一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用。


背景技术：

2.口蹄疫(foot-and-mouth disease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，fmdv)引起的一种以在口腔粘膜、四肢下端及乳房皮肤形成水疱或烂斑，幼年动物多因心肌受损而死亡率较高为主要特征的急性、高度接触性传染病。
3.目前，主要利用疫苗接种和扑杀手段来控制fmd的传播。预防该病的主要方法是fmd灭活疫苗的免疫接种，但只能提供短期保护作用，对七种血清型具有血清型特异性，而且存在fmdv不完全灭活和病毒逃逸的潜在风险，使得新型疫苗的研究成为fmd研究的重点。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法，为fmd疫苗的研制提供良好的免疫原。
5.本发明提供了一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，以腺病毒为基础毒株，重组表达fmdv灭活疫苗毒株衣壳蛋白前体p12a和3b3c。
6.优选的，所述口蹄疫病毒灭活疫苗毒株包括o型fmdv灭活疫苗毒株或a型fmdv灭活疫苗毒株。
7.优选的，所述o型fmdv灭活疫苗毒株包括ozk93和/或oa58；
8.所述a型fmdv灭活疫苗毒株包括fmdv灭活疫苗毒株af72。
9.优选的，ozk93来源的p12a的氨基酸序列如seq id no:1所示；
10.ozk93来源的3b3c的氨基酸序列如seq id no:2所示；
11.af72来源的p12a的氨基酸序列如seq id no:3所示；
12.af72来源的3b3c的氨基酸序列如seq id no:4所示；
13.oa58来源的p12a的氨基酸序列如seq id no:5所示；
14.oa58来源的3b3c的氨基酸序列如seq id no:6所示。
15.本发明提供了所述重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
16.1)分别扩增编码衣壳蛋白前体p12a和3b3c的序列，连接后，得到的p12a3b3c片段插入腺病毒穿梭载体中，得到重组腺病毒穿梭载体；
17.2)将步骤1)中得到的所述重组腺病毒穿梭载体联合腺病毒骨架质粒进行包装，得到重组腺病毒。
18.优选的，扩增编码ozk93来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:7所示的正向引物和核苷酸序列如seq idno:8所示的反向引物；
19.扩增编码ozk93来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如
seq id no:9所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:10所示的反向引物；
20.扩增编码af72来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:11所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:12所示的反向引物；
21.扩增编码af72来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:13所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:14所示的反向引物；
22.扩增编码oa58来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:15所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:16所示的反向引物；
23.扩增编码oa58来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:17所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:18所示的反向引物。
24.本发明提供了一种防控口蹄疫的疫苗，包括佐剂和所述重组腺病毒或所述构建方法得到的重组腺病毒。
25.优选的，所述重组腺病毒包括重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58和radv-p12a3b3c-af72中的一种或几种。
26.优选的，所述radv-p12a3b3c-ozk93和radv-p12a3b3c-af72的滴度比为(5～7)：(3～8)。
27.本发明提供了所述重组腺病毒或所述构建方法得到的重组腺病毒在制备防控口蹄疫疫苗中的应用。
28.本发明提供了一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，以腺病毒为基础毒株，重组表达fmdv灭活疫苗毒株衣壳蛋白前体p12a和3b3c。其中p12a基因表达的是构成口蹄疫衣壳的四种结构蛋白vp4、vp2、vp3、vp1，3c蛋白是切割p12a的主要蛋白酶，3b有利于进一步增强3c剪切力。用p12a3b3c作为免疫抗原构建的重组腺病毒，表现出良好的免疫原性，免疫动物后，产生高滴度抗fmdv抗体和细胞免疫应答。
