1％差异对照组1.000.05bbala2.240.04aa
[0088]
3.mdwrky71蛋白的亚细胞定位
[0089]
35s::mdwrky71-gfp组：将从苹果果实中克隆获得mdwrky71基因的蛋白质编码区(cds)全长去除终止密码子，连接上绿色荧光蛋白基因(gfp)，并由35s启动子启动，构建35s::mdwrky71-gfp表达载体，并将表达载体35s::mdwrky71-gfp转化到农杆菌中，瞬时侵染本氏烟草。
[0090]
35s::gfp组：将绿色荧光蛋白基因(gfp)与35s启动子连接，构建35s::gfp表达载体，并将表达载体35s::gfp转化到农杆菌中，瞬时侵染本氏烟草。
[0091]
35s::mdwrky71-gfp组和35s::gfp组侵染60h后，在激光共聚焦显微镜下观察荧光，发现与对照组35s::gfp组相比，mdwrky71-gfp蛋白仅分布于细胞核(见图2)，说明mdwrky71具有转录因子应该具备的细胞核定位属性。
[0092]
实施例2过表达mdwrky71基因对苹果叶片及愈伤组织花青苷积累的影响以及外源ala处理效应
[0093]
1.oe-mdwrky71重组载体构建
[0094]
‘
富士’苹果rna提取使用fastpure plant total rnaisolation kit(诺唯赞生物科技公司，中国，rc401-01)(按照说明书操作),cdna的合成用first-strand cdna synthesis supermix(北京全式金生物，中国，ae301-02)反转录试剂盒(按照说明书操作)。得到的cdna用于mdwrky71基因全长扩增。设计mdwrky71特异性引物，通过pcr克隆到mdwrky71基因全长序列。pcr扩增的正向引物序列是：5
’‑
gagaacacgggggactctagaatgtctgatcaggaaccgaaaga-3’(seq idno.8)；反向引物序列是：5
’‑
cccttgctcaccatggatcctcaaggctcttgtttgaggaaca-3’(seq id no.9)，扩增的反应体系为50μl中包括100ng cdna，2
×
phantamix 25μl，2μl上述引物，加ddh2o至50μl。在pcr仪上按以下程序完成：95℃，预变性
5min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，36个循环，72℃延伸5min。pcr扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳后，用axygen小量胶回收试剂盒(购自爱思进生物技术杭州有限公司，中国)回收基因片段。使用重组酶clonexpress ii one step cloning kit(诺唯赞生物科技公司，中国，c112-01)进行mdwrky71基因全长与双酶切线性化pcambia1302载体(ncoi/spei)的重组连接反应。获得由35s启动子驱动的超表达oe-mdwrky71重组载体。
[0095]
2.转基因离体组织获得
[0096]
(1)苹果叶片瞬时转化及ala处理
[0097]
1)oe-mdwrky71瞬时转化苹果叶片
[0098]
将上述重组载体oe-mdwrky71利用冻融法将其转化到农杆菌eha105菌株中，再用真空泵法强压入苹果叶片内。真空泵法的压强设置为-0.1mpa，每次抽取5min，共抽取2次。之后进行暗培养1d，获得瞬时过表达mdwrky71转基因苹果叶片(oe-mdwrky71)。
[0099]
处理组(ala)：转基因苹果叶片在含有ala的ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为3d。ms培养基中添加质量浓度为25mg/l的ala。
[0100]
对照组(control)：转基因苹果叶片在ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为3d。
[0101]
2)emptyvector瞬时转化苹果叶片
[0102]
将pcambia1302载体利用冻融法将其转化到农杆菌eha105菌株中，再用真空泵法强压入苹果叶片内。真空泵法的压强设置为-0.1mpa，每次抽取5min，共抽取2次。之后进行暗培养1d，获得瞬时空载转基因苹果叶片(emptyvector)。
[0103]
处理组(ala)：转基因苹果叶片在含有ala的ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为3d。ms培养基中添加质量浓度为25mg/l的ala。
[0104]
对照组(control)：转基因苹果叶片在ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为3d。
[0105]
表4不同叶片处理组的花青苷含量(单位：nmol
·
g-1
鲜重)
[0106]
组别对照组alaemptyvector36.2369.81oe-mdwrky7166.69151.25rnai-mdwrky7110.9617.21
[0107]
(2)苹果愈伤组织稳定转化及ala处理
[0108]
