用于表达LOC101905509ORF区的载体和应用

orf区核酸序列组成，所述载体是通过将6
×
his表达标签，3
×
flag表达标签和loc101905509的预测orf区核酸序列串联连接在空载质粒pcdna3.1-hisb上获得的；
8.其中，loc101905509的预测orf区核酸序列为seq id no.1。
9.进一步地，所述载体的构建方法包括如下步骤：
10.依据多组学分析结果获得的loc101905509的orf核酸序列信息，体外合成末端带有xho i和xba i酶切位点以及6
×
his和3
×
flag表达标签的目标片段序列，目标片段序列为seq id no.2
11.(ctcgaggccaccatgcatcatcaccatcaccatgactacaaggacgacgacgacaa ggattacaaggatgatgatgataaggactataaggacgatgatgacaagttctggcccagaccccagtctccagaaccttgtctggaggcggcacggggtctgcatggcctctcacccatggacagctccatccagctgacccaggtaccagctgtcccccatgagccatgcttctggagcctcagggtggtgagcaggggacttgcagctccctggccagaaaccctttacctgggcatcaccccagctcctactgatgcccacggacatagtaaggaggccagcaggtggggagtgggacttcctgcccaacgtggagcgtgtctgcaccatccccctgcccgccagggccacagtctccttcttggctgcagatcatggcctccatggggcctctgccccaaggctccctccttacctgcactcacaggcatagtaccctcacctttgcccagccgcacggactgggctgcagggggcgggacagctgccgtggaattcgtcatcagggaaaccaaaggcacacagagcagacagtgatctaga)，将loc101905509 orf区的体外合成片段与pcdna3.1-hisb空载质粒进行连接，获得融合蛋白载体。
12.进一步地，所述载体的构建方法还包括如下步骤：
13.获得的体外表达产物，并用qrt-pcr和western blot的方法验证其表达情况。
14.如上所述的载体在证实非编码rnaloc101905509具有编码潜能方面中应用。
15.如上所述的载体在表达融合蛋白方面中的应用。
16.如上所述的载体在编码功能性微肽方面中的应用。
17.本发明取得的有益效果是：
18.1、本发明利用lncrnaloc101905509的体外表达载体
19.pcdna3.1-hisb-loc101905509，获得loc101905509体外表达产物，通过验证产物的表达水平，说明非编码rnaloc101905509具有编码潜能，能编码产生微肽。
20.2、利用本发明建立的融合蛋白载体pcdna3.1-hisb-loc101905509，为后续开展更为深入的loc101905509功能探究提供材料和夯实基础，同时也为深入筛选验证具有编码产物的lncrna提供技术支持和佐证材料。
21.3、本发明通过对loc101905509具备潜在编码潜能的orf区进行序列扩增并构建体外表达载体，然后采用lip 3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞和293t细胞，检测在多种细胞水平上融和蛋白的mrna和蛋白的表达情况。
22.4、本发明针对过去认为lncrna没有生物学功能的论点，提供一种lncrna loc101905509的体外表达载体pcdna3.1-hisb-loc101905509，利用该融合蛋白载体，获得loc101905509的体外表达产物并验证其表达情况，可以发现被定义为非编码rna的loc101905509是具有编码能力的，并且可以编码微肽，为后续探索loc101905509生物学功能的实验研究夯实基础、提供新的思路和参考。
23.5、本发明根据loc101905509 orf区碱基序列，设计合成出目的片段，通过添加酶切位点xho1及xba1，将目的片段、6
×
his和3
×
flag表达标签序列连接至pcdna3.1-hisb表
