抗铜蓝蛋白抗体及其用途的制作方法

抗铜蓝蛋白抗体及其用途
1.相关申请的交叉引用
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3.序列表
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背景技术：

5.铜是一种必需元素，但过量存在时对身体有害。大部分铜(》90％)通过铜蓝蛋白(“cp”)在体内运输，铜蓝蛋白是一种含铜的血浆铁氧化酶，在哺乳动物铁稳态中发挥重要作用。铜稳态的破坏与许多疾病和障碍(铜代谢相关疾病和障碍)相关，包括由人铜负载酶atp7b的基因突变引起的威尔逊病。这种酶的缺陷导致铜在组织中的积累超过铜蓝蛋白的容量，导致游离的非铜蓝蛋白结合铜在血液中循环并在组织和器官中积累。循环非铜蓝蛋白结合铜(“ncc”)可能与血浆蛋白松散结合，以形成复合物(“不稳定结合铜”或“lbc”)。循环总铜中不与铜蓝蛋白结合的级分包括“游离铜”，其可能有助于并指示在威尔逊病中观察到的铜毒性。
6.游离铜水平的测量可用于诊断、管理和治疗患有铜代谢相关障碍(诸如威尔逊病)的患者。然而，许多目前可用的方法可以估计但没有直接测量游离铜浓度。例如，在许多目前可用的游离铜测量方法中，仅直接测量总血铜和铜蓝蛋白水平，然后将这些水平输入到公式中以估计游离铜水平。这种估计方法有缺点，因为它假设游离铜和铜蓝蛋白水平直接相关，并且铜蓝蛋白总是被六个铜原子结合。事实上，与铜蓝蛋白缔合的铜原子的数量是高度不均匀的。
7.结果，用于测定ncc浓度的估计方法经常是有问题的，诸如在临床环境中。例如，该估计方法可以产生生理上不可能的负ncc浓度，在用该方法评价的高达20％-50％的威尔逊病患者中报道了这种情况。
8.因此，对用于测量患有铜代谢相关疾病和障碍的患者的生物样品中游离铜浓度的有效、准确和直接的方法的需求仍未得到满足。


技术实现要素：

9.本文提供了抗铜蓝蛋白抗体(例如，单克隆抗铜蓝蛋白抗体)及其混合物(例如，抗体组合物、抗体混合物或抗体鸡尾酒(antibody cocktail))，其在从生物样品诸如人血浆和血清样品中免疫捕获铜蓝蛋白(例如，人铜蓝蛋白)方面是高效的。这些抗体和抗体混合物可用于，例如，免疫耗减来自生物样品的铜蓝蛋白，因此能够比常规估计方法更精确地直接测量游离铜(即，ncc或lbc)。这反过来可以更准确地诊断、选择和治疗患有铜代谢相关疾病或障碍(例如，威尔逊病)的患者。
10.因此，在一个方面，本文提供了分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含选自由以下组成的组的重链可变区和轻链可变区对的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列：
11.(a)分别为seq id no:25和26，
12.(b)分别为seq id no:49和50，
13.(c)分别为seq id no:73和74，
14.(d)分别为seq id no:97和98，
15.(e)分别为seq id no:121和122，
16.(f)分别为seq id no:145和146，
17.(g)分别为seq id no:169和170，以及
18.(h)分别为seq id no:193和194。
19.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合的抗体，其包含：
20.(a)分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
21.(b)分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
22.(c)分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，
23.(d)分别包含seq id no:77、78和79所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:80、81和82所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
24.(e)分别包含seq id no:101、102和103所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:104、105和106所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
25.(f)分别包含seq id no:125、126和127所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:128、129和130所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
26.(g)分别包含seq id no:149、150和151所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:152、153和154所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或
27.(h)分别包含seq id no:173、174和175所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:176、177和178所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列。
28.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链可变区和轻链可变区的抗体，其中该重链可变区包含与选自由seq id no:25、49、73、97、121、145、169和193组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，和/或该轻链可变区包
含与选自由seq id no:26、50、74、98、122、146、170和194组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。
