一种稀土金属基三元复合抗菌剂及其制备方法与流程

1.本发明属于复合抗菌剂领域，尤其是涉及一种稀土金属基三元复合抗菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.细菌感染一直是全球经济，特别是人类健康的严重威胁。在全球范围内抗击新型冠状病毒的战斗中，更重要的挑战是紧急应对抗击病毒和细菌过程中面临的危害。尽管抗生素通过抑制蛋白质合成或阻止dna复制在有效抑制或杀死细菌方面做出了重大贡献，但患者中耐药菌株的出现再次把对抗细菌推上高潮。以高效、安全的抗菌材料作为抗生素替代品，开发一类新型抗菌材料已成为趋势。近年来，新开发的抗菌材料已广泛应用于医疗、食品包装、水处理、生物医药等领域。随着纳米技术的发展，人们致力于发现新的抗菌纳米复合材料，包括在多金属氧簇 (poms)和阳离子聚合物、蛋白质、特定肽或其他生物分子之间构建的抗菌纳米复合材料。
3.poms是由过渡金属组成的带负电荷的纳米团簇，主要是铕(eu)、钼(mo)、钨(w)、钒(v)和氧(o)，其结构的多样性和理化性能的优异性使其在材料科学、光化学和电化学、蛋白晶体学、催化、特别是医学等领域得到广泛应用。生物靶标分子和poms之间易调节的结合模式，有利于增强其生物活性，这也吸引了科学家在抗糖尿病、抗肿瘤和抗病毒方面的研究。poms和生物分子之间的靶向静电相互作用具有明显的生物优势，其中带负电荷的金属团簇大多位于蛋白质/多肽的带正电荷区域内或其附近。基于poms的纳米复合材料的抗菌研究是近些年的研究热点，如何进一步提高poms的抗菌性能是本领域的研究热点，在扩大poms在抗菌领域的应用具有重要意义。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种稀土金属基三元复合抗菌剂及其制备方法。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种稀土金属基三元复合抗菌剂，所述抗菌剂由包括gl-22、含eu的多金属氧簇、spm的原料制备而得。
6.优选地，所述gl-22、含eu的多金属氧簇、spm的摩尔浓度比为1：（1 ~ 2）：（5 ~ 10）。
7.优选地，所述gl-22肽、含eu的多金属氧簇、spm的摩尔浓度比为1 ：1 ：5。
8.优选地，所述含eu的多金属氧簇为na
x
[euw
10o36
]
•
yh2o，其中x取自8、9、10，y取自30、31、32、33、34、35。
[0009]
优选地，所述na
x
[euw
10o36
]
•
yh2o中x为9，y为32。
[0010]
优选地，所述na
x
[euw
10o36
]
•
yh2o的制备方法包括如下步骤：将na2wo4•
2h2o溶解在蒸馏水中后调节ph值至7.0～7.5，将包含eu(no3)3•
6h2o的水
溶液逐滴加入上述溶液中，在80～90℃搅拌，冷却至室温，得到结晶的na
x
[euw
10o36
]
•
yh2o。
[0011]
优选地，所述na2wo4•
2h2o与eu(no3)3•
6h2o的质量比为（8.0 ~ 9.0）：（1.0 ~ 1.3）。
[0012]
本发明还提供了上述稀土金属基三元复合抗菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：s1：构建二元组装体；将含eu的多金属氧簇分别与spm和gl-22在ph值为6 ~ 7的mes-naoh缓冲液中混合均匀，室温孵育5 ~ 15 min后，分别得到euw
10
/gl-22二元组装体和euw
10
/spm二元组装体；s2：构建三元组装体；在ph值为6 ~ 7的mes-naoh缓冲液中，向euw
10
/gl-22中加入spm以及向euw
10
/spm中加入gl-22，室温孵育5 ~ 15min后，分别得到结构为euw
10
/spm/gl-22和euw
10
/gl-22/spm三元组装体，即得稀土金属基三元复合抗菌剂。
[0013]
优选地，所述gl-22、含eu的多金属氧簇、spm的摩尔浓度比为1：（1 ~ 2）：（5 ~ 10）。
