一种应用于mNGS病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法与流程

一种应用于mngs病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种应用于mngs病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法，更具体地涉及一种将病灶组织块解离成更小的细胞团或单细胞的处理方法，利用该方法可以降低病原检测中的人源宿主比例，提高病原的检出性能。


背景技术：

2.宏基因组测序(mngs)是一种不需进行病原微生物培养即可快速深入鉴定感染病原体的新技术，相比传统培养方法拥有更高敏感性的同时又与“精准诊疗”的理念相契合，mngs是临床病毒学中有效的重要工具。mngs可以立即获得完整的病毒遗传信息，从而进行病毒流行病学监测或鉴定病毒耐药性特定突变，能够鉴定高度不同的病毒基因组、罕见的病原体，并发现靶向pcr遗漏的病毒，使用mngs进行宏基因组学分析是确定病毒感染丰度并以无偏好性的方式鉴定感染的有效方法。
3.高通量测序不依赖传统病原体分离培养，无需特异性引物，单次运行即可对病原体进行鉴定及分型，并能检出未知病原体，实现对病原体的定性定量描述，特别是针对长期不明原因发热、常规检测阴性及经验性抗感染治疗效果欠佳的疑难重症感染等方面具有传统病原学检测技术不可比拟的优势。现mngs已广泛应用于包括呼吸系统感染、中枢神经系统感染及血液系统感染等在内的多种感染性疾病的诊治中，虽然其相比传统病原检测技术灵敏度高，但在实际使用时，临床培养的阳性样本中仍有部分ngs结果为阴性，导致假阴性结果的出现，这是由于大多数样本中的微生物核酸受到宿主人源背景的影响，通常人源数据会占总数据量的99％以上，标本中少量的人源有核细胞就可能完全淹没低丰度的病原体遗传物质，为了提高病原基因组序列的覆盖度，往往需要提高测序深度，不仅严重限制了检测的灵敏度也造成了数据的浪费。因此消除宿主背景核酸干扰是提高病原体检测灵敏度和进一步降低检测成本最重要的环节之一。
4.目前，常用的去宿主方法包括：1、酶切法，将样本直接用dnasei消化后进行宏基因组测序，结果显示，消化后的样本中人源序列占比略有下降，但病原微生物的检出条数无显著提高；2、探针捕获法，设计反向特异性探针用于捕获人源基因组，然后将剩余的样本用于检测，该方法成本高、流程长，且检测结果不理想；3、差异消化法，利用人源细胞和病原微生物细胞结构的差异，选择性地裂解宿主细胞，并利用核酸酶消化掉释放出来的宿主dna，然后再进行病原微生物dna的富集纯化。该方法对大部分痰液、肺泡灌洗液等样本作用明显，但在感染组织样本中表现不佳，与液态临床样本相比，组织样本由于其特殊性导致直接使用消化试剂无法完全裂解人源细胞，通常人基因组大小约为3
×
109，而细菌基因组大小约为3
×
106，宿主核酸比例的增加使人源宿主背景检出提升，胞内病原微生物比例和reads数大幅减少，同时取自感染部位的组织样本由于免疫细胞侵入，宿主细胞比例会进一步提高。此外，有些组织中含有结缔组织、收缩蛋白和胶原等，如不经过特殊的前处理将给后续病原微生物的核酸提取带来很大的难度。
5.因此亟需一种成本低且操作简易的方法对组织样本中的细胞进行分散，使组织细
胞能够与裂解试剂充分接触，以有效降低人源序列比例，提高检测病原微生物的灵敏度和检出率。