达载体上，之后通过转染入牛骨骼肌卫星细胞与293t细胞中分别验证其体外表达情况，证实目的片段具有编码微肽蛋白的能力。本发明所构建载体的具体用途在于证实非编码rna的loc101905509具有编码潜能，能够编码功能性微肽，其表达或对牛肌细胞的增殖和分化过程具有调控作用，为后续进一步探索loc101905509生物学功能的实验研究夯实基础、提供新的思路和参考。同时为肌肉相关性研究提供实际应用价值。
24.6、在前期的研究中，本发明人对牛骨骼肌卫星细胞进行了转录组学、翻译组学及微肽组学三个组学的测序分析，经过多组学联合分析发现lncrnaloc101905509具有小的开放阅读框(sorf)结构，并在微肽组学中发现与之预测氨基酸序列对应的微肽产物，因此，初步判断loc101905509可能具有编码能力，可以编码产生功能性微肽。鉴于此，我们设计扩增了牛loc101905509基因orf区的编码序列，构建了融合蛋白载体pcdna3.1-hisb-loc101905509，把重组质粒转染至293t细胞，检测其外源表达情况，为后续开展更为深入的loc101905509功能探究提供材料和夯实基础，同时也为深入筛选验证具有编码产物的lncrna提供技术支持和佐证材料。
25.7、本技术人通过前期的多组学研究筛选获得一条可能与肌肉发育相关并且具有编码潜能的lncrna，loc101905509，将其能编码功能性微肽的orf区序列与表达标签串联，成功构建可以直接检测的loc101905509编码微肽外源性表达载体，为后续该功能性微肽的研究和应用奠定基础。
附图说明
26.图1为本发明中loc101905509融合蛋白的重组核酸序列模式图；
27.图2为本发明中pcdna3.1-hisb-101905509重组质粒单酶切结果图；
28.图3为本发明中pcdna3.1-hisb-loc101905509载体测序结果结果图；
29.图4为本发明中采用qpcr法定量检测pcdna3.1-his-loc101905509融合蛋白在牛骨骼肌卫星细胞中mrna的表达水平的检测结果图；
30.图5为本发明中采用考马斯亮蓝染色法定性检测pcdna3.1-his-loc101905509融合蛋白在293t细胞中的表达水平的检测结果图；
31.图6为本发明中采用westren blot定量检测pcdna3.1-his-loc101905509融合蛋白在293t细胞中的表达水平的检测结果图；
32.图7为本发明中pcdna3.1-hisb-loc101905509融合蛋白质粒载体图谱。
具体实施方式
33.为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
34.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
35.一种用于表达lncrnaloc101905509 orf区的载体，所述载体的核心表达原件由广谱强启动子cmv，t7启动子，6
×
his表达标签，3
×
flag表达标签和lncrna loc101905509 orf区核酸序列组成，所述载体是通过将6
×
his表达标签，3
×
flag表达标签和loc101905509的预测orf区核酸序列串联连接在空载质粒pcdna3.1-hisb上获得的；其图谱
可以如图7所示。
36.其中，loc101905509的预测orf区核酸序列为seq id no.1。
37.较优地，所述载体的构建方法包括如下步骤：
38.依据多组学分析结果获得的loc101905509的orf核酸序列信息，体外合成末端带有xho i和xba i酶切位点以及6
×
his和3
×
flag表达标签的目标片段序列，目标片段序列为seq id no.2
39.(ctcgaggccaccatgcatcatcaccatcaccatgactacaaggacgacgacgacaa ggattacaaggatgatgatgataaggactataaggacgatgatgacaagttctggcccagaccccagtctccagaaccttgtctggaggcggcacggggtctgcatggcctctcacccatggacagctccatccagctgacccaggtaccagctgtcccccatgagccatgcttctggagcctcagggtggtgagcaggggacttgcagctccctggccagaaaccctttacctgggcatcaccccagctcctactgatgcccacggacatagtaaggaggccagcaggtggggagtgggacttcctgcccaacgtggagcgtgtctgcaccatccccctgcccgccagggccacagtctccttcttggctgcagatcatggcctccatggggcctctgccccaaggctccctccttacctgcactcacaggcatagtaccctcacctttgcccagccgcacggactgggctgcagggggcgggacagctgccgtggaattcgtcatcagggaaaccaaaggcacacagagcagacagtgatctaga)，将loc101905509 orf区的体外合成片段与pcdna3.1-hisb空载质粒进行连接，获得融合蛋白载体。