29.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区和该轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少85％同一(诸如至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一)的氨基酸序列：
30.(a)分别为seq id no:25和26，
31.(b)分别为seq id no:49和50，
32.(c)分别为seq id no:73和74，
33.(d)分别为seq id no:97和98，
34.(e)分别为seq id no:121和122，
35.(f)分别为seq id no:145和146，
36.(g)分别为seq id no:169和170，以及
37.(h)分别为seq id no:193和194。
38.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区和该轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
39.(a)分别为seq id no:25和26，
40.(b)分别为seq id no:49和50，
41.(c)分别为seq id no:73和74，
42.(d)分别为seq id no:97和98，
43.(e)分别为seq id no:121和122，
44.(f)分别为seq id no:145和146，
45.(g)分别为seq id no:169和170，以及
46.(h)分别为seq id no:193和194。
47.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链和轻链的抗体，该重链和该轻链包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少80％同一(诸如至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一)的氨基酸序列：
48.(a)分别为seq id no:27和28，
49.(b)分别为seq id no:51和52，
50.(c)分别为seq id no:75和76，
51.(d)分别为seq id no:99和100，
52.(e)分别为seq id no:123和124，
53.(f)分别为seq id no:147和148，
54.(g)分别为seq id no:171和172，以及
55.(h)分别为seq id no:195和196。
56.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链和轻链的抗体，该重链和该轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
57.(a)分别为seq id no:27和28，
58.(b)分别为seq id no:51和52，
59.(c)分别为seq id no:75和76，
60.(d)分别为seq id no:99和100，
61.(e)分别为seq id no:123和124，
62.(f)分别为seq id no:147和148，
63.(g)分别为seq id no:171和172，以及
64.(h)分别为seq id no:195和196。
65.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且与本文所述的抗铜蓝蛋白抗体竞争与铜蓝蛋白结合的抗体。
66.在另一个方面，本文提供了与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且结合到与本文所述的抗铜蓝蛋白抗体相同的人铜蓝蛋白表位的抗体。
67.在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，该抗体是igg1、igg2、igg3、或igg4抗体、或其变体。在一些实施例中，该抗体是兔抗体(例如，兔igg抗体)。在一些实施例中，该抗体与生物样品(例如，人血浆或血清样品)中的铜蓝蛋白结合。在一些实施例中，该生物样品是含有肝素锂的人血浆。在一些实施例中，该抗体与纯化的人铜蓝蛋白结合。
68.在另一个方面，本文提供了包含本文所述的抗铜蓝蛋白抗体的免疫缀合物，该抗铜蓝蛋白抗体与药剂(诸如可检测标记)连接。
69.在另一个方面，本文提供了编码本文所述抗铜蓝蛋白抗体的重链和/或轻链或其可变区的核酸或核酸组。在一些实施例中，这些核酸包含选自由seq id no:197-228组成的组的核苷酸序列。还提供了包含这些核酸的表达载体或表达载体组，以及包含本文所述的这些核酸或核酸组、或表达载体或表达载体组的细胞。
70.在另一个方面，本文提供了包含与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合的两种或三种抗体的抗体混合物，其中该两种或三种抗体选自由以下组成的组：
71.(a)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
72.(b)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；以及
73.(c)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列。
74.在一些实施例中，该两种或三种抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)分别为seq id no:25和26，(b)分别为seq id no:49和50，以及(c)分别为seq id no:73和74。在其他实施例中，该两种或三种抗体包含重链和轻链，该重链和该轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)分别为seq id no:27和28，(b)分别为seq id no:51和52，以及(c)分别为seq id no:75和76。在一些实施例中，该抗体混合物包含选自子部分(a)-(c)的两种抗体，例如，以2:1的