1)oe-mdwrky71
[0109]
将步骤1获得的重组载体oe-mdwrky71利用冻融法将其转化到农杆菌lba4404中，将培养14d左右的王林愈伤组织用农杆菌侵染，黑暗中共培养1～2d。然后将其铺在含有潮霉素的筛选ms培养基上，培养40～50d，将新长出愈伤组织重新继代。提取愈伤组织dna，通过pcr进行阳性鉴定。得到过表达mdwrky71转基因苹果愈伤组织(oe-mdwrky71)。
[0110]
处理组(ala)：转基因苹果愈伤组织在含有ala的ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为14d。ms培养基中添加质量浓度为25mg/l的ala。
[0111]
对照组(control)：转基因苹果愈伤组织在ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为14d。结果见表5和图3中a、b。
[0112]
2)野生型(wt)：
[0113]
处理组(ala)：野生型(wt)苹果愈伤组织在含有ala的ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为14d。ms培养基中添加质量浓度为25mg/l的ala。
[0114]
对照组(control)：野生型(wt)苹果愈伤组织在ms培养基中进行培养，温度为17℃，光照强度为200μmol
·
m-2
·
s-1
，培养时间为14d。
[0115]
表5不同愈伤组织处理组的花青苷含量(单位：nmol
·
g-1
鲜重)
[0116]
组别对照组alawt9.9817.63oe-mdwrky7117.9655.09rnai-mdwrky713.5066.18
[0117]
与对照组相比，oe-mdwrky71愈伤组织(见图3中的a和b)和叶片(见图3中的c和d)花青苷含量显著增加，其中，wt代表野生型，即未转基因的对照，empty代表空载，即转入不含目的基因的空载体。结果还显示，ala处理引起苹果叶片及愈伤组织花青苷含量增加。这些结果说明，mdwrky71过表达可以促进花青苷积累，而抑制该基因表达则抑制花青苷积累。另外，外源ala无论是过表达还是干扰表达mdwrky71，均可促进花青苷积累。
[0118]
实施例3干扰mdwrky71基因表达对苹果叶片及愈伤组织花青苷积累的影响以及外源ala处理效应
[0119]
1.干扰型重组质粒p4-mdwrky71制备
[0120]
根据mdwrky71基因核苷酸序列(ncbi上登录号为xp_008383508.2)，借助于smart在线网站预测保守结构域序列如seq id no:3所示。
[0121]
在此保守结构域(seq id no:3所示的核苷酸序列)的正反向引物的5’端前添加attb1(seq id no:4所示的核苷酸序列)和attb2(seq id no:5所示的核苷酸序列)位点序列(各29bp)，在bp反应重组酶作用下，与含有attp1和attp2供体载体之间发生重组反应(见图5)。然后，将重组所得基因片段重组进入p4(phellsgate4载体)，同时替换掉可使大肠杆菌普通菌株致死的ccdb基因，获得表达干扰型重组质粒p4-mdwrky71。但在attb候选基因片段和attp供体载体之间的发生重组反应时，存在两种实验结果：一种是实验所需的正确重组，内含子方向没有发生改变，转化植物体后，能够正常形成发卡结构，发挥剪接功能，并形成有功能的rnai片段(见图5左侧)；另一种为attb2和attp2之间的跨内含子反应，导致内含子方向转换，成为了失去剪接功能的错误重组(见图5右侧)。因此，使用1％的琼脂糖凝胶电泳对获得的重组质粒进行酶切验证。干扰型重组质粒p4-mdwrky71酶切验证正确，转化至农杆菌eha105后进行侵染。
[0122]
2.转基因离体组织获得
[0123]
获得干扰型重组质粒p4-mdwrky71后，制备含有干扰型重组质粒p4-mdwrky71的农杆菌侵染液。
[0124]
(1)瞬时侵染苹果叶片
[0125]
含有干扰型重组质粒p4-mdwrky71的农杆菌侵染液经真空泵负压进入苹果叶片，真空泵法的压强设置为-0.1mpa，每次抽取5min，共抽取2次。侵染后所得苹果叶片暗培养1d后，获得瞬时干扰表达mdwrky71转基因苹果叶片(rnai-mdwrky71)。
p53)及阴性对照(negative control：p53-abai+pgadt7)四种组合分别转化y1hgold酵母细胞中。
[0139]
将转化的酵母细胞分别涂布在sd/-leu和含有100ng/mlaba的sd/-leu培养基上。在sd/-leu培养基上，所有组合都能正常生长，而在含有aba的sd/leu培养基上只有阳性对照、promddfr+pgadt7-mdwrky71及promdans+pgadt7-mdwrky71组合能够正常生长，阴性对照酵母细胞不能生长。这证明，mdwrky71与mddfr及mdans的启动子存在互作效应。
[0140]
2.gus报告基因及双荧光素酶实验验证
[0141]
(1)mddfr和mdans启动子连接gus报告基因
[0142]