40.较优地，所述载体的构建方法还包括如下步骤：
41.获得的体外表达产物，并用qrt-pcr和western blot的方法验证其表达情况。
42.如上所述的载体在证实非编码rnaloc101905509具有编码潜能方面中应用。
43.如上所述的载体在表达融合蛋白方面中的应用。
44.如上所述的载体在编码功能性微肽方面中的应用。
45.具体地，相关制备及检测如下：
46.本发明的设计思路是：
47.一种用于表达loc101905509 orf区的载体构建及鉴定的方法，包括以下步骤：
48.第一步、采用一般表达载体构建的方法，选择利用单个pcdna3.1-his b载体和lncrna loc101905509 orf区构建表达融合蛋白进行优化设计。以pcdna3.1-his b质粒骨架的基础进行构建，在目的基因序列起始密码子后串联3
×
flag与6
×
his序列，在目的基因序列前后分别加入酶切位点和kozak序列，经双酶切、转化、载体连接和测序分析构建出pcdna3.1-hisb-loc101905509融合蛋白表达载体。
49.具体步骤是：
50.(1)lncrnaloc101905509 orf区与表达标签串联构建重组序列
51.选取xho i和xba i作为载体及目的片段的通用酶，利用体外化学合成的方式将lncrna loc101905509 orf区与6
×
his和3
×
flag表达标签串联构建重组序列，模式图如图1所示。
52.(2)loc101905509的orf区碱基序列(495bp，seq id no.1)：atgttctggcccagaccccagtctccagaaccttgtctggaggcggcacggggtctgcatggcctctcacccatggacagctccatccagctgacccaggtaccagctgtcccccatgagccatgcttctggagcctcagggtggtgagcaggggacttgcagctccctggccagaaaccctttacctgggcatcaccccagctcctactgatgcccacggacatagtaaggaggccagcaggtggggagtgggacttcctgcccaacgtggagcgtgtctgcaccatccccctgcccgccagggccacagtctccttcttggctg
cagatcatggcctccatggggcctctgccccaaggctccctccttacctgcactcacaggcatagtaccctcacctttgcccagccgcacggactgggctgcagggggcgggacagctgccgtggaattcgtcatcagggaaaccaaaggcacacagagcagacagtga
53.(3)表达标签的融合蛋白编码序列(seq id no.2)
54.ctcgaggccaccatgcatcatcaccatcaccatgactacaaggacgacgacgacaaggattacaaggatgatgatgataaggactataaggacgatgatgacaagttctggcccagaccccagtctccagaaccttgtctggaggcggcacggggtctgcatggcctctcacccatggacagctccatccagctgacccaggtaccagctgtcccccatgagccatgcttctggagcctcagggtggtgagcaggggacttgcagctccctggccagaaaccctttacctgggcatcaccccagctcctactgatgcccacggacatagtaaggaggccagcaggtggggagtgggacttcctgcccaacgtggagcgtgtctgcaccatccccctgcccgccagggccacagtctccttcttggctgcagatcatggcctccatggggcctctgccccaaggctccctccttacctgcactcacaggcatagtaccctcacctttgcccagccgcacggactgggctgcagggggcgggacagctgccgtggaattcgtcatcagggaaaccaaaggcacacagagcagacagtgatctaga