(a):(b)、(a):(c)、(b):(a)、(b):(c)、(c):(a)或(c):(b)比率。在一些实施例中，该抗体混合物包含子部分(a)、(b)和(c)的抗体，例如，以2:1:1的(a):(b):(c)、(a):(c):(b)、(b):(a):(c)、(b):(c):(a)、(c):(a):(b)或(c):(b):(a)比率。
75.在一些实施例中，该抗体混合物中的一种或多种抗体被固定在固体支持物上，诸如免疫捕获珠、琼脂糖树脂、色谱板、链霉亲和素板或滴度板。在一些实施例中，该抗体混合物中的一种或多种抗体被配置为在与铜蓝蛋白复合后固定在固体支持物上。示例性免疫捕获珠包括链霉亲和素包被珠、甲苯磺酰激活珠、蛋白g珠、蛋白a珠和蛋白a/g珠。在一些实施例中，这些免疫捕获珠是磁性免疫捕获珠。在一些实施例中，将该抗体混合物中的一种或多种抗体不可逆地连接到这些免疫捕获珠上。
76.在另一个方面，本文提供了用于测量包含本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物的生物样品中铜浓度的试剂盒以及使用说明书。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含螯合剂。
77.在另一个方面，本文提供了测量生物样品中非铜蓝蛋白结合铜的浓度的方法，该方法包括：
78.(a)使该生物样品与包含本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物的免疫捕获试剂接触以形成免疫捕获的铜蓝蛋白，
79.(b)去除该免疫捕获的铜蓝蛋白以获得非铜蓝蛋白样品，以及
80.(c)测量该非铜蓝蛋白样品中的铜浓度。
81.在本文披露的方法的一些实施例中，使用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测量该非铜蓝蛋白样品中的铜浓度。
82.在另一个方面，本文提供了测量生物样品中不稳定结合铜的浓度的方法，该方法包括：
83.(a)使该生物样品与包含本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物的免疫捕获试剂接触以形成免疫捕获的铜蓝蛋白，
84.(b)去除该免疫捕获的铜蓝蛋白以获得非铜蓝蛋白样品，
85.(c)使非铜蓝蛋白样品与螯合剂(例如，青霉胺、盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀和edta)接触，该螯合剂与不稳定结合铜结合，
86.(d)去除非不稳定结合铜以获得不稳定结合铜样品，以及
87.(e)测量该不稳定结合铜样品中的铜浓度。
88.在本文所述的方法的一些实施例中，使用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测量该不稳定结合铜样品中的铜浓度。在一些实施例中，该方法进一步包括在测量该铜浓度之前将内标引入该不稳定结合铜样品中。在一些实施例中，该内标包含铜和铑中至少一者。在一些实施例中，该螯合剂选自由青霉胺、盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀和edta组成的组。在一些实施例中，该螯合剂包括edta。在一些实施例中，去除该非不稳定结合铜进一步包括获得非不稳定结合铜样品。在一些实施例中，该方法包括测量该非不稳定结合铜样品中的铜浓度。在一些实施例中，该非不稳定结合铜样品包含钼。在一些实施例中，该方法进一步包括测量该非不稳定结合铜样品中的钼浓度。
89.在本文所述的方法的一些实施例中，去除该免疫捕获的铜蓝蛋白进一步包括获得免疫捕获的铜蓝蛋白样品。在一些实施例中，该方法进一步包括测量该免疫捕获的铜蓝蛋
白样品中的铜蓝蛋白浓度。在一些实施例中，使用质谱法测量该铜蓝蛋白浓度。在一些实施例中，该质谱法具有至少约5μg/ml的分析物检测限。在一些实施例中，该质谱法包括液相色谱质谱法(lc-ms)。在一些实施例中，该生物样品中的铜蓝蛋白浓度小于约200μg/ml。
90.在本文披露的方法的一些实施例中，该方法进一步包括测量该免疫捕获的铜蓝蛋白样品中的铜浓度。在一些实施例中，使用电感耦合等离子体质谱法测量该免疫捕获的铜蓝蛋白样品中的铜浓度。
91.在另一个方面，本文提供了一种鉴定患有铜代谢相关疾病或障碍的患者的方法，该方法包括：
92.根据本文所述的测量方法测量来自该患者的生物样品中的非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度；以及
93.使用该生物样品中非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度来鉴定患有疾病或障碍的患者。
94.在另一方面，本文提供了一种治疗已使用本文所述的测量方法诊断为患有铜代谢相关疾病或障碍的患者的方法，该方法包括向该患者施用有效量的治疗剂以治疗该疾病或障碍。在一些实施例中，该治疗剂选自由以下组成的组：四硫钼酸二胆碱、锌、盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀和青霉胺。
95.在本文所述的方法的一些实施例中，该生物样品是人血浆或人血清。在一些实施例中，该生物样品来自患有或被怀疑患有铜代谢相关疾病或障碍(例如，威尔逊病、铜毒性、铜缺乏、门克斯病和遗传性铜蓝蛋白缺乏症)的患者。
附图说明
96.图1是显示在elisa中28种抗cp单克隆抗体(mab)与用pbs-t 1:10稀释的肝素锂血浆中的内源性人铜蓝蛋白(cp)结合的能力的图。在a450 nm处读取吸光度。“dilb”意指“稀释缓冲液”，对应于没有捕获到mab，而“ns mab”意指“非特异性单克隆抗体”。
97.图2是显示在elisa中28种抗cp mab与用pbs-t 1:10稀释的肝素锂血浆中的内源性人cp或20ng/ml纯化的cp结合的能力的图。在a450 nm处读取吸光度。“dilb”意指“稀释缓冲液”，对应于没有捕获到mab，而“ns mab”意指“非特异性单克隆抗体”。
98.图3是显示在1:10,000血浆和纯化的cp样品之间抗cp抗体的cp结合强度的相关性的图。
99.图4是一系列蛋白质印迹图像，显示了抗cp抗体从netn缓冲液中的纯化的cp中免疫捕获cp的能力。兔igg用作阴性对照。阳性对照为多克隆抗cp抗体(a80-124a)。上分图显示免疫捕获结果，下分图显示作为免疫沉淀后输入去除的cp量。
100.图5a-5h是显示在elisa中8种抗cp mab(a、b、c、d、e、f、g和h)结合以0.4ug/ml包被在板上的cp的能力的图。在a450 nm处读取吸光度。“b