技术实现要素：

6.本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种应用于mngs病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法，克服现有组织样本解离去宿主技术上的不足，适用于各类病灶组织样本如穿刺组织、肿瘤组织等做mngs病原微生物检测，采用本发明中的方法处理样本后可以降低宿主人源的比例、提高病原微生物的检出性能。
7.本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：一种应用于mngs病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法包括以下步骤，
8.s1、制备celldehost酶体系：
9.采用dehostbuffer将celldehost混合酶干粉溶解至浓度为100mg/ml，溶解后采用0.22μm的膜进行过滤，将过滤液在-20℃的温度条件下保存在棕色ep管中作为酶储备液；celldehost混合酶干粉含有酪蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶且混合酶干粉的活力≥250u/mg；
10.s2、准备病灶组织样本：
11.在生物安全柜内用无菌刀片从采样后的组织块上切取病灶组织，并将切碎的病灶组织转移至ep管内；
12.s3、解离处理：
13.采用dehostbuffer将celldehost酶储备液稀释成低浓度的工作液，取工作液添加到含有病灶组织的ep管中，将ep管置入金属浴中消化20min，金属浴的温度条件为37℃、转速条件为1000rpm，解离后组织块消失并且液体中呈现少量絮丝状物；
14.s4、去宿主：
15.将解离得到的200μl液体并瞬时离心，去掉上层的100μl清液，获取下层100μl含絮状组分的液体；向前述100μl液体内补充106μl的pbs缓冲液，即总体系是206μl，加入去宿主试剂并混匀，在37℃的温度条件下孵育10min进行人源细胞裂解以及人源gdna释放、消化过程，获得去宿主后的产物。
16.优选地：dehostbuffer的成分及含量为nacl8.00～8.05mg/ml、na2hpo417.0.05～0.06mg/ml、kcl0.39～0.42mg/ml、kh2po40.05～0.06mg/ml、mgso40.09～0.11mg/ml、cacl20.13～0.14mg/ml、d-葡萄糖0.98～1.03mg/ml、nahco30.33～0.36mg/ml，配制后缓冲液的ph值为7.2～7.4。
18.优选地：步骤s3中稀释后的工作液浓度为10～20mg/ml。
19.本发明的优点和积极效果是：
20.本发明可以实现mngs病原检测中组织样本的细胞分散，提高去宿主的效果，提升病原菌的检出性能，降低因人源占比高造成的病原漏检情况，提升mngs测序数据的准确性。当前直接切取组织块进行实验的操作方式中，会有病原微生物包裹在组织内部无法获得，存在测序后病原微生物漏检的情况。本发明的去宿主方法中通过组织解离，最大程度的把组织块消化成单细胞，这样让附着在组织细胞上的病原微生物暴露出来，达到更好的病原微生物检出效果。
21.本发明操作流程简单，通过在病灶组织样本解离去宿主操作前增加37℃1000rpm的20min试剂孵育步骤，让组织块充分消化成分散的细胞团或单细胞状态，即可高效地实现解离去宿主效果，具有很好的推广前景。
具体实施方式
22.为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹举以下实施例详细说明。
23.实施例一
24.本实施例说明不同工作液浓度的细胞解离酶应用于mngs病原检测领域病灶组织样本解离去宿主过程中对组织提取、建库结果都有正向作用。
25.步骤s1、制备celldehost酶体系。
26.采用dehostbuffer将celldehost混合酶干粉溶解至浓度为100mg/ml，溶解后采用0.22μm的膜进行过滤，将过滤液在-20℃的温度条件下保存在棕色ep管中作为酶储备液。
27.其中，celldehost混合酶干粉含有酪蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶且混合酶干粉的活力≥250u/mg。
28.其中，dehostbuffer的成分及含量为nacl8.00～8.05mg/ml、na2hpo40.05～0.06mg/ml、kcl0.39～0.42mg/ml、kh2po40.05～0.06mg/ml、mgso40.09～0.11mg/ml、cacl229.0.13～0.14mg/ml、d-葡萄糖0.98～1.03mg/ml、nahco30.33～0.36mg/ml，配制后缓冲液的ph值为7.2～7.4。优选方案为：dehostbuffer的成分及含量为nacl8.00mg/ml、na2hpo40.05mg/ml、kcl0.41mg/ml、kh2po40.06mg/ml、mgso40.10mg/ml、cacl20.14mg/ml、d-葡萄糖1.00mg/ml、nahco30.35mg/ml，配制后缓冲液的ph值为7.3。
30.步骤s2、准备病灶组织样本。
31.取临床感染病患者的病灶组织样本置入培养皿，在二级生物安全柜内用无菌刀片在培养皿上从采样后的组织块上切取1.5mm3的病灶组织用于实验，并继续用刀片切3～5次以尽量减小病灶组织块的体积，将切碎的病灶组织转移至1.5ml的ep管内。
32.步骤s3、解离处理。
33.先制备celldehost酶工作液：取celldehost酶储备液在室温条件下融化，在超净工作台中用dehostbuffer将酶储备液分别稀释成酶浓度为10mg/ml和20mg/ml的工作液。
34.取200μl的工作液加到含病灶组织的1.5mlep管中，在37℃的温度条件、1000rpm的转速条件下进行金属浴消化，处理时间为20min；解离后组织块消失并且液体中呈现少量絮丝状物。