55.(4)loc101905509外源表达载体构建
56.具体步骤是：
57.将带有lncrna 84270orf区与表达标签的融合蛋白编码序列与pcdna3.1-hisb空载质粒分别用限制性核酸内切酶xhoi和xbai进行双酶切使其线性化，具体酶切体系如下所示。(这部分样品浓度不同，添加的体积也不同，计算后是按50ng添加，但体积不固定)。
58.表1 dna/pcdna3.1-hisb酶切体系
[0059][0060]
将配好的混合液37℃水浴酶切20分钟。酶切后的产物利用康为世纪公司的dna产物纯化试剂盒纯化产物。纯化后空载质粒与目的片段按照m(目的片段)＝m(质粒)*目的片段长度/质粒长度*3的计算公式的配比，利用t4连接酶进行连接反应，反应条件为22℃2h，4℃过夜，连接体系如下：
[0061]
表2 dna连接体系
[0062][0063]
随后取连接后的产物10μl加入预先解冻的dh5α感受态细胞中进行转化。将转化后的细菌在37℃摇床中复活1h。随后铺30ul于amp平板上，37℃恒温培养10-12h。挑取单克隆菌落接种于5ml含有氨苄青霉素(1:1000)的lb液体培养基中振荡培养，筛选阳性转化子，将验证正确的阳性转化子送至上海生工生物工程有限公司测序，测序引物为：f：
cgcaaatgggcggtaggcgtg；r：tagaaggcacagtcgagg，利用dnaman软件进行序列比对分析，测序结果正确的菌液进行质粒抽提，获得
[0064]
pcdna3.1-hisb-loc101905509的体外表达载体。
[0065]
将重组质粒pcdna3.1-hisb-loc101905509进行酶切验证，可得到一条6000bp左右的片段(图2)，经上海生工生物工程有限公司测序后发现与目标片段完全匹配，未见有突变位点产生(图3)。
[0066]
第二步、loc101905509 orf区体外表达载体的鉴定：
[0067]
具体步骤是：
[0068]
(1)pcdna3.1-his-loc101905509融合蛋白表达载体mrna水平的表达鉴定。
[0069]
本发明使用牛骨骼肌卫星细胞进行rna水平的定量检测。
[0070]
2.1.1细胞复苏：
[0071]
取出实验室冻存的牛骨骼肌卫星细胞，37℃水浴1-2min迅速解冻复苏，加入1ml完全培养基(20％fbs+80％dmem)中和，离心后吸弃上清，加入3ml完全培养基重悬细胞，转入60mm培养皿中，在37℃、5％co2和培养箱中培养，观察细胞数量及生长情况。
[0072]
2.1.2细胞传代：
[0073]
当细胞生长至汇合率达到80-90％时对细胞进行传代。加入1ml质量浓度0.25％胰酶37℃消化1-2min，加入1ml完全培养基(20％fbs+80％dmem)中和胰酶，轻吹重悬细胞，1000rpm离心10min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞后接种于12孔细胞培养板中。持续观察细胞状态。
[0074]
2.1.3细胞转染：
[0075]
待牛骨骼肌卫星细胞融合度达到80％后，依据lipofectamine 3000转染试剂的说明书要求转染pcdna3.1-hisb-loc101905509质粒和对照组pcdna3.1-hisb空质粒(nc)。转染流程如下(以下剂量为12孔板1孔的试剂量)：
[0076]
分别配制a液与b液，并在室温孵育5min。
[0077]
a：62.5μl opti-mem+3.75μl lip3000；
[0078]
b：62.5μl opti-mem+2.5μlp3000+1250ng cdna3.1-hisb-84270/pcdna3.1-hisb空质粒(nc)
[0079]
随后a、b两管中试剂混合均匀再次孵育10min。加入到牛骨骼肌卫星细胞培养皿中轻晃摇匀。转染6h后更换为有抗培养基(20％fbs+79％dmem+1％p/s)，转染后24h分别收集细胞mrna和蛋白样品，进行后续分析。
[0080]
2.1.4牛骨骼肌卫星细胞总rna的提取与表达鉴定
[0081]