‑”
表示相应mab被生物素化，“nb
‑”
表示相应mab未被生物素化，而“cm
‑”
表示相应mab在未纯化的瞬时转染条件培养基中。
101.图6是显示在elisa中用链霉亲和素-hrp(sa-hrp)检测时，不同浓度的指示生物素化的抗cp mab与包被cp的结合活性的图。在a450 nm处读取吸光度。
102.图7是显示当使用抗兔hrp或sa-hrp检测时，生物素化的抗cp抗体与0.4ug/ml cp结合的相关性的图。
103.图8是通过elisa比较抗cp mab与可溶性和包被cp的结合的图。在a450 nm处读取吸光度。“cm”意指未纯化的瞬时转染条件培养基。
104.图9a是用于评估抗cp mab免疫捕获效率的方法的示意图。“ic”意指免疫捕获，“cp”意指铜蓝蛋白，“nc”意指非铜蓝蛋白，“is”意指内标，而“lc-ms/ms”意指液相色谱串联质谱法。
105.图9b是非铜蓝蛋白结合铜测定法(左分图)和不稳定结合铜测定法(左分图和右分图，组合)的图形表示，其中本文披露的抗cp mab和mab混合物可以用作抗cp抗体。
106.图10a-10d是显示mab e(图10a)、mab c(图10b)、mab g(图10c)和mab混合物(1,2,3)(即，2:1:1比率的mab e:c:g)(图10d)在9个月过程中的cp结合活性的图。在a450 nm处读取吸光度。
具体实施方式
107.i.综述
108.本文提供了与铜蓝蛋白(例如，人铜蓝蛋白)结合的抗体以及包含这些抗体的抗体混合物，其可用于各种应用，诸如测量生物样品(例如，人血浆或血清样品)中的游离铜浓度的方法和标准分子生物学方法(诸如elisa、免疫印迹和免疫共沉淀)。还提供了基于使用本文所述的测量方法测定游离铜浓度来诊断和治疗铜代谢相关障碍的方法。
109.ii.定义
110.为了更容易理解本描述，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述了额外的定义。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义，并且采用免疫学、蛋白质化学、生物化学、重组dna技术和药理学的常规方法。
111.如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/一种(a，an)”和“该(the)”包括复数指示物。除非另有说明，使用“或”或“和”意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(如“包括(include、includes和included)”)的使用不是限制性的。
112.如本文所用，术语“约”当指的是可测量的值诸如量、时距等时，涵盖从指定值最多
±
10％的变化。除非另有指示，否则本文中使用的表示成分量、特性诸如分子量、反应条件等的所有数字都应理解为被术语“约”修饰。
113.如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种，将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述的抗体的示例性施用途径包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除了肠道和局部施用以外的施用模式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病变内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注、以及体内电穿孔。可替代地，本文所述的抗体可以通过非肠胃外途径，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用也可以例如执行一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内执行。
114.如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个抗体衍生的抗原结合位点(例如，vh/vl区或fv、或cdr)的多肽，并且包括全抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其
单链。抗体包括已知的抗体形式。例如，该抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。全“抗体”是指糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，其中每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区组成；并且每个轻链由轻链可变区(本文缩写为v
l
)和轻链恒定区组成。vh和v
l
区可进一步细分为高变区，也称为互补决定区(cdr)，其间穿插有称为框架区(fr)的更加保守的区域。每个vh和v
l
由三个cdr和四个fr构成，它们自氨基-末端至羧基-末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。该重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。
115.抗体也可以是以下任何同种型：igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igasec、igd和ige，或其他物种(例如，兔)中的等同同种型。该抗体可以是天然存在的抗体或可以是已经通过蛋白质工程技术(例如，通过突变、缺失、取代、与非抗体部分缀合)改变的抗体。例如，抗体可以包括一个或多个改变抗体的特性(例如，功能特性)的变体氨基酸(与天然存在的抗体相比)。例如，许多这样的改变在本领域中是已知的，它们影响例如半衰期、效应子功能和/或患者对抗体的免疫反应。术语抗体还包括包含至少一个抗体衍生的抗原结合位点的人工或工程化的多肽构建体。