[0014]
优选地，所述含eu的多金属氧簇为na
x
[euw
10o36
]
•ꢀ
yh2o，其中x取自8、9、10，y取自30、31、32、33、34、35。
[0015]
相对于现有技术，本发明具有以下优势：（1）本发明的稀土金属基三元复合抗菌剂将na
x
[euw
10o36
]
•
yh2o与多肽和生物胺分级复合后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有高效抗菌功能，三元组装体euw
10
/gl-22/spm的荧光发射增强30 ~ 40倍，对大肠杆菌（e.coli）的抗菌性能由30% ~ 40%提升至90% ~ 95%，对e.coli的生物膜(bme)形成抑制率为21.8%。
[0016]
（2）在本发明使用weakley型pom：na
x
[euw
10o36
]
•
yh2o (euw
10
)、精胺(spm)和来自hpv e6早期癌蛋白高危亚型的富含精氨酸的多肽(gl-22)构建了三元组装体，在两者表面都带正电荷的情况下，spm和gl-22与euw
10
之间并没有形成竞争性结合，而是发生了协同作用，从而导致荧光发射逐步增强，显著提高了其抗菌活性。此外，通过荧光光谱、dls、zeta-potential和透射电子显微镜(tem)结果表明，形成的纳米球状的三元组装体是由各组分之间的静电协同作用主导的。euw
10
的发光增强主要归因于：与spm和gl-22组装后屏蔽了环境中的水分子，当组装体与大肠杆菌(e.coli)孵育时，产生的大量ros杀死细菌。因此，euw
10
/spm/gl-22组装体被认为是一个具有广泛抗菌活性的新型稀土材料。以euw
10
和gl-22组成的纳米粒子为模型，这为制备具有固体荧光的稀土无机材料开辟了道路，并通过ros的产生扩展了poms的抗菌机制。
[0017]
（3）本发明制备的基于hpv e6富含精氨酸的肽段(gl-22)与无机含稀土金属的pom (euw
10
)和生物胺(spm)，构建的三元组装体具有显著的发光和抗菌增强效应。该组装体具有较强的生物膜破坏、膜穿透和bme自适应的ros生成的特点，这导致了生物膜的快速消除，并大大提高了抗菌活性。euw
10
组装体抗菌性能增强的内在机制主要是：euw
10
的类过氧化物酶活性和bme中内源性过氧化氢(h2o2)，促进了抗菌过程中ros的生成。因此，细菌和bme中所涉及的h2o2对增强ros的产生起着至关重要的作用。
[0018]
（4）本发明中含稀土的多金属氧簇复合新材料解决了的生物膜感染问题，达到了优异的抗菌效果。本发明构建一种新型生物无机复合抗菌材料的概念，并将有助于促进稀土金属与生物胺/多肽的组装结构来开发新型抗病毒药物。
附图说明
[0019]
图1为实施例2制备的二元组装体的荧光光谱图；图2为实施例3制备的三元组装体的荧光光谱图；图3为制备二元组装体过程中粒径大小变化图；图4为制备二元组装体过程中的粒径变化趋势图；图5为三元组装体的透射电镜图(tem)；图6为二元组装体制备过程中的表面电势变化情况图；图7为三元组装体制备过程中的表面电势变化情况图；图8为实施例6不同组装体对大肠杆菌的抗菌试验过程照片；图9为实施例6不同组装体的大肠杆菌存活率统计图；图10为实施例6不同组装体对金黄色葡萄球菌的抗菌试验过程照片；图11为实施例6不同组装体的金黄色葡萄球菌存活率统计图；图12为不同组装体的ros生成量；图13为不同组装体的e.coli的生物膜形成情况；图14为不同组装体与e.coli孵育后细菌生物膜在595 nm处的吸收情况。
具体实施方式
[0020]
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂如下：精胺(spm)、2
′
,7
′‑
二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh-da)和结晶紫购自阿拉丁化学有限公司。
[0021]
hpv e6蛋白grwtgrcmsccrssrtrretql序列的gl-22肽，由阿普肽有限公司(中国上海)订购，经公司hplc检测，纯度高于99%。