转染24h后，采用细胞rna快速提取试剂盒提取转染细胞的总rna，采用实时荧光定量pcr方法检测loc101905509 orf区的表达，总rna提取、rna的反转录及定量pcr操作如下。
[0082]
采用细胞rna快速提取试剂盒提取增殖及分化细胞的总rna。提取步骤：于12孔细胞培养板中加入350μl细胞裂解液，反复吹吸至细胞充分裂解，将上述裂解液收集至1.5ml的无rna酶管中，将裂解混合物全部加到dna清除柱上。立刻13000rpm的转速离心60s。用微量移液器精确估计滤过液体积，加入等体积的70％乙醇，立即吹打混匀，不要离心。立即将混合物加入一个吸附柱ra中，13000rpm离心30s，弃掉废液。加700μl去蛋白液rw1，室温放置1分钟，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500μl漂洗液rw，12000rpm离心30s，弃掉废液。加
入500μl漂洗液rw，重复一遍。将吸附柱ra放回空收集中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱ra，放入一个无酶离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加30-50μl无酶水，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。收集总rna样品。测定浓度并统一。随后吸取rna样品按下述体系配置溶液进行反转录。
[0083]
表3rna反转录体系及条件
[0084][0085]
将配好的混合液放置于pcr仪上，并设定程序：先于42℃条件下孵育15min，然后在85℃条件下孵育5min。上述程序结束后，短暂离心，将反转录后的cdna混合液取出在冰上冷却，备用。
[0086]
定量pcr检测体系：
[0087]
反应液的配置：在冰上配置反应液，每个样品中的检测指标都要进行复孔实验，并进行单孔ntc实验，采用白色8连排进行定量pcr检测。
[0088]
8连排中每个单管中反应液配置如下：
[0089]
表4定量pcr检测体系
[0090][0091]
qrt-pcr的反应条件：
[0092]
充分混匀反应液后，离心，使反应液到反应管底部，置于实时荧光定量pcr仪上。具体反应设计程序如下：
[0093]
表5 qrt-pcr的反应条件
[0094][0095]
所用引物序列见表6，检测结果见图4，外源转入的pcdna3.1-hisb-loc101905509在牛骨骼肌卫星细胞中其mrna表达量与nc对照组相比上升了约20倍差异极显著(**，与对照nc相比p《0.01)，因此可以初步判断pcdna3.1-hisb-loc101905509重组载体在细胞中其mrna可以正常表达。
[0096]
表6 pcdna3.1-hisb-loc101905509实时定量pcr引物序列
[0097][0098][0099]
(2)pcdna3.1-his-loc101905509融合蛋白表达载体蛋白水平的表达鉴定。
[0100]
本发明使用293t细胞进行蛋白水平的表达鉴定，细胞培养方法与牛骨骼肌卫星细胞相同。
[0101]
利用ripa蛋白裂解液裂解并提取转染后24h的293t细胞的蛋白，通过bca法测蛋白浓度，然后进行考马斯亮蓝染色。按分离胶溶液：分离胶缓冲液的体积比＝1：1的比例配置分离胶，混匀后加入过硫酸铵再次混匀后注入已经夹好的玻璃板中(玻璃板底部要平齐且不漏胶)，静置20min等待分离胶凝固。浓缩胶使用相同步骤配置，待注浓缩胶后应立即插入梳齿，静置30min等待浓缩胶凝固，拔去梳齿即可用于电泳。取下做好的胶板置于电泳架上安装好后放入电泳槽中，加入电泳液后用移液枪于分离胶孔隙中加样，一般顺序为marker，对照蛋白样品，实验蛋白样品，之后连接电泳仪在80v、30min的条件下电泳，之后更换为120v、45min继续电泳至结束。电泳结束后，先用纯水浸泡凝胶5-10min，以减少背景并去除杂质，然后除去纯水，用适量考马斯亮蓝快速染色剂室温下在水平摇床上染色10-15min。染色后去除染色剂，用纯水洗去残留的染色后于电泳凝胶成像分析系统观察结果。
[0102]
western blot实验电泳阶段与上述步骤相同。待电泳完成后，将下层分离胶平移至pvdf膜中夹好三明治放入电转槽，加入配置好电转液在300ma的条件下转膜105min，之后将转好的pvdf膜浸泡在含有5％脱脂奶粉中摇晃封闭2h，使用tbst清洗掉奶粉后，根据研究蛋白的分子量，参照maker进行条带裁切，将目的条带与一抗稀释液用杂交袋封闭，完成后放入4℃冰箱孵育过夜。孵育完成后回收一抗，用tbst每次清洗10min3次后将其与相应二抗在室温下孵育1h，然后在每次10min用tbst清洗三次。最后，按照1:1的比例配置ecl超敏发光液，并在超敏电泳凝胶成像分析系统下拍照保存。