116.如本文所用，“抗体混合物”或“抗体组合”是指含有多种不同抗体(例如，单克隆抗体)群体的混合物(例如，组合物)。例如，抗体混合物可以是在合适的缓冲液中以单一组合物存在的两种或更多种不同抗体(例如，单克隆抗体)的混合物。在一些实施例中，将该抗体混合物固定到固体支持物(例如，珠、微孔板)上，并且用于例如从样品(例如，生物样品，诸如血浆或血清)中免疫捕获或免疫耗减蛋白质(例如，铜蓝蛋白)。在一些实施例中，在合适的缓冲液中制备(以及任选储存)该抗体混合物。
117.如本文所用，“抗原”是抗体与之结合的实体(例如，蛋白质实体或肽)。
118.如本文所用，抗体的术语“抗原结合部分”是指保留了特异性结合抗原(例如，铜蓝蛋白)的能力的抗体的一个或多个片段，例如，fab、fab'2、scfv、smip、纳米抗体或结构域抗体。已经表明，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。抗体的术语“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包括(i)fab片段，即由v
l
、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)a f(ab')2片段，即包含两个在铰链区通过二硫键连接的fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的v
l
和vh结构域组成的fv片段，(v)dab片段(ward等人,(1989)nature[自然]341:544-546)，其由vh结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管该fv片段的两个结构域v
l
和vh由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头使它们能够被制成单个蛋白质链，其中v
l
和vh区域配对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等人(1988)science[科学]242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”中。其他形式的单链抗体诸如二体也涵盖在内。双抗体是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短，不允许在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使这些结构域与另一个链的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点(参见例如，holliger,p.等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90:6444-6448；
poljak,r.j.等人(1994)structure[结构]2:1121-1123)。在本发明的一个实施例中，配制品包含美国专利号6,090,382和6,258,562中描述的抗原结合部分，这些专利各自通过引用并入本文。
[0119]
如本文所用，关于两个或更多个抗体的术语“结合相同表位”意指这些抗体结合相同氨基酸残基区段，如通过给定方法所确定的。用于确定抗体是否与另一种抗体结合至相同表位的技术包括例如表位作图法，诸如关于抗原:抗体复合物的晶体的x射线分析，这些方法提供了该表位的原子级解析，以及氢/氘交换质谱法(hdx-ms)。其他方法监测该抗体与抗原片段或该抗原的突变变体的结合，其中由于该抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位组分的指示。此外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目的抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和力分离特定短肽的能力。具有相同vh和vl或相同cdr1、2和3序列的抗体预期会结合相同表位。
[0120]
如本文所用，“四硫钼酸二胆碱”(也称为bc-ttm、硫代钼酸盐胆碱、硫代钼酸盐、wtx101和alxn1840)是指正在开发用于治疗威尔逊病的研究性口服首创铜-蛋白结合分子。bc-ttm具有以下结构：
[0121][0122]
由于铜-四硫钼酸盐-白蛋白三联复合物(“tpc”)的快速和不可逆形成导致快速脱铜，bc-ttm被认为改进了对铜的控制。
[0123]
如本文所用，术语“双特异性”或“双功能抗体”意指具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤融合或fab'片段连接。参见，例如，songsivilai&lachmann,clin.exp.immunol.[临床和实验免疫学]79:315-321(1990)；kostelny等人,j.immunol.[免疫学杂志]148,1547-1553(1992)。
[0124]
如本文所用，术语“铜蓝蛋白”或“cp”是指在血液中起主要铜携带蛋白作用的铁氧化酶。人cp具有下文所示的氨基酸序列(genbank登录号np_000087；人cp前体，前导序列带加粗下划线；seq id no:1)。没有前导物的成熟人cp具有seq id no:2的氨基酸序列。
[0125]
[0126][0127]
如本文所用，“嵌合抗体”是指其中可变区衍生自一种物种而恒定区衍生自另一种物种的抗体，诸如其中可变区衍生自兔抗体而恒定区衍生自人抗体的抗体。
[0128]
如本文所用，“与另一种抗体竞争结合靶标”的抗体是指抑制(部分或完全抑制)另一种抗体与靶标结合的抗体。在某些实施例中，抗体与另一种抗体竞争并且将另一种抗体与靶标的结合抑制至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。竞争测定法可以如例如在以下中所述进行：ed harlow和david lane,cold spring harb protoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或ed harlow and david lane的“using antibodies[使用抗体]”第11章,cold spring harbor laboratory press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约,美国1999。