35.s4、去宿主。
36.将解离得到的200μl液体并瞬时离心，去掉上层的100μl清液，获取下层100μl含絮状组分的液体。一般情况下，组织块经过解离后人源细胞大量呈现离散状态，故仅保留100μl进行实验，避免人源过高影响病原微生物的检出。
37.向前述获取的含絮状组分的100μl液体内补充106μl的pbs缓冲液，即总体系是206μl，加入去宿主试剂并混匀，在37℃的温度条件下孵育10min进行人源细胞裂解以及人源gdna释放、消化过程，获得去宿主后的产物，是一种混合液。
38.其中，pbs缓冲液即磷酸缓冲盐溶液，商业化试剂品牌是“lifescience”，货号为“f2209”。
39.其中，去宿主试剂选取为“去宿主试剂盒”中的试剂组分，商业化试剂盒品牌为“金匙医学”，货号为“2007-01”(津械备20210385号)。
40.上述去宿主后的产物混合液补充1ml的pbs缓冲液并混匀，在12000rpm的离心条件下，离心处理3min，去掉上层清液保留下层沉淀，完成病原病生物的收集。
41.将上述病原微生物沉淀补充800μl的pbs缓冲液，放到lysingmatrixe破壁管中，用“金匙医学”样本前处理系统设备(津械备20210673号)进行物理破壁，完成微生物物理破壁操作。破壁后进行瞬时离心，取600μl液体用“金匙医学”磁珠法核酸提取试剂盒(dna/rna)(津械备20210111号、货号为2005-01)进行病原微生物的核酸提取。提取后的核酸可以用于建库、测序等操作。
42.对照组设置：对照组不进行组织解离酶作用，直接按照金匙组织样本解离去宿主常规处理后进行提取、建库；
43.以上对照组、测试组均设置2个技术重复，结果如表1所示。
44.表1细胞解离酶对组织样本提取、建库的影响
[0045][0046]
注：文库扩增效率＝(文库浓度*40/建库起始量)^(1/循环数)-1
[0047]
由表1可以看出，测试组将细胞解离酶应用于组织样本解离去宿主前处理进行组织细胞分散，可以提升细胞总数量、出库浓度和扩增效率；可以明显降低提取浓度：通过将组织解离分散成单细胞或更多的细胞团可以提高后续实验去宿主的效果表现为提取浓度降低。综上说明组织解离酶浓度为10mg/ml、20mg/ml时对组织样本解离去宿主都有正向作用。
[0048]
实施例二
[0049]
本实施例说明相同浓度的细胞解离酶应用于mngs病原检测领域病灶组织样本，解离后选用不同组分进行提取、建库、测序，解离作用后对病原检出等都有正向作用。
[0050]
病灶组织样本准备：取2个临床感染病患者的病灶组织样本，其余实验操作、条件与实施例一保持一致。
[0051]
先制备celldehost酶工作液：取celldehost酶储备液在室温条件下融化，在超净工作台中用dehostbuffer将酶储备液稀释成酶浓度20mg/ml的工作液；
[0052]
解离处理：取200μl的工作液加到含病灶组织的1.5mlep管中，在37℃的温度条件、1000rpm的转速条件下进行金属浴消化，处理时间为20min；之后将解离的液体转入新的1.5mlep管中，解离后的液体和未充分解离的沉淀分别按照“金匙医学”组织样本解离去宿主常规处理后进行提取、建库、测序；
[0053]
其中以上对照组、测试组不设技术重复，其余实验操作、条件与实施例一保持一
致；结果如表2、表3所示。
[0054]
表2细胞解离酶对组织样本提取、建库、检出的影响
[0055][0056]
表3细胞解离酶对组织样本病原检出性能的影响
[0057][0058][0059]
由表2、表3可以看出，测试组将细胞解离酶应用于组织样本解离去宿主实验前，解离后选取不同的组分进行实验，提取浓度降低、人源降低即说明通过组织解离作用后去宿主效果更优；检出物种数、微生物占比、病原检出性能等都优于对照组。综上说明细胞解离酶对组织样本解离去宿主有正向作用，且病原检出性能显著提高。
[0060]
实施例三
[0061]
本实施例说明相同浓度的细胞解离酶应用于mngs病原检测领域病灶组织样本，解离后取解离液和沉淀混合组分进行提取、建库、测序，解离作用后对病原检出等都有正向作用。
[0062]
病灶组织样本准备：取5个临床感染病患者的病灶组织样本，其余实验操作、条件与实施例一保持一致；
[0063]
首先制备celldehost酶工作液：取celldehost酶储备液在室温条件下融化，在超净工作台中用dehostbuffer将酶储备液稀释成酶浓度20mg/ml的工作液；
[0064]
解离处理：取200μl的工作液加到含病灶组织的1.5mlep管中，在37℃的温度条件、1000rpm的转速条件下进行金属浴消化，处理时间为20min。在实施例二中证明解离后液体、
沉淀各单组分病原检出性能显著提升，故本实施例丢弃100μl解离液，用剩余的液体和沉淀混合组分按照“金匙医学”组织样本解离去宿主常规处理后进行提取、建库；
[0065]
其中以上对照组、测试组均设置两个技术重复，其余实验操作、条件与实施例一保持一致；结果如表4、表5所示。
[0066]
表4细胞解离酶对组织样本提取、建库、检出的影响
[0067][0068][0069]
表5细胞解离酶对组织样本病原检出性能的影响
[0070][0071]
由表4、表5可以看出，测试组将细胞解离酶应用于组织样本解离去宿主前，解离后保留部分液体和沉淀混合组分进行实验，提取的浓度降低、人源降低即说明通过组织解离作用后去宿主效果更优；检出物种数、微生物占比、病原检出性能等都升高，说明细胞解离酶对组织样本解离去宿主有正向作用，且病原性能检出显著提高。
[0072]
综上，三个实施例说明不同的celldehost酶浓度、选取解离后不同的组分进行去宿主实验，都能获得积极的正向效果。
[0073]
以上所述的实施例仅用来说明本发明的技术思想及特点，目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能以实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的作用及同等变化或修饰，仍在本发明的专利范围内。