将mdwrky71基因的开放阅读框克隆至pcambia1302载体酶切位点bglⅱ和spei间，形成一个由强启动子35s驱动的效应子oe-mdwrky71。将重组载体oe-mdwrky71转化到农杆菌gv3101感受态细胞中，获得oe-mdwrky71农杆菌。
[0143]
将基因mddfr启动子插入到pbi121载体的xbal和bamhi酶切位点间，其后连接gus基因，形成mddfr启动子启动的报告子promddfr-gus。将重组载体promddfr-gus转化到农杆菌gv3101感受态细胞中，获得promddfr-gus农杆菌。
[0144]
将基因mdans启动子插入到pbi121载体的xbal和bamhi酶切位点间，其后连接gus基因，形成mdans启动子启动的报告子promdans-gus。将重组载体promdans-gus转化到农杆菌gv3101感受态细胞中，获得promdans-gus农杆菌。
[0145]
empty vector+promddfr-gus处理组：将promddfr-gus农杆菌和pcambia1302空载农杆菌(即emptyvector)瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0146]
oe-mdwrky71+promddfr-gus处理组：将promddfr-gus农杆菌和oe-mdwrky71农杆菌瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0147]
empty vector+promdans-gus处理组：将promdans-gus农杆菌和pcambia1302空载农杆菌(即emptyvector)瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0148]
oe-mdwrky71+promdans-gus处理组：将promdans-gus农杆菌和oe-mdwrky71农杆菌瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0149]
注射后，上述不同处理组在温度为22℃条件下培养48h。之后将不同处理的烟草叶片浸泡在gus染色液中[含100mm磷酸缓冲液(ph值为7)，添加有0.1％(v/v)tritonx-100，10mm edta，0.5mm k3fe(cn)6，0.5mm k4fe(cn)6和1mm 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷酸]，在温度为37℃下保持24h。之后用体积浓度为75％乙醇溶液浸泡脱色，去除叶绿素。通过荧光定量检测gus表达量，结果见表6和图4。
[0150]
表6 gus基因表达量
[0151] promdans-guspromddfr-gusempty vector1.011.00oe-mdwrky711.531.37
[0152]
酵母单杂(y1h，见图4中的a)分析结果显示，mdwryk71能够与mdans和mddfr启动子结合；而gus分析(图4中的d、e)进一步显示，mddfr及mdans启动子的启动活性相对较弱，但在mddfr及mdans启动激活gus的同时，添加了oe-mdwrky71，则gus组织化学染色加深，gus基因表达量上升。这些结果证明，mdwrky71是mddfr及mdans启动子的正调控因子，促进后者转录活性。
[0153]
(2)mddfr和mdans启动子连接luc基因
[0154]
将mdwrky71的开放阅读框克隆至pcambia1302载体酶切位点bglⅱ和spei间，形成一个由强启动子35s驱动的效应子oe-mdwrky71。将重组载体oe-mdwrky71转化到农杆菌gv3101感受态细胞中，获得oe-mdwrky71农杆菌。
[0155]
将mddfr启动子插入到pgreen 0800载体的xbal和bamhi酶切位点间，其后连接luc(萤火虫荧光素酶基因)报告基因，形成mddfr启动子启动的报告子promddfr-luc。将重组载体promddfr-luc转化到农杆菌gv3101感受态细胞中，获得promddfr-luc农杆菌。
[0156]
将mdans启动子插入到pgreen 0800载体的xbal和bamhi酶切位点间，其后连接luc(萤火虫荧光素酶基因)报告基因，形成mdans启动子启动的报告子promdans-luc。将重组载体promdans-luc转化到农杆菌gv3101感受态细胞中，获得promdans-luc农杆菌。
[0157]
empty vector+promddfr-luc处理组：将promddfr-luc农杆菌和pcambia1302空载农杆菌(即emptyvector)瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0158]
oe-mdwrky71+promddfr-luc处理组：将promddfr-luc农杆菌和oe-mdwrky71农杆菌瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0159]