29.同时，本发明提供的重组腺病毒，免疫动物后，能够针对不同血清型fmdv产生大量抗体，因此，重组腺病毒制备成疫苗后对fmdv防控具有良好的普适性。
附图说明
30.图1为fmdv重组腺病毒构建示意图；
31.图2为pcr获得fmdv-ozk93的p12a和3b3c片段；m：5000dna分子质量标准；1:3b3c片段；2：p12a片段；
32.图3为pcr获得fmdv-ozk93的p12a3b3c片段；m：5000dna分子质量标准；1:p12a3b3c片段；2：阴性对照；
33.图4为fmdv-ozk93-p12a3b3c双酶切；m：5000dna分子质量标准；1:fmdv-ozk93-p12a3b3c片段；
34.图5pdc316-mcmv-egfp载体双酶切；m：10000dna分子质量标准；1-3:pdc316-mcmv-egfp质粒；
35.图6为重组载体pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk93双酶切鉴定；m1：10000dna分子质量标准；1-7:pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk93；m2：5000dna分子质量标准；
36.图7为重组腺病毒目的基因鉴定以及目的蛋白表达检测(a)pcr鉴定1、radv-p12a3b3c-ozk932、radv-p12a3b3c-af723、radv-p12a3b3c-oa584、wtadv 5、hek293cell(b)
ozk93为模板，利用上述引物进行pcr扩增。所述pcr扩增的反应程序优选为：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃4min，34个循环；72℃10min；4℃保存。
52.在本发明中，所述连接，优选采用融合扩增法实现。所述融合扩增法，优选包括两步pcr扩增，第一步的pcr反应中不加入上下游引物，程序为：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃4min，10个循环；72℃10min；12℃∞；反应结束后加入融合所需要的引物p12a-f和3bc-r，进行下一步pcr反应，反应程序为：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃4min，24个循环；72℃10min；12℃∞。连接后，得到的p12a3b3c片段优选进行片段纯化。本发明对所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的片段纯化方法即可。
53.在本发明中，p12a3b3c片段插入腺病毒穿梭载体的方法优选为用noti和aflii限制性内切酶分别对腺穿梭载体和纯化后的p12a3b3c片段进行双酶切，得到的酶切后的p12a3b3c片段和线性化载体连接，经鉴定得到重组腺病毒。本发明对所述双酶切和连接的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的双酶切和连接方法即可。所述noti和aflii限制性内切酶购自takara公司。所述连接用酶优选为t4连接酶。所述t4连接酶购自neb公司。所述腺穿梭载体优选为pdc316-mcmv-egfp。所述鉴定的方法优选为将重组腺穿梭病毒载体转化细菌感受态中，挑选单克隆培养，提取质粒经过双酶切鉴定和测序，得到含有预期片段的重组腺病毒载体为阳性重组腺病毒载体。所述双酶切鉴定的方法优选为采用noti和aflii限制性内切酶进行双酶切，得到2278bp、846bp的条带，说明为阳性质粒。
54.在本发明中，扩增编码af72来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:11所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:12所示的反向引物。扩增编码af72来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:13所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:14所示的反向引物。扩增编码oa58来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:15所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:16所示的反向引物；扩增编码oa58来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:17所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:18所示的反向引物。按照上述方法分别成功构建获得pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-af72和pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-oa58。
