三种选择性PARP1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用

三种选择性parp1抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明属于药物技术领域，具体涉及三种具有选择性parp1抑制活性的化合物在制备治疗卵巢癌药物中的应用。


背景技术：

2.肿瘤严重威胁着人类的健康，是导致人类死亡的第二大杀手。据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症数据，乳腺癌已取代肺癌成为全球第一大肿瘤。在中国，乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，发病率位居女性恶性肿瘤之首。目前，最新的美国国家综合癌症网络(national comprehensive cancer network，nccn)指南仍推荐乳腺癌癌的一线化疗方案为铂剂+紫杉醇，但是患者容易对顺铂产生耐药性，导致一线化疗失败。针对一线化疗失败后，尚无公认有效的二线化疗方案。因此，寻找并开发针对特异性靶点的靶向药物，是目前治疗乳腺癌的研究热点。
3.近几年，随着基因诊断技术的发展，以基因检测为基础的“精准治疗”成为治疗疾病的重要手段。乳腺癌有着显著的家族遗传倾向，研究发现，这种遗传倾向主要是由基因突变引起的，主要是乳腺癌易感基因brca1和brca2基因突变。正常人罹患卵巢癌的几率较低(《1.5％)，但brca1/2基因突变的人群发病风险显著增加。
4.聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂可靶向杀灭brca缺陷型的肿瘤细胞，使得parp抑制剂的研发成为热点。随着parp抑制剂的相继上市，为乳腺癌患者带来了希望，但目前上市的parp抑制剂还存在一定的缺陷型。olaparib是第一个获批上市的parp抑制剂，用于治疗晚期卵巢癌。但olaparib存在一定的缺陷：体内活性较弱，且生物利用度偏低；并且olaparib对其他parp家族成员没有选择性。因此，开发活性更高，生物利用度高的特异性parp1抑制剂具有重要的临床应用价值。目前上市的parp抑制剂没有选择性，可抑制parp1和parp2，这可能是目前上市parp抑制剂类药物毒副作用和耐药性产生的一大原因，因此开发新型选择性parp1抑制剂有望解决上述问题。
5.本发明涉及三种选择性parp1抑制剂在药物领域中的应用，现有技术中没有本发明提供的三种选择性parp1抑制剂及其作为有效成分的药物的报道，也没有此三种选择性parp1抑制剂或其药物组合物应用在制备或治疗各种因素引起的肿瘤等疾病药物中的报道。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种选择性parp1抑制剂及其制备和应用，该抑制剂以化合物(i-iii)中的一种或多种为活性成分，可显著抑制parp1活性，有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡和周期阻滞，具有显著的抗肿瘤活性。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明的目的之一是提供三种选择性parp1抑制剂(i-iii)，其化学结构式如下：
[0009][0010]
上述式(i)、式(ii)和式(iii)化合物的英文名称分别为：3-methyl-4-((e)-(2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1-(5-((e)-(2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1h-benzo[d]imidazol-2-yl)-1h-pyrazol-5-ol；
[0011]
(e)-1-(5-bromo-1h-benzo[d]imidazol-2-yl)-3-methyl-4-((2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1h-pyrazol-5-ol；
[0012]
(e)-1-(5-((2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1h-benzo[d]imidazol-2-yl)-1h-pyrazol-5-ol。
[0013]
所述三种化合物(i-iii)可选择性抑制parp1活性，对parp2抑制活性较弱。
[0014]
本发明的目的之二是提供一种所述选择性parp1抑制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。所述的三种化合物(i-iii)可以作为药物有效成分，加以药学上可接受的载体，制备抗肿瘤药物组合物；尤其用于制备抗肿瘤有关疾病的药物。所述预防或治疗抗肿瘤药物中的应用，特别的是制备预防或治疗乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，肝癌，结肠癌药物中的应用；优选的，在制备预防或治疗brca缺陷型乳腺癌药物中的应用。
[0015]
本发明的目的之三是提供一种药物组合，包括三种上述parp1抑制剂(i-iii)、三种化合物(i-iii)药学上可接受的盐及三种化合物(i-iii)的化学等价物中的一种或二种以上，所述三种化合物、三种化合物药学上可接受的盐及三种化合物的化学等价物中的一种或二种以上混合作为活性成分的药物在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。