empty vector+promdans-luc处理组：将promdans-luc农杆菌和pcambia1302空载农杆菌(即emptyvector)瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0160]
oe-mdwrky71+promdans-luc处理组：将promdans-luc农杆菌和oe-mdwrky71农杆菌瞬时共注射烟草叶片，设置3个平行实验。
[0161]
上述不同处理组在22℃下培养48h。将不同处理组的烟草叶片在活体成像仪下观察并采集照片。同时也测定不同处理下的荧光强度，见表7和图4中b。结果表明，mddfr及mdans启动子的启动活性相对较弱，但在mddfr及mdans启动激活luc的同时，添加了oe-mdwrky71，则荧光强度加大(图4中b)。图4中的c是荧光强度数字化后的结果。从中可以看出，添加oe-mdwrky71后mdans和mddfr启动子启动活性成倍上升。这些结果再次证明，mdwrky71是mddfr及mdans启动子的正调控因子，促进后者转录活性。
[0162]
表7荧光强度
[0163] promdans-lucpromddfr-lucemptyvector26.0675.98oe-mdwrky7171.61156.82
[0164]
综上，本发明提供的转录因子mdwrky71作为一个新的调控苹果花青苷积累的转录因子，能够正向调节mdans及mddfr基因表达，ala能显著提高mdwrky71的启动子活性，促进ala诱导的苹果花青苷积累，在农林生产和科学研究上都有重要作用。
[0165]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在调控植物花青苷积累中的应用，所述转录因子mdwrky71的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述mdwrky71基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括活体植物或者离体植物组织。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控包括正调控或负调控；所述正调控通过转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达实现；所述负调控通过抑制转录因子mdwrky71或mdwrky71基因表达实现。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达通过构建过表达载体或5-氨基乙酰丙酸诱导实现。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述5-氨基乙酰丙酸的诱导浓度为0.1～250mg/l。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述正调控通过转录因子mdwrky71或mdwrky71基因过表达进而正调控花青苷合成关键酶基因表达实现；所述花青苷合成关键酶基因包括mddfr基因和/或mdans基因。7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制转录因子mdwrky71或mdwrky71基因表达通过构建抑制表达载体实现。8.转录因子mdwrky71或mdwrky71基因在构建花青苷含量高的转基因植物中的应用，所述转录因子mdwrky71的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述mdwrky71基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。9.根据权利要求1、2、8任意一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括桃、荔枝、葡萄和苹果中的一种或几种。10.一种促进离体植物组织花青苷积累的方法，其特征在于，包括以下步骤：将离体植物组织置于含有5-氨基乙酰丙酸的培养体系中进行培养。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及转录因子MdWRKY71或MdWRKY71基因在促进植物花青苷积累中的应用，所述转录因子MdWRKY71的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述MdWRKY71基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明所述转录因子MdWRKY71由MdWRKY71基因编码合成，通过转基因及功能鉴定证实本发明所述的MdWRKY71基因合成的转录因子MdWRKY71作为一个新的调控苹果花青苷积累的转录因子，能够正向调节花青素合成关键酶基因MdANS及MdDFR表达，促进5-氨基乙酰丙酸(ALA)诱导的苹果花青苷积累，在农林生产和科学研究上能够产生重要作用。作用。作用。


技术研发人员：汪良驹 张留孜 张建婷
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/14