55.得到重组腺病毒穿梭载体后，本发明将所述重组腺病毒穿梭载体联合腺病毒骨架质粒进行包装，得到重组腺病毒。
56.在本发明中，所述包装的方法优选为将所述重组腺病毒穿梭载体和腺病毒骨架质粒混合，在转染试剂的作用下处理hek293细胞，当细胞发生大面积噬斑后，收集腺病毒。所述重组腺病毒穿梭载体和腺病毒骨架质粒的质量比为1:4。所述处理hek293细胞的条件优选为37℃、5％co2。
57.本发明提供了一种防控口蹄疫的疫苗，包括佐剂和所述重组腺病毒或所述构建方法得到的重组腺病毒。
58.在本发明中，所述重组腺病毒优选包括重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58和radv-p12a3b3c-af72中的一种或几种。所述radv-p12a3b3c-ozk93和radv-p12a3b3c-af72的滴度比优选为(5～7)：(3～8)，更优选为1:1。
59.本发明提供了所述重组腺病毒或所述构建方法得到的重组腺病毒在制备防控口蹄疫疫苗中的应用。
60.下面结合实施例对本发明提供的一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
61.实施例1
62.一种重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93的构建方法
63.一、重组腺病毒穿梭质粒的构建
64.利用admaxtm腺病毒包装系统进行重组腺病毒的包装。将穿梭质粒pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk93与腺病毒骨架质粒(pbhglox(delta)e1，3cre)共转染至对数期hek293细胞，通过特异性位点重组完成重组腺病毒的包装。fmdv重组腺病毒的构建示意图如图1所示。
65.1)引物设计
66.ncbi上比对fmdv-ozk93毒株与type o isolate wfl(ef175732.1)毒株vp1序列发现序列相似性达99％以上，因此参照type o isolate wfl(ef175732.1)毒株p12a、3b3c序列比对出fmdv-ozk93基因组的p12a、3b3c片段。使用primer premier 6.0设计引物，上游5’端加入noti酶切位点及kozak序列5
’‑
gccgccacc-3’，3’端加入aflii酶切位点，引物序列如表1所示，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
67.表1引物序列
[0068][0069]
2)fmdv重组腺病毒穿梭载体的构建方法
[0070]
①
fmdv-ozk93-p12a、3b3c基因的获得
[0071]
此为生物公司基因合成优化后连接到pdc316上的质粒，可提供构建质粒所插入的fmdv基因。
[0072]
使用2
×
platinum super:green pcr master mix试剂盒以质粒zero-fmdv-ozk93(该质粒是本实验室保存的，因为毒株是不公开的，可提供构建质粒所插入的fmdv基因)为模板进行pcr反应。扩增使用的引物为表1中所列举的上下游引物，扩增体系如下表2所示，pcr反应程序为：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃4min，34个循环；72℃10min；4℃保存。
[0073]
表2目的基因pcr扩增体系
[0074][0075]
以质粒zero-fmdv-ozk93为模板，表1中所列举的上下游引物进行pcr反应。pcr产物通过在1％浓度琼脂糖凝胶上电泳，分离得到大小约为2278bp和846bp的2个条带，这与fmdv-ozk93的p12a、3b3c片段大小一致(图2)。
[0076]
②
fmdv-ozk93-p12a3b3c基因的获得
[0077]
使用2
×
platinum super:greenpcr mastermix试剂盒以上述p12a、3b3c纯化后产物为模板进行融合pcr扩增。扩增体系如下表3所示，扩增分为两步，第一步的pcr反应中不加入上下游引物，程序为：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃4min，10个循环；72℃10min；12℃∞；反应结束后加入融合所需要的引物p12a-f和3bc-r，进行下一步pcr反应，程序为：98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃4min，24个循环；72℃10min；12℃∞。之后140v，25min核酸电泳分离dna片段进行融合pcr产物鉴定，将合适大小的目的片段使用胶回收试剂盒进行p12a3b3c基因的纯化。
[0078]
表3目的基因pcr扩增体系
[0079][0080]
利用融合pcr方法使fmdv-ozk93的p12a和3b3c两个片段融合成p12a3b3c(图3)，之后进行1％浓度琼脂糖凝胶电泳得到大约为3124bp的pcr产物，与预期目的片段p12a3b3c大小一致。
[0081]
③
fmdv-ozk93-p12a3b3c基因与pdc316-mcmv-egfp载体的双酶切
[0082]