[0016]
本发明的有益效果：
[0017]
本发明的抑制剂以化合物(i-iii)中的一种或多种为活性成分，具有很强的选择性parp1抑制活性。本发明将上述三种化合物(i-iii)进行了体外parp1和parp2酶活检测实验、抗肿瘤细胞增殖活性实验、诱导肿瘤细胞凋亡实验和影响肿瘤细胞周期实验。实验结果表明，所述的三种化合物(i-iii)可选择性抑制parp1活性，抑制brca缺陷型肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡并能影响肿瘤细胞周期，具有显著抗肿瘤活性，具有极高的应用前景。
附图说明
[0018]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获
得其他的附图。
[0019]
图1为化合物(i～iii)对mda-mb-436细胞凋亡作用图；
[0020]
图2为化合物(i～iii)对mda-mb-436细胞周期影响图。
具体实施方式
[0021]
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022]
验证例1：化合物(i-iii)的parp1和parp2抑制活性检测
[0023]
使用市售的parp-1化学发光分析试剂盒(bps bioscience，目录号80551)来测量化合物的抑制活性。将5
×
组蛋白混合物添加到384孔板中，并在4℃下孵育过夜。然后，在各种浓度的抑制剂和含有parp-1酶的parp缓冲液之间发生核糖基化反应。用链霉亲和素-hrp处理该板，然后加入elisa混合溶液。使用链霉亲和素-hr催化的显色反应确定附着在组蛋白上的生物素化底物的含量，该反应可间接反映不同干预条件下parp-1的活性。
[0024]
使用市售的parp-2化学发光分析试剂盒(bps bioscience，目录号80553)来测量化合物的抑制活性。具体实验方法同上。
[0025]
结果如表1所示，化合物(i～iii)对parp1有显著抑制活性，而对parp2的抑制活性较弱，化合物(i～iii)可作为选择性parp1抑制剂。
[0026]
表1化合物(i～iii)对parp1和parp2抑制活性检测
[0027][0028]
验证例2：化合物(i-iii)对肿瘤细胞增殖抑制作用检测
[0029]
采用mtt法检测化合物(i～iii)对brca-1突变的人乳腺癌mda-mb-436细胞和野生型人乳腺癌mcf-7细胞的增殖抑制作用增殖的影响。取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化重悬后接种于96孔板，每孔5000个细胞，培养过夜后加入化合物(i～iii)(1μm、2.5μm、5μm、10μm和20μm)和阳性对照olaparib于37、℃5％ co2条件下作用48h。加入20μl，5mg/ml的mtt，于37、℃5％ co2条件下孵育4h，吸弃上清液，每孔加入150μl dmso，震荡10min，酶标仪490nm波长下检测od值，并计算细胞抑制率和半数抑制浓度(ic
50
)。
[0030][0031]
结果如表2所示，化合物(i～iii)对brca-1突变的人乳腺癌mda-mb-436有显著抑制作用，对野生型mcf-7细胞都没有生长抑制作用。尤其是化合物(iii)对brca-1突变的人乳腺癌mda-mb-436的抑制作用最强(ic
50
为7.4μm)，且抑制活性优于阳性对照olaparib。
[0032]
表2化合物(i～iii)对肿瘤细胞的ic
50
值
[0033][0034]
验证例3：化合物(i～iii)对mda-mb-436细胞凋亡的影响
[0035]
细胞凋亡检测采用annexinv/pi染色法。取对数期mda-mb-436，调整细胞浓度为5
×
105/ml，接种于六孔板，于37，℃5％ co2培养箱中培养过夜。加入化合物(i～iii)(2.5μm)于37、℃5％ co2条件下作用48h。细胞用不含edta的胰酶消化，pbs洗涤三次，加入500μl的binding buffer悬浮细胞成细胞悬液后加入5μl annexin v-fitc和5μl propidium iodide，混匀后室温避光反应15min，于流式细胞仪进行检测。
[0036]
化合物(i～iii)对mda-mb-436细胞凋亡作用图如图1所示(与空白组相比，**p《0.01)，化合物(i～iii)均可诱导mda-mb-436细胞发生剂量依赖性的凋亡，最高诱导的凋亡比例可达64.6％。验证例4：化合物(i～iii)对mda-mb-436细胞周期的影响
[0037]
对细胞周期的分析采用pi单染的方法。取对数期mda-mb-436细胞，调整细胞浓度为5
×
105/ml，接种于六孔板，于37℃，5％ co2培养箱中培养24h。加入化合物(i～iii)(2.5μm)于37、℃5％ co2条件下作用48h。细胞经0.25％胰蛋白酶消化后离心收集，用75％的冷乙醇重悬并置于-20℃过夜。细胞离心并用pbs洗涤两次，用pbs重悬细胞加入20μg/ml的rnase a于37℃孵育30min，然后细胞加入50μg/ml的pi室温避光孵育30min后于流式细胞仪进行检测。
[0038]
结果显示，化合物(i～iii)均可诱导mda-mb-436细胞周期阻滞在g2/m期，其中化合物(iii)的作用最为显著。化合物(i～iii)对mda-mb-436周期的影响见图2。