竞争性抗体结合相同表位、重叠表位或相邻表位(例如，如空间位阻所示)。其他竞争性结合测定法包括：固相直接或间接放射免疫测定法(ria)、固相直接或间接酶免疫测定法(eia)、夹心竞争测定法(参见stahli等人,methods in enzymology[酶学方法]9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素eia(参见kirkland等人,j.immunol.[免疫学杂志]137:3614(1986))；固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法(参见harlow和lane,antibodies:a laboratory manual[抗体实验室手册],cold spring harbor press[冷泉港出版社](1988))；使用i-125标记的固相直接标记ria(参见morel等人,mol.immunol.[分子免疫学]25(1):7(1988))；固相直接生物素-亲和素eia(cheung等人,virology[病毒学]176:546(1990))；和直接标记ria。(moldenhauer等人,scand.j.immunol.[免疫学杂志]32:77(1990))。竞争测定法也可以如实例3中所述进行。
[0129]
如本文所用，本文所示序列的“保守序列修饰”意指不消除由该核苷酸序列编码的抗体或含有该氨基酸序列的抗体与抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守核苷酸和氨基酸取代，以及核苷酸和氨基酸添加和缺失。保性氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域是公知的(参见，例如，brummell等人,biochem.[生物化学]32:
1180-1187(1993)；kobayashi等人protein eng.[蛋白质工程]12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]94:412-417(1997))。
[0130]
如本文所用，术语“dna”包括编码单链dna、由所述编码dna及其互补dna组成的双链dna、或互补(单链)dna本身。
[0131]
如本文所用，在使用抗体或其抗原结合片段进行的体外或体内测定法的上下文中，术语“ec
50”是指诱导为最大反应的50％的反应(即，介于最大反应与基线之间的一半)的抗体或其抗原结合部分的浓度。
[0132]
术语“有效量”或“治疗有效量”可以互换使用，并且是指有效地减轻或改善疾病症状或延长被治疗的受试者生存期的配制品或抗体的量。治疗有效量的测定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细披露内容。治疗有效剂量可以通过使用体外和体内方法来测定。
[0133]
如本文所用，术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位既可以由连续氨基酸(通常是线性表位)或通过蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸(通常是构象表位)形成。
[0134]
如本文所用，“fc区”、“fc结构域”或“fc”是指抗体重链的c-末端区域。因此，fc区包括抗体除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，ch1或cl)之外的恒定区。
[0135]
如本文所用，术语“游离铜”是指总铜中不与铜蓝蛋白结合的级分。因此，游离铜包含存在于受试者血液中的非铜蓝蛋白结合铜(诸如ncc或lbc)。
[0136]
如本文所用，“人源化”抗体是指其中非人抗体的cdr结构域外的一些、大部分或全部氨基酸被衍生自人免疫球蛋白的对应氨基酸替代的抗体。
[0137]
如本文所用，术语“免疫捕获”是指使用蛋白质/复合物与抗体(例如，本文所述的抗铜蓝蛋白mab)的特异性结合从样品(例如，生物样品)中分离蛋白质(例如，铜蓝蛋白)或蛋白质复合物的方法。免疫捕获抗体可以但不必被固定在表面(诸如珠、微量滴定板或硝化纤维素)上。在其他实施例中，蛋白质或蛋白质复合物的免疫捕获可以在溶液中发生(其中抗体没有被固定)。
[0138]
如本文所用，术语“免疫耗减”是指从样品中去除蛋白质(例如，铜蓝蛋白)(例如，通过去除免疫捕获的蛋白质)。在一些实施例中，免疫耗减产生基本上不含免疫耗减的蛋白质(例如，剩余小于10％，例如，小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％的目的蛋白原始量)的样品。
[0139]
如本文所用，“分离的”抗体或抗原结合片段是已经从其自然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体或抗原结合片段。其自然环境的污染物组分是会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，抗体被纯化至大于抗体的95重量％，并且在一些实施例中，纯化至大于99重量％。
[0140]
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd和ige抗体，或其他物种中的等同物)。
[0141]
如本文所用，术语“k
assoc”或“k
a”旨在指特定抗体-抗原相互作用的缔合率，而本文所用的术语“k
dis”或“k
d”旨在指特定抗体-抗原交互作用的解离率。如本文所用，术语“k
d”旨在指解离常数，其由kd与ka的比率(即，kd/ka)获得，并且表示为摩尔浓度(m)。抗体的kd值可以使用本领域熟知的方法来测定。例如，用于测定抗体的kd的方法是通过使用表面等离子
体共振，诸如使用生物传感器系统，诸如biacore系统或流式细胞术和scatchard分析。
[0142]
如本文所用，术语“lbc”或“不稳定结合铜”是指总铜中与白蛋白、运铜蛋白和其他含量较低的血浆蛋白结合的级分。因此，lbc包括总铜中不与铜蓝蛋白结合或不与四硫钼酸盐-铜-白蛋白三联复合物(“tpc”)结合的级分。在某些实施例中，使用lbc测定法直接测量lbc级分。例如，在某些实施例中，lbc测定法是如2020年9月11日提交的pct专利申请公开号wo 2021/05080、和2019年9月12日提交的美国临时专利申请号62/899,498、2019年12月6日提交的62/944,498、和2020年1月8日提交的62/958,432中所披露的，这些专利申请通过引用以其整体并入本文。在不存在tpc的生物样品中，ncc和lbc级分是相同的。