使用takara公司的noti和aflii限制性内切酶，分别双酶切pdc316-mcmv-egfp载体和fmdv-ozk93-p12a3b3c基因，酶切体系如下表4、表5所示。体系配好后，轻微震荡混匀，小型离心机上顺离后置于37℃温箱中反应4h，之后进行140v，25min 1％浓度琼脂糖凝胶电泳。将合适大小的fmdv-ozk93-p12a3b3c目的基因片段、pdc316-mcmv-egfp载体片段使用胶回收试剂盒进行纯化，纯化后，使用nano drop软件进行dna浓度测定，测得fmdv-ozk93-p12a3b3c浓度为5.8ng/μl；pdc316-mcmv-egfp浓度为28.7ng/μl。
[0083]
表4双酶切fmdv-ozk93-p12a3b3c基因
[0084][0085]
表5双酶切pdc316-mcmv-egfp载体
[0086][0087][0088]
使用noti和aflii限制性内切酶，分别酶切pdc316-mcmv-egfp载体和fmdv-ozk93-p12a3b3c基因，1％浓度琼脂糖凝胶电泳结果显示：得到下图4、图5中大小合适的fmdv-ozk93-p12a3b3c片段和pdc316-mcmv-egfp载体片段。
[0089]
④
fmdv-ozk93-p12a3b3c基因与pdc316-mcmv-egfp载体的连接
[0090]
利用t4 dna连接酶将pdc316-mcmv-egfp载体和fmdv-ozk93-p12a3b3c基因按照neb官网中的nebio calculator所示的方法以体积比3：1进行连接，连接体系如下表6，体系配好后，轻微震荡混匀，小型离心机上离心后在金属浴中16℃连接过夜。
[0091]
表6载体与目的片段的连接
[0092][0093]
⑤
pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk93的转化
[0094]
具体操作步骤：
[0095]
(1)商品化感受态stbl3从-80℃冰箱取出后放在冰上静置4-5min。
[0096]
(2)待感受态细胞融化后，迅速吸取10μl过夜连接产物加入到50μl感受态中，枪尖轻柔搅动10-20下，注意不要吹打。
[0097]
(3)加完后冰上静置30min。
[0098]
(4)提前设置好的42℃水浴锅中热激90s后(注意不要超时)迅速转移至冰上冰浴2min。
[0099]
(5)加入500ul soc medium/无抗培养基，之后放置在37℃220rpm摇床培养45min。
[0100]
(6)从摇床上取下，3500rpm离心4min后于超净工作台中弃去上清400ul，用100ul重悬菌，吸取重悬菌液从不同方向滴入50μg/ml氨苄霉素抗性的lb固体培养基上，加入玻璃珠晃动至干(若不弃液则吸取200ul滴入到平板培养基)。
[0101]
(7)倒置在37℃温箱培养15h，直到菌落长至合适大小收取平板进行单个菌落挑取扩增。
[0102]
⑥
单个菌落挑取、扩增以及质粒提取
[0103]
于超净工作台中使用20μl高压灭菌过的枪头随机挑取lb固体培养基上的单个菌落，尽量选取边缘圆润光滑的单个菌落(可从不同方向选取3-6个)，接种于含有氨苄霉素的3ml lb液体培养基中，摇床中37℃220r/min过夜培养后，使用axy prep tm plasmid miniprep kit试剂盒进行质粒提取，具体操作步骤详见说明书。
[0104]
⑦
pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk93穿梭载体双酶切鉴定及测序
[0105]
将提取的质粒使用限制性内切酶noti和aflii进行双酶切鉴定，酶切鉴定体系组成如表7，体系配好后，轻微震荡混匀，小型离心机上顺离后置于37℃温箱中反应4h，为了初步确定质粒大小是否正确，酶切后使用140v，20min 1％浓度琼脂糖凝胶电泳分离，将鉴定正确的阳性质粒送至上海生工进行测序。
[0106]
表7阳性质粒双酶切鉴定
[0107][0108]
为了证实构建的fmdv重组腺病毒穿梭质粒中p12a3b3c基因的正确插入，使用noti和aflii限制性内切酶双酶切法鉴定阳性克隆pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk93(图6)。序列测定结果与靶基因100％符合，表明成功构建了fmdv-ozk93的p12a3b3c重组腺病毒载体。
[0109]
⑧
pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-oa58或pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-af72重组腺病毒穿梭载体的构建方法
[0110]
ncbi上比对fmdv-oa58毒株与type o strain akesu/58(genbank:af511039)毒株vp1序列，fmdv-af72毒株与type a isolate a22/irq/24/64(genbank:mn447655.1)毒株vp1序列，发现序列相似性达99％以上，因此参照type o strain akesu/58毒株p12a、3b3c序列比对出fmdv-oa58基因组的p12a、3b3c片段，参照type a isolate a22/irq/24/64毒株p12a、3b3c序列比对出fmdv-af72基因组的p12a、3b3c片段。使用primer premier 6.0设计引物，上游5’端加入noti酶切位点及kozak序列5