技术特征：
1.一种应用于mngs病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法，其特征是：包括以下步骤，s1、制备cell dehost酶体系：采用dehost buffer将cell dehost混合酶干粉溶解至浓度为100mg/ml，溶解后采用0.22μm的膜进行过滤，将过滤液在-20℃的温度条件下保存在棕色ep管中作为酶储备液；cell dehost混合酶干粉含有酪蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶且混合酶干粉的活力≥250u/mg；s2、准备病灶组织样本：在生物安全柜内用无菌刀片从采样后的组织块上切取病灶组织，并将切碎的病灶组织转移至ep管内；s3、解离处理：采用dehost buffer将cell dehost酶储备液稀释成低浓度的工作液，取工作液添加到含有病灶组织的ep管中，将ep管置入金属浴中消化20min，金属浴的温度条件为37℃、转速条件为1000rpm，解离后组织块消失并且液体中呈现少量絮丝状物；s4、去宿主：将解离得到的200μl液体并瞬时离心，去掉上层的100μl清液，获取下层100μl含絮状组分的液体；向前述100μl液体内补充106μl的pbs缓冲液，即总体系是206μl，加入去宿主试剂并混匀，在37℃的温度条件下孵育10min进行人源细胞裂解以及人源gdna释放、消化过程，获得去宿主后的产物。2.如权利要求1所述的应用于mngs病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法，其特征是：dehostbuffer的成分及含量为nacl 8.00～8.05mg/ml、na2hpo40.05～0.06mg/ml、kcl 0.39～0.42mg/ml、kh2po40.05～0.06mg/ml、mgso40.09～0.11mg/ml、cacl20.13～0.14mg/ml、d-葡萄糖0.98～1.03mg/ml、nahco30.33～0.36mg/ml，配制后缓冲液的ph值为7.2～7.4。3.如权利要求2所述的应用于mngs病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法，其特征是：步骤s3中稀释后的工作液浓度为10～20mg/ml。

技术总结
本发明涉及一种应用于mNGS病原检测的病灶组织样本解离去宿主方法。包括以下步骤，S1、制备cell deHost酶体系：采用deHost buffer将cell deHost混合酶干粉溶解至浓度为100mg/mL，溶解后采用0.22μm的膜进行过滤，将过滤液在-20℃的温度条件下保存在棕色EP管中作为酶储备液；cell deHost混合酶干粉含有酪蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶且混合酶干粉的活力≥250U/mg；S2、准备病灶组织样本；S3、解离处理；S4、去宿主。本发明实现了mNGS病原检测中组织样本的细胞分散，提高去宿主的效果，提升病原菌的检出性能，降低因人源占比高造成的病原漏检情况，提升mNGS测序数据的准确性。本发明操作流程简单，通过增加试剂孵育步骤，让组织块充分消化成分散的细胞团或单细胞状态，高效地实现解离去宿主效果。效地实现解离去宿主效果。


技术研发人员：郑琪 穆洪霞 刘浩 张宝龙 王政委 蒋智
受保护的技术使用者：天津金匙医学科技有限公司 金匙智造（天津）医疗科技有限公司
技术研发日：2023.05.11
技术公布日：2023/8/14