[0143]
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mab”包括从基本上均匀的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能自然发生的突变之外，包含该群体的单独抗体是同一的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。单克隆抗体的优势在于，它们可以通过杂交瘤培养物合成，基本上没有被其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”表示抗体的特征是在基本上均匀的抗体群体中，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。根据本文披露的配制品使用的单克隆抗体可以通过kohler等人,(1975)nature[自然]256:495首次描述的杂交瘤方法或本领域已知的其他方法制备。“多克隆抗体”是指在一种或多种其他非同一抗体之间或在存在一种或多种其他非同一抗体的情况下产生的抗体。一般来说，多克隆抗体是由b淋巴细胞在其他几种产生非同一抗体的b淋巴细胞存在的情况下产生的。通常，多克隆抗体直接从免疫接种的动物中获得。
[0144]
如本文所用，“天然序列fc区”或“天然序列fc”包含与自然界中发现的fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。
[0145]
如本文所用，术语“非铜蓝蛋白结合铜”或“ncc”是指总铜中不与铜蓝蛋白结合的级分(即，循环非铜蓝蛋白结合铜)。在许多当前可用的方法下，使用直接测量血液(例如像血清或血浆)中的总铜和cp以及以下公式来估计ncc：
[0146]
该计算的前提是假设六个铜原子总是与单个cp分子结合，并且ncc和铜蓝蛋白浓度直接相关。事实上，cp可在每个cp分子缔合的铜原子数量上显示出相当大的不均一性。事实上，6-8个铜原子实际上可以与cp结合，在威尔逊病中，每个cp分子通常只有少于6个铜原子缔合。在本文披露的某些实施例中，使用ncc测定法直接测量ncc级分。例如，在某些实施例中，ncc测定法是如2020年9月11日提交的pct专利申请公开号wo 2021/05080、和2019年9月12日提交的美国临时专利申请号62/899,498、2019年12月6日提交的62/944,498、和2020年1月8日提交的62/958,432中的“ncc测定法”所披露的，这些专利申请通过引用以其整体并入本文。
[0147]
在用bc-ttm治疗的受试者中，ncc包含总铜中(1)与白蛋白、运铜蛋白和其他含量较低的血浆蛋白(统称为lbc)结合的或(2)与四硫钼酸盐-铜-白蛋白三联复合物(“tpc”)结合的级分。因此，在来自用bc-ttm治疗的受试者的生物样品中，ncc＝lbc+tpc。
[0148]
如本文所用，术语“核酸分子”旨在包括dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以是cdna。可以根据标准技术使核酸(例如cdna)突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可以根据需要影响对应的氨基酸序列。特别地，考虑到了与天然v、
d、j、恒定区序列、转换区序列和本文所述的其他此类序列基本同源或由它们衍生的dna序列(其中“衍生”表示一个序列与另一个序列是同一的或是由另一个序列修饰而来)。这些核酸可以存在于全细胞中，以细胞裂解物的形式存在，或以部分纯化或基本纯的形式存在。当通过包括碱/sds处理、cscl显带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域公知的其他技术在内的标准技术，从其他细胞组分或其他污染物(例如，其他细胞核酸(例如，染色体的其他部分)或蛋白质)中纯化时，核酸是“分离的”或“基本纯的”。参见，f.ausubel等人编辑,current protocols in molecular biology[当代分子生物学实验手册],格林出版联营公司和威利国际科学公司(greene publishing and wiley interscience),纽约(1987)。
[0149]
如本文所用，术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
[0150]
如本文所用，两个序列之间的“同一性百分比”是序列共享的同一位置的数量的函数(即，％同源性＝同一位置的数量/位置的总数量x 100)，考虑到为了两个序列的最佳比对需要引入的空位的数量和每个空位的长度。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性实例中所述的。
[0151]
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用gcg软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的gap程序来测定，使用nwsgapdna.cmp矩阵和40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用e.meyers和w.miller(cabios,4:11-17(1989))的算法来测定，该算法已被并入align程序(2.0版本)，使用pam120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.[分子生物学杂志](48):444-453(1970))算法来测定，该算法已被并入gcg软件包(可在http://www.gcg.com获得)中的gap程序，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。
[0152]