’‑
gccgccacc-3’，3’端加入aflii酶切位点，引物序列具体见表8，交武汉金开瑞公司对目的基因人工优化后合成，连接至pdc316-mcmv-egfp载体后交付构建好的质粒和穿刺菌株。
[0111]
表8af72和oa58毒株基因组的p12a、3b3c片段扩增引物
[0112][0113]
成功构建了三种能够表达fmdv-ozk93、fmdv-oa58、fmdv-af72衣壳蛋白前体p1-2a和3b3c蛋白酶的重组穿梭质粒pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk9、pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-oa58、pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-af72。
[0114]
二、重组腺病毒包装
[0115]
接种hek293细胞于平皿，细胞密度达到75％时可用于转染。向1.5mlep管中加入250μldmem(无血清)，然后添加pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-ozk93、pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-oa58或pdc316-mcmv-egfp-p12a3b3c-af72质粒1μg和pbhgloxdeltae1，3质粒4μg，混匀，加入脂质体6μl的250μldmem(无血清)混合物混合后，静置15min后添加到hek293细胞中，轻轻摇晃培养基混匀，置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。连续培养5～7d后，显微镜下观察细胞发生大面积的噬斑，则收集细胞。
[0116]
4)重组腺病毒滴度的测定
[0117]
取96孔板，104个/孔293细胞铺板，至孵育箱培养24h。取10μl浓缩得到的腺病毒液10倍稀释11个梯度，加入100μl倍稀的腺病毒扩增液，感染24h后，各孔加入100μl完全培养基。5％co2中继续培养48h观察细胞状态，10-1
稀释后培养24h细胞即变大、变圆、脱落。培养72h后在荧光显微镜下观察。计算病毒滴度。
[0118]
实施例2
[0119]
1.重组腺病毒的pcr鉴定
[0120]
使用dna提取试剂盒提取radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58、radv-p12a3b3c-af72的dna，使用primestar
ꢀꢀ
gxl dna polymerase试剂盒以其为模板按照下表9体系组成进行pcr反应。pcr反应程序为：98℃20s；98℃10s，55℃15s，68℃1min，30个循
环；68℃5min；4℃保存。其中wtadv作为阴性对照，pdc316通用引物(上游引物pdc316-f：acgtgggtataagaggcg，seq id no:19和下游引物pdc316-r：cgatgctagacgatccag，seq id no:20)扩增radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58、radv-p12a3b3c-af72中靶基因p12a3b3c，检测该基因在3种重组腺病毒中的稳定性。
[0121]
表9pcr反应体系
[0122][0123][0124]
2.重组腺病毒的westernblot检测
[0125]
将包装好的重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58、radv-p12a3b3c-af72和空载腺病毒wtadv分别感染hek293细胞，48h后提取蛋白，经sds-page分离后，电转移至pvdf膜上；之后使用5％脱脂奶粉封闭2h，以mab o-by-vp1/mab af72-vp1为一抗(1：1000)孵育2h，pbst每隔10分钟进行洗膜，4次后以山羊抗兔hrp-igg为二抗(1：10000)孵育1h，pbst每隔10分钟进行洗膜，4次后加入ecl发光液在蛋白印迹成像仪中进行westernblot分析。同时设立牛源fmdv全病毒蛋白作为阳性对照，wtadv感染的hek-293细胞作为阴性对照。
[0126]
经过pcr鉴定和western blot检测结果表明，radv-p12a3b3c-ozk93radv-p12a3b3c-af72和radv-p12a3b3c-oa58含有目的基因和目标蛋白，成功构建重组腺病毒(图7)。
[0127]
3.重组腺病毒进行细胞感染实验及间接免疫荧光鉴定
[0128]
(1)猪源细胞(pk细胞)感染试验
[0129]
将具有感染能力的p7代radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58、radv-p12a3b3c-af72以moi＝10接种于pk细胞，24h后，通过绿色荧光蛋白表达情况判断其感染程度。
[0130]
(2)vp1蛋白表达鉴定-间接免疫荧光试验(ifa)
[0131]