[0103]
通过考马斯亮蓝染色实验可以清晰地在25-35kda处(见图5中红色框处)具有明显的蛋白条带，而nc组无明显条带，这一结果说明pcdna3.1-hisb-loc101905509在293t细胞中表达了融合蛋白产物，证明其能在蛋白水平进行表达。westernblot结果如图6所示，his抗体孵育后，同样在pcdna3.1-hisb-loc101905509转染组检测到明显的特异性条带，而nc对照组没有检测到条带，说明本实验所构建的pcdna3.1-hisb-loc101905509在293t细胞中融合蛋白成功表达。
[0104]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

技术特征：
1.一种用于表达lncrnaloc101905509orf区的载体，其特征在于：所述载体的核心表达原件由广谱强启动子cmv，t7启动子，6
×
his表达标签，3
×
flag表达标签和lncrnaloc101905509orf区核酸序列组成，所述载体是通过将6
×
his表达标签，3
×
flag表达标签和loc101905509的预测orf区核酸序列串联连接在空载质粒pcdna3.1-hisb上获得的；其中，loc101905509的预测orf区核酸序列为seq id no.1。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体的构建方法包括如下步骤：依据多组学分析结果获得的loc101905509的orf核酸序列信息，体外合成末端带有xho i和xba i酶切位点以及6
×
his和3
×
flag表达标签的目标片段序列，目标片段序列为seq id no.2(ctcgaggccaccatgcatcatcaccatcaccatgactacaaggacgacgacgacaaggattacaaggatgatgatgataaggactataaggacgatgatgacaagttctggcccagaccccagtctccagaaccttgtctggaggcggcacggggtctgcatggcctctcacccatggacagctccatccagctgacccaggtaccagctgtcccccatgagccatgcttctggagcctcagggtggtgagcaggggacttgcagctccctggccagaaaccctttacctgggcatcaccccagctcctactgatgcccacggacatagtaaggaggccagcaggtggggagtgggacttcctgcccaacgtggagcgtgtctgcaccatccccctgcccgccagggccacagtctccttcttggctgcagatcatggcctccatggggcctctgccccaaggctccctccttacctgcactcacaggcatagtaccctcacctttgcccagccgcacggactgggctgcagggggcgggacagctgccgtggaattcgtcatcagggaaaccaaaggcacacagagcagacagtgatctaga)，将loc101905509orf区的体外合成片段与pcdna3.1-hisb空载质粒进行连接，获得融合蛋白载体。3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述载体的构建方法还包括如下步骤：获得的体外表达产物，并用qrt-pcr和western blot的方法验证其表达情况。4.如权利要求1或2所述的载体在证实非编码rnaloc101905509具有编码潜能方面中应用。5.如权利要求1或2所述的载体在表达融合蛋白方面中的应用。6.如权利要求1或2所述的载体在编码功能性微肽方面中的应用。

技术总结
本发明属于基因生物工程技术领域，公开一种用于表达lncRNA LOC101905509ORF区的载体，所述载体是通过将6


技术研发人员：李新 罗锦堂 胡德宝 郭益文 张林林 丁向彬 郭宏 宋昕宇
受保护的技术使用者：天津农学院
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/8/14