[0022]
na9[euw
10o36
]
·
32h2o，以下简称euw
10
。
[0023]
2-(n-morpholino)乙磺酸(mes)和氢氧化钠(naoh)购自北京化工厂(北京，中国)，所有的化学物质都未经进一步处理使用，蒸馏水(ρ=18.2 mω
·
cm, 25℃)来自millipore milli-q净水系统。此外，以10.0 mm的mes和naoh为原料，用蒸馏水制备了10.0 mm、ph = 6.0的mes-naoh缓冲液。在2.0 mm的水溶液中分别制备euw
10
和spm的原液，并置于黑暗条件下(4℃)储存，然后根据不同的实验要求稀释到所需浓度。luria broth (lb)购自sigma-aldrich, wicklow, ireland)。革兰氏阴性菌e.coli和金黄色葡萄球菌s.aureus来自北京四环生物制药有限公司。如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0024]
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
[0025]
实施例1 na9[euw
10o36
]
·
32h2o (euw10)的制备与纯化将8.3g na2wo4·
2h2o溶解在20 ml 蒸馏水中，用乙酸(ch3cooh)调节ph至7.0～7.5。将包含1.1g eu(no3)3·
6h2o的2 ml的水溶液逐滴加入上述溶液中，在80～90℃搅拌，冷却至室温，得到结晶的na9[euw
10o36
]
·
32h2o，过滤后，在空气中干燥得到na9[euw
10o36
]
·
32h2o。
[0026]
实施例2 构建euw
10
/gl-22和euw
10
/spm二元组装体
将12.5μl gl-22 (2.0 mm)与euw
10
(50 μm)在mes-naoh (10.0 mm, ph=6.5) 缓冲液中混合均匀，使得终体积为1.0 ml，室温孵育10 min后，构建得到euw
10
/gl-22二元组装体。
[0027]
将不同体积的0～125 μl spm(2.0 mm)添加到包含25 μl2.0 mm euw
10
的mes-naoh (10.0 mm, ph=6.5)缓冲溶液中并剧烈搅拌。每组混合溶液的终体积固定在1.0 ml。室温孵育10 min后，构建得到euw
10
/spm二元组装体，在500 nm的激发波长下记录每组混合溶液的荧光光谱。
[0028]
结果如图1所示，实施例2制备的euw
10
(50 μm)和spm（0.25～50 μm，从下往上依次为：0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00、10.0、15.0、25.0、35.0、50.0 μm）在580～635 nm波段的荧光光谱。结果发现：向含有euw
10
的溶液中滴定spm，荧光发射逐渐增强，当spm浓度为50 μm时达到最大值，591 nm处的荧光发射增强了21.92倍，这证实了euw
10
与spm之间较强的结合力。通过比例优化，最终确定euw
10
和spm的浓度分别为50 μm和50 μm。
[0029]
实施例3 构建euw
10
/spm/gl-22和euw
10
/gl-22/spm的三元组装体在含有实施例2制备得到的二元组装体euw
10
/spm (50 μm/50 μm)的mes-naoh (10.0 mm, ph=6.5) 缓冲液中加入2.0 mm，体积为0.5 ~ 30 μl的gl-22，使得终体积为1.0 ml。室温孵育10 min后，在500 nm的激发波长下记录荧光光谱变化。euw
10
/gl-22/spm的构建与上述相同，但组分添加顺序不同。
[0030]
结果如图2所示，向含有euw
10
/spm (50 μm/50 μm)组装体的溶液中（图1的基础上）进一步滴定gl-22（0～35μm，从下往上依次为0、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00、5.00、10.0、15.0、25.0、35.0），测试其在580～635 nm波段的荧光光谱，结果发现：其荧光发射持续增强，在gl-22的浓度为35.0 μm时，荧光达到最大值。