将具有感染能力的p3、p5、p7代radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58、radv-p12a3b3c-af72以moi＝10接种于培养在六孔板的单层pk细胞，24h后使用4％细胞固定液4℃过夜固定感染细胞。以mab o-by-vp1、mab af72-vp1为一抗(1：1000)，以山羊抗兔tritc-igg(1：1000)为二抗进行ifa检测。具体操作步骤如下：
[0132]
①
接毒后24h弃去培养基，使用1
ⅹ
pbs清洗3遍细胞。
[0133]
②
每孔从孔边缘轻轻加入1ml 4％多聚甲醛固定液，4℃冰箱过夜放置，进行固定。
[0134]
③
弃去固定液，每孔加入1ml 0.25％triton-100通透剂，于室温条件下通透
10min。
[0135]
④
每孔用2ml1
×
pbs清洗3遍，每次加入后静置3min后在微量振荡器上混匀。
[0136]
⑤
每孔加入1ml 5％bsa封闭60min。
[0137]
⑥
重复步骤
④
。
[0138]
⑦
每孔加入1ml以1:1000稀释的抗fmdv的血清(用3％bsa稀释)，37℃孵育60min。
[0139]
⑧
重复步骤
④
。
[0140]
⑨
在避光条件下，每孔加入1ml以1:1000稀释的488标记的二抗(用3％bsa稀释)37℃孵育60min。
[0141]
⑩
避光条件下，重复步骤
④
。
[0142]
避光条件下，每孔加入以1：10稀释后的dapi 500μl，室温静置5min后每孔用2ml 1
×
pbs清洗3遍，每次加入后静置3min后在微量振荡器上混匀。
[0143]
避光条件下，最后加入1ml的1
×
pbs存放于4℃冰箱，倒置荧光显微镜下观察荧光。
[0144]
p7-radv-p12a3b3c-ozk93、p7-radv-p12a3b3c-af72、p7-radv-p12a3b3c-oa58接种到pk细胞后24h观察到有大量荧光蛋白被表达，ifa结果显示radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-af72、radv-p12a3b3c-oa58感染的pk细胞中成功表达vp1蛋白，而阴性对照wtadv不表达(图8)。这表明构建的三种重组腺病毒可以感染猪源细胞并能成功表达。
[0145]
4.重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-af72、radv-p12a3b3c-oa58的电镜观察
[0146]
室温下，吸取10μl纯化后的第7代radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-af72、radv-p12a3b3c-oa58置于涂有无定形碳膜的铜网格上1min，pbs洗涤网格两次后，用3％磷钨酸染色，并在透射电子显微镜下观察。
[0147]
透射电子显微镜观察结果显示，重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-af72、radv-p12a3b3c-oa58的直径约为75-85nm，大致为圆形，边缘有一定的棱角(如图9)，与腺病毒的大小和形状相似，可以进一步确定重组腺病毒包装成功。
[0148]
实施例3
[0149]
1.重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93小鼠肌肉免疫
[0150]
将20只6周龄雌性balb/c小鼠随机分成4组(每组5只)：g1组(实验组)、g2组(阳性对照)、g3组(阴性对照)、g4组(空白对照)，按照表10所示进行免疫。并分别于免疫后14d和28d用相同剂量加强免疫。免疫采用后大腿内侧肌肉注射100μl/只，每组免疫后每7d眼眶静脉丛采血并分离血清后储存在-80℃冰箱中备用。
[0151]
表10小鼠试验免疫方案
[0152][0153]
2.小鼠特异性igg的检测与il-10、γ-ifn测定
[0154]
使用o型fmdv液相阻断elisa试剂盒(lpb-elisa)检测免疫小鼠血清中的fmdv特异性免疫球蛋白g(igg)抗体。小鼠ifn-γ和il-10测定根据ifn-γelisa、il-10elisa试剂盒中制造商的方案进行，即先进行标准品的测定完成标准曲线的绘制，之后测定各样品吸光度，根据绘制的标准曲线得出各样品中的ifn-γ/il-10的浓度。
[0155]
肌肉免疫诱导小鼠产生高滴度抗fmdv抗体和细胞免疫应答结果
[0156]
为了评价免疫的小鼠抗fmdv抗体产生情况，lpb酶联免疫吸附试验检测了小鼠血清中igg抗体滴度。radv-p12a3b3c-ozk93和fmd灭活疫苗免疫组所有小鼠均在14d时产生高滴度抗体，与wtadv组相比具有显著性差异(p《0.001)，且radv-p12a3b3c-ozk93诱导的抗体应答比fmd灭活疫苗高(图10中a)，这两组在42d时诱导最高的抗体应答(抗体效价1：512)，这些结果表明radv-p12a3b3c-ozk93诱导产生高抗fmdv抗体。用mtt法评估t淋巴细胞增殖反应，用radv-p12a3cwt-ozk93或fmd灭活疫苗处理的小鼠组明显高于对照组的淋巴细胞增殖(图10中b)。il-10/ifn-γ检测结果显示radv-p12a3b3c-ozk93或fmd灭活疫苗免疫小鼠在42d时诱导高浓度il-10(2811pg/ml)和ifn-γ(1091pg/ml)产生，显著性高于wtadv免疫组(p《0.001；图10中c和d)。综上结果表明重组腺病毒诱导了针对fmdv的高水平的体液免疫和细胞免疫应答。