技术特征：
1.三种选择性parp1抑制剂，其特征在于，结构式分别如下：2.按照权利要求1所述的parp1抑制剂，其特征在于，化学名称中文分别为：英文名分别为：3-methyl-4-((e)-(2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1-(5-((e)-(2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1h-benzo[d]imidazol-2-yl)-1h-pyrazol-5-ol；(e)-1-(5-bromo-1h-benzo[d]imidazol-2-yl)-3-methyl-4-((2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1h-pyrazol-5-ol；(e)-1-(5-((2-(thiazol-2-yl)hydrazono)methyl)-1h-benzo[d]imidazol-2-yl)-1h-pyrazol-5-ol。3.按照权利要求1所述的三种parp1抑制剂，其特征在于，所述三种化合物可选择性抑制parp1活性，对parp2抑制活性较弱。4.一种药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分为权利要求1所述的三种化合物、三种化合物药学上可接受的盐及三种化合物的化学等价物中的一种或二种以上，所述三种化合物、三种化合物药学上可接受的盐及三种化合物的化学等价物中的一种或二种以上混合作为活性成分的药物在制备parp抑制剂类药物中的应用。5.一种药物组合物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分为权利要求1所述的三种化合物、三种化合物药学上可接受的盐及三种化合物的化学等价物中的一种或二种以上，所述三种化合物、三种化合物药学上可接受的盐及三种化合物的化学等价物中的一种或二种以上混合作为活性成分的药物在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。6.根据权利要求4～5所述的应用，其特征在于，所述的药物为片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂或注射剂，但不局限于以上剂型。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述预防或治疗抗肿瘤药物中的应用，特别的是制备预防或治疗乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌，肝癌，结肠癌药物中的应用；更特别的是在制备预防或治疗brca缺陷型乳腺癌药物中的应用。

技术总结
本发明涉及三种新型选择性PARP1抑制剂及该类化合物的组合，在制备抗肿瘤药物中的应用，所述化合物的化学结构如下：本发明中三种化合物(I-III)均可选择性抑制PARP1活性，对PARP2抑制活性较弱；同时三种化合物(I-III)可抑制BRCA-1突变型乳腺癌细胞MDA-MB-436的增殖，并诱导MDA-MB-436细胞凋亡和G2/M期周期阻滞。436细胞凋亡和G2/M期周期阻滞。436细胞凋亡和G2/M期周期阻滞。


技术研发人员：贾克倩 郭传龙
受保护的技术使用者：青岛科技大学
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/14