[0031]
实施例4 二元组装体及三元组装体的粒径和电势变化趋势将实施例2制备二元组装体过程中euw
10
/spm (50 μm/50 μm)与gl-22（0～70 μm，从左往右依次为：0、0.5、1.0、2.5、5.0、10、15、25、35、50、70 μm）形成的组装体的粒径大小变化。dls结果如图3所示，可以看出：euw
10
/spm组装体在缓冲液中的平均粒径为37.8 nm，当引入5 μm的gl-22后，组装体的尺寸增加至50.7 nm；当gl-22的浓度增加到35.0 μm时，其粒径增大到165 nm。最后，当70 μm gl-22引入后，粒径增加到295 nm左右。图4为图3的粒径变化趋势图，可以看出：随着gl-22的滴定，组装体的粒径依次增大，这证实了euw
10
/spm/gl-22形成较大的组装体结构。
[0032]
实施例3制备三元组装体过程中（a）euw
10
/spm/gl-22 (50 μm/50 μm/5 μm)和（b）euw
10
/spm/gl-22 (50 μm/50 μm/50 μm)的透射电镜图(tem)如图5所示，可以看出：当5 μm gl-22加入到含有euw
10
/spm组装体的溶液中时，颗粒呈单分散，平均直径为51.0 nm。当gl-22增加到50 μm，交联的网状结构变得紧密，部分聚集体开始扩大至约为250 nm的球形颗粒。
[0033]
实施例2的二元组装体制备过程中euw
10
(50 μm)与spm（0.25～50 μm，从左往右依次为：0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、10.0、15.0、25.0、35.0、50.0 μm）的表面电势变化情况如图6所示，可以看出：当spm的浓度为40 μm时，表面电势趋近于0 mv，而后随着spm浓度的增加，电势呈增长趋势。当spm浓度增加到80 μm时，组装体表面饱和，表面电势趋近于60 mv，接近平衡，这进一步证实了euw
10
和两组分之间的静电驱动作用。
[0034]
实施例3的二元组装体制备过程中euw
10
/spm (50 μm/50 μm)与gl-22（0.25～50 μm，从下往上依次为：0、3.00、5.00、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μm）的表面电势变化情况如图7所示，可以看出：当引入3.00 μm spm后，表面电势接近0 mv，随着spm浓度的升高，组装体的表面电势呈逐渐增加趋势。
[0035]
实施例5革兰氏阴性菌e.coli和金黄色葡萄球菌s.aureus的培养将mrsa单菌落接种到luria-bertani (lb)琼脂培养基中，在37℃、180rpm条件下培养14 ~ 16 h，得到不同类型菌的悬液，光密度在600 nm (od
600
)的紫外吸收值用来评估e.coli和s.aureus的生长情况，该发明中控制od
600
=0.4 ~ 0.6。
[0036]
实施例6 琼脂平板抗菌试验将原料euw
10
(12.5 μm)、spm (12.5 μm)、gl-22 (6.25 μm) 在磷酸盐缓冲溶液(pbs，阴性对照)中组装成二元(euw
10
/spm、euw
10
/gl-22、gl-22/spm)以及三元(euw
10
/spm/gl-22、euw
10
/gl-22/spm)的不同组装体，分别与e.coli悬液(od
600
= 0.2)和s.aureus悬液(od
600
= 0.2)混合。37℃孵育3 h后，将0.2 ml稀释的菌悬液平铺于lb琼脂上，在37℃孵育18 h，用标准平板计数法测定细菌的存活率，并拍摄照片。
[0037]
对大肠杆菌的作用结果如图8和图9所示，在与二元和三元组装体孵育后，观察到大肠杆菌菌落显著减少。根据计数，与空白相比，平板中的单个spm和gl-22对大肠杆菌的生长几乎没有抑制作用，说明它们对大肠杆菌都没有抗菌效果。不同的是，euw