[0157]
实施例4
[0158]
豚鼠的免疫
[0159]
将90只2周龄豚鼠随机分成9组(每组10只)：g1组(空白对照)、g2组(阴性对照)、g3-g8组(实验组)、g9(商品化o/a双价疫苗组)，按照表11所述进行免疫。并分别于免疫后14d和28d用相同剂量加强免疫。免疫采用后大腿内侧肌肉注射500μl/只，每组免疫后每21d眼眶静脉丛采血并分离血清后储存在-80℃冰箱中备用。其中二价三组份中，不同的比例是指病毒滴度相同条件下的体积比，radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58和radv-p12a3b3c-af72的比例，其中o型的混合物中ozk93和oa58各占一半。
[0160]
表11豚鼠试验免疫方案
[0161][0162]
注：病毒滴度相同条件下的体积比，radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58和radv-p12a3b3c-af72的比例，其中o型的混合物中ozk93和oa58各占一半。
[0163]
豚鼠血清抗体的液相阻断elisa试剂盒检测
[0164]
使用o型fmdv液相阻断elisa试剂盒按照试剂盒中所述方法(lpb-elisa)检测免疫豚鼠血清中的o型fmdv特异性igg抗体以及使用a型fmdv液相阻断elisa试剂盒(lpb-elisa)检测免疫豚鼠血清中的a型fmdv特异性igg抗体，进行豚鼠上免疫原性评价。
[0165]
豚鼠血清中细胞因子il-4、γ-ifn测定
[0166]
豚鼠il-4、γ-ifn测定根据γ-ifn elisa、il-4elisa试剂盒中制造商的方案进行，即先进行标准品的测定以完成标准曲线的绘制，之后测定各样品在od
450
的吸光度，根据绘制的标准曲线计算出各样品中的il-4/γ-ifn的浓度。
[0167]
免疫后豚鼠血清抗体的水平结果
[0168]
豚鼠一免后21d(3次免疫，每14d免疫一次，共3次)各重组苗单苗/联苗与wtadv组相比差异显著，且高于灭活苗产生抗体量；一免后42dradv-p12a3b3c-o:a 6：4、radv-p12a3b3c-o:a 5:5、radv-p12a3b3c-o:a7:3联苗之间igg含量依次增加，radv-p12a3b3c-ozk93单苗产生抗体含量高于radv-p12a3b3c-oa58单苗(图11)。
[0169]
豚鼠一免后21d，inactivated vaccine、radv-p12a3b3c-af72、radv-p12a3b3c-o:a 6:4、radv-p12a3b3c-o:a 5:5、radv-p12a3b3c-o:a7:3均与wtadv组有显著差异，且radv-p12a3b3c-af72产生抗体比其他4组高，其他4组相互间差异较小。豚鼠一免后42d(3次免疫后，每14d免疫一次，共3次)radv-p12a3b3c-o:a 6：4、radv-p12a3b3c-o:a 5:5、radv-p12a3b3c-o:a 7:3联苗之间igg含量依次增加且高于inactivated vaccine产生抗体。整体结果与o型抗体变化保持一致(图12)。
[0170]
豚鼠免疫后细胞因子ifn-γ水平
[0171]
使用试剂盒(elisa)检测豚鼠血清中ifn-γ含量，即以所测标准品的od值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的od值代入方程，计算出样品的浓度。(由于样品10倍稀释，需要再乘以稀释度)豚鼠一免后42d(3次免疫后，每14d免疫一次，共3次)，单苗之间radv-p12a3b3c-ozk93与radv-p12a3b3c-af72诱导产生的ifn-γ显著高于radv-p12a3b3c-oa58；radv-p12a3b3c-o:a 6：4、radv-p12a3b3c-o:a 5:5、radv-p12a3b3c-o:a7:3联苗之间组间ifn-γ含量依次增加且均与pbs组有显著差异，重组苗产生ifn-γ含量低于inactivated vaccine组(图13)。
说明本发明构建的重组腺病毒均具有良好的细胞免疫。
[0172]
豚鼠一免后42d(3次免疫后，每14d免疫一次，共3次)radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58、radv-p12a3b3c-af72单苗之间组间il-4含量差异小；radv-p12a3b3c-o:a 6：4、radv-p12a3b3c-o:a 5:5、radv-p12a3b3c-o:a 7:3联苗之间组间il-4含量依次增加且均与pbs组有显著差异，重组苗产生il-4含量高于inactivated vaccine组(图14)。说明本发明构建的重组腺病毒均具有良好的细胞免疫。
[0173]
综上结果表明构建的三种重组腺病毒在豚鼠体内诱导了针对fmdv的高水平的体液免疫和细胞免疫应答。