本文所述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如鉴定相关序列。此类搜索可以使用altschul等人(1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-10的nblast和xblast程序(2.0版本)来执行。blast核苷酸搜索可以用nblast程序执行，得分＝100，字长＝12，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可以用xblast程序执行，得分＝50，字长＝3，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以使用如altschul等人,(1997)nucleic acids res.[核酸研究]25(17):3389-3402中所述的空位blast。当使用blast和空位blast程序时，可以使用相应程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0153]
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)旨在指已引入重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语不仅旨在指特定的受试者细胞，而且指这种细胞的子代。因为某些修饰可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲本细胞不同，但是仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”范围内。
[0154]
如本文所用，术语“样品”是指取自患者或受试者的组织、体液或细胞(或前述任一的一部分)。在一些实施例中，该体液是血浆或血清。
[0155]
如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结
合”是指抗体结合预定抗原上的表位但不结合其他抗原。典型地，该抗体(i)以大约小于10-7
m，诸如大约小于10 ‑8m、10-9
m或10-10
m或甚至更低平衡解离常数(kd)结合，这是当通过以下测定时：例如，2000表面等离子体共振仪中的表面等离子体共振(spr)技术，使用预定抗原，例如，重组人铜蓝蛋白作为分析物，抗体作为配体，或抗体与抗原阳性细胞结合的scatchard分析，以及(ii)以比其结合除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)的亲和力高至少两倍的亲和力结合预定抗原。因此，除非另有指示，“特异性结合人铜蓝蛋白”的抗体是指以10-7
m或更小的kd(诸如大约小于10-8
m、10-9
m或10-10
m或甚至更小)结合可溶性人铜蓝蛋白或细胞结合的人铜蓝蛋白的抗体。
[0156]
如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗患有癌症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
[0157]
对于核酸，如本文所用，术语“基本同源性”表示当最佳比对和比较时，在至少约80％的核苷酸(通常至少约90％至95％)中以及例如在至少约98％至99.5％的核苷酸中，具有适当的核苷酸插入或缺失的两个核酸或其指定序列是同一的。可替代地，当区段在选择性杂交条件下与链的互补物杂交时，存在基本同源性。
[0158]
对于多肽，术语“基本同源性”表示两种多肽或其指定序列，当最佳比对和比较时，在至少约80％的氨基酸中，通常至少约90％至95％，以及例如至少约98％至99.5％的氨基酸中是同一的，具有适当的氨基酸插入或缺失。
[0159]
如本文所用，术语“表面等离子体共振”是指一种光学现象，其允许通过检测生物传感器矩阵内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用biacore系统(法玛西亚生物传感器公司(pharmacia biosensor ab)，乌普萨拉，瑞典和皮斯卡塔韦，新泽西州)。对于进一步描述，参见jonsson,u.等人(1993)ann.biol.clin.[生物学临床年鉴]51:19-26；jonsson,u.等人(1991)biotechniques[生物技术]11:620-627；johnsson,b.等人(1995)j.mol.recognit.[分子识别杂志]8:125-131；以及johnsson,b.等人(1991)anal.biochem.[分析生物化学]198:268-277。
[0160]
如本文所用，术语“治疗(treat，treating和treatment)”是指本文所述的治疗措施。“治疗”的方法采用对受试者施用本文披露的组合，以治愈、延迟、降低或改善疾病或障碍或复发性疾病或障碍的一种或多种症状，或为了延长受试者的生存期，使其超过在没有这种治疗的情况下预期的生存期。
[0161]
如本文所用，“总铜”是指受试者血液中(例如，血清或血浆中)所有铜种类的总和。总铜包括铜蓝蛋白(cp)结合铜和所有种类的非铜蓝蛋白结合铜(诸如ncc、lbc和tpc)。一般来说，总铜可以通过质谱法(诸如电感耦合等离子体质谱法(icp-ms))以高灵敏度和特异性直接测量。
[0162]
如本文所用，术语“载体”旨在指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指圆形双链dna环，可以将额外的dna区段连接到该环中。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入该宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基
因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般来说，在重组dna技术中应用的表达载体通常是质粒的形式。术语“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，也考虑到了具有同等功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0163]
如本文所用，“威尔逊病”是一种与铜转运atp酶atp7b突变相关的遗传性障碍，导致atp7b蛋白活性受损