10
对大肠杆菌表现出明显的抑制作用，细菌的存活率为65.22%，当分别与spm和gl-22组合后，大肠杆菌的活性分别降低至31.44%和23.08%。此外，euw
10
/spm/gl-22的三元组装体导致了大肠杆菌的存活率降至0%。
[0038]
对金黄色葡萄球菌的作用结果如图10和图11所示，分别引入euw
10
/spm/gl-22和euw
10
/gl-22/spm后，s.aureus的存活率分别为6.29%和11.10%。与空白相比，6.25 μm gl-22对s.aureus的生长有轻微抑制作用，活性为84.71%；12.5 μm spm对s.aureus生长有明显抑制作用，活性仅剩下2.34%。多项研究表明，外源spm对细菌具有持续积累的毒性，其自身对细菌的抑制作用较强。此外，将gl-22加入到euw
10
/spm的组装体中进一步提高了抗菌能力，其细菌存活率仅为0.25%。同样地，euw
10
/gl-22/spm导致s.aureus的存活率下降到0.12%。
[0039]
实施例7 ros的测定分别用euw
10
、spm和gl-22三种组分及它们的二元或三元组装体处理e.coli，孵育9 h后收集e.coli，用标准法测定细胞内ros含量。细菌样品用30 μl
×
1.0 mm 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(dcfh-da)处理，dcfh-da是ros生成的特定指标，将非荧光的dcfh-da氧化为荧光的dfc，用岛津rf-5301pc荧光分光光度计(λex = 488 nm；λem = 525 nm)。结果如图12所示，可以发现在相同的体外条件下，二元和三元组装体的ros生成量逐渐增加。因此，我们推测，带正电的spm与gl-22在euw
10
表面的结合可能暴露了更多催化活性中心，并在一定程度上促进了ros的产生。
[0040]
实施例8 bme消除试验用96孔微量滴定板，使用结晶紫法评价细菌形成bme的能力。将od
600
= 0.3 ~ 0.5的稀释的e.coli悬液(100μl)与ph = 6.0的800 ~ 900 μl lb培养基共培养e.coli。在37℃下连续培养8 h。采用pbs(对照)、euw
10
、spm、gl-22、spm/gl-22、euw
10
/gl-22、euw
10
/spm、euw
10
/spm/gl-22、euw
10
/gl-22、spm/gl-22/euw
10
等混合溶液处理e.coli后，将细菌bme在37
℃下孵育8 h，待bme形成后，去除上清，然后用灭菌水冲洗每个生物膜孔道，去除样品和死菌。
[0041]
每孔道加入200 μl的0.1%结晶紫染色液，对bme染色30 min。然后，用pbs缓冲液再次清洗每孔道中的bme，在室温下干燥生物膜。最后，每孔道用无水乙醇/醋酸(v/v=1:1)混合，冲洗孔壁上的细菌bme。各组bme使用多功能微板阅读器(thermo scientific, varioskan luk)监测od595的吸收值变化，并使用数码相机记录颜色。结果如图13和图14所示，细菌生物膜附着在物质或组织的表面，它包裹着细胞外的聚合物质，防止抗生素渗透到细菌细胞中因此，产生了对细菌的耐药性，抗生素治疗失败。因此，生物膜的去除在抗菌检测中至关重要。本发明采用结晶紫染色法研究单个euw
10
、spm和gl-22或其组装体的生物膜形成和消除。利用pbs(空白对照)、euw
10
、spm、gl-22、euw
10
/gl-22、euw
10
/spm、euw
10
/spm/gl-22、euw
10
/gl-22/spm(从上到下)与e.coli孵育后，结晶紫染色后细菌生物膜的消除效果分析。图13中没有药剂处理的对照组显示为深蓝色，这表明在当前条件下e.coli的生物膜形成情况。图13中不同组装体与e.coli孵育后，利用结晶紫染色后的细菌生物膜在595 nm处的吸收情况分析。由图14可以看出，单独的euw