[0174]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒，其特征在于，以腺病毒为基础毒株，重组表达fmdv灭活疫苗毒株衣壳蛋白前体p12a和3b3c。2.根据权利要求1所述重组腺病毒，其特征在于，所述口蹄疫病毒灭活疫苗毒株包括o型fmdv灭活疫苗毒株或a型fmdv灭活疫苗毒株。3.根据权利要求2所述重组腺病毒，其特征在于，所述o型fmdv灭活疫苗毒株包括ozk93和/或oa58；所述a型fmdv灭活疫苗毒株包括fmdv灭活疫苗毒株af72。4.根据权利要求3所述重组腺病毒，其特征在于，ozk93来源的p12a的氨基酸序列如seq id no:1所示；ozk93来源的3b3c的氨基酸序列如seq id no:2所示；af72来源的p12a的氨基酸序列如seq id no:3所示；af72来源的3b3c的氨基酸序列如seq id no:4所示；oa58来源的p12a的氨基酸序列如seq id no:5所示；oa58来源的3b3c的氨基酸序列如seq id no:6所示。5.权利要求1～4任意一项所述重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分别扩增编码衣壳蛋白前体p12a和3b3c的序列，连接后，得到的p12a3b3c片段插入腺病毒穿梭载体中，得到重组腺病毒穿梭载体；2)将步骤1)中得到的所述重组腺病毒穿梭载体联合腺病毒骨架质粒进行包装，得到重组腺病毒。6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，扩增编码ozk93来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:7所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:8所示的反向引物；扩增编码ozk93来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:9所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:10所示的反向引物；扩增编码af72来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:11所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:12所示的反向引物；扩增编码af72来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:13所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:14所示的反向引物；扩增编码oa58来源的衣壳蛋白前体p12a核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:15所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:16所示的反向引物；扩增编码oa58来源的衣壳蛋白前体3b3c核苷酸序列的引物包括核苷酸序列如seq id no:17所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no:18所示的反向引物。7.一种防控口蹄疫的疫苗，其特征在于，包括佐剂和权利要求1～4任意一项所述重组腺病毒或权利要求5或6所述构建方法得到的重组腺病毒。8.根据权利要求7所述防控口蹄疫的疫苗，其特征在于，所述重组腺病毒包括重组腺病毒radv-p12a3b3c-ozk93、radv-p12a3b3c-oa58和radv-p12a3b3c-af72中的一种或几种。9.根据权利要求8所述防控口蹄疫的疫苗，其特征在于，所述radv-p12a3b3c-ozk93和radv-p12a3b3c-af72的滴度比为(5～7)：(3～8)。10.权利要求1～4任意一项所述重组腺病毒或权利要求5或6所述构建方法得到的重组
腺病毒在制备防控口蹄疫疫苗中的应用。

技术总结
本发明提供了一种表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的重组腺病毒及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明构建能稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P12A和3B3C蛋白酶的重组腺病毒rAdv-P12A3B3C-OZK93、rAdv-P12A3B3C-OA58、rAdv-P12A3B3C-AF72，并进一步通过动物免疫实验评价构建所述重组腺病毒的免疫原性，具有良好的体液免疫反应和细胞免疫反应，为O型、A型FMDV重组腺病毒疫苗的研究奠定了基础，为新型FMDV活载体疫苗的研制提供了新的思路。FMDV活载体疫苗的研制提供了新的思路。FMDV活载体疫苗的研制提供了新的思路。


技术研发人员：刘新生 王灿灿 张莉萍 于瑞明 潘丽 周鹏 张中旺 吕建亮 王永录 张永光 郭慧琛
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：2023.01.10
技术公布日：2023/8/16