10
和spm处理后，蓝色明显降低，紫外可见分光光度计分析得出，生物膜保留率分别为30 ~ 40%和20 ~ 25%，而gl-22的影响相对较低(60 ~ 65%)。引入euw
10
/gl-22和euw
10
/spm组装体后，生物膜形成的波动较小，分别为38.8%和31.0%。而euw
10
/spm/gl-22和euw
10
/gl-22/spm三元组装体对生物膜有明显的抑制作用，生物膜的形成率分别为26.8%和21.8%。
[0042]
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

技术特征：
1.一种稀土金属基三元复合抗菌剂，其特征在于：所述抗菌剂由包括gl-22、含eu的多金属氧簇、spm的原料制备而得。2.根据权利要求1所述的稀土金属基三元复合抗菌剂，其特征在于：所述gl-22、含eu的多金属氧簇、spm的摩尔浓度比为1：（1 ~ 2）：（5 ~ 10）。3.根据权利要求1所述的稀土金属基三元复合抗菌剂，其特征在于：所述gl-22、含eu的多金属氧簇、spm的摩尔浓度比为1 ：1 ：5。4.根据权利要求1所述的稀土金属基三元复合抗菌剂，其特征在于：所述含eu的多金属氧簇为na
x
[euw
10
o
36
]
•
yh2o，其中x取自8、9、10，y取自30、31、32、33、34、35。5.根据权利要求4所述的稀土金属基三元复合抗菌剂，其特征在于：所述na
x
[euw
10
o
36
]
•
yh2o中x为9，y为32。6.根据权利要求4所述的稀土金属基三元复合抗菌剂，其特征在于：所述na
x
[euw
10
o
36
]
•
yh2o的制备方法包括如下步骤：将na2wo4•
2h2o溶解在蒸馏水中后调节ph值至7.0～7.5，将包含eu(no3)3•
6h2o的水溶液逐滴加入上述溶液中，在80～90℃搅拌均匀，冷却至室温，得到结晶的na
x
[euw
10
o
36
]
•
yh2o。7.根据权利要求6所述的稀土金属基三元复合抗菌剂，其特征在于：所述na2wo4•
2h2o与eu(no3)3•
6h2o的质量比为（8.0 ~ 9.0）：（1.0 ~ 1.3）。8.权利要求1 ~ 7任一所述的稀土金属基三元复合抗菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：s1：构建二元组装体；在ph值为6 ~ 7的mes-naoh 缓冲液中，将含eu的多金属氧簇分别与spm和gl-22混合均匀，室温孵育5 ~ 15 min后，分别得到euw
10
/gl-22二元组装体和euw
10
/spm二元组装体；s2：构建三元组装体；在ph值为6 ~ 7的mes-naoh 缓冲液中，向euw
10
/gl-22中加入spm，向euw
10
/spm中加入gl-22，室温孵育5 ~ 15min后，分别得到结构为euw
10
/spm/gl-22和euw
10
/gl-22/spm的三元组装体，即得稀土金属基三元复合抗菌剂。9.根据权利要求8所述的稀土金属基三元复合抗菌剂的制备方法，其特征在于：所述gl-22、含eu的多金属氧簇、spm的摩尔浓度比为1：（1 ~ 2）：（5 ~ 10）。10.根据权利要求8所述的稀土金属基三元复合抗菌剂的制备方法，其特征在于：所述含eu的多金属氧簇为na
x
[euw
10
o
36
]
•
yh2o，其中x取自8、9、10，y取自30、31、32、33、34、35。

技术总结
本发明提供了一种稀土金属基三元复合抗菌剂及其制备方法，所述抗菌剂由包括GL-22、含Eu的多金属氧簇、Spm的原料制备而得。本发明的稀土金属基三元复合抗菌剂将含Eu的多金属氧簇与多肽和生物胺分级复合后，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有高效抗菌功能，三元组装体EuW


技术研发人员：张春霞 张光睿 刘岗 李璐 孙丕智 赵长玉 彭维 阚丽欣
受保护的技术使用者：天津包钢稀土研究院有限责任公司
技术研发日：2023.05.09
技术公布日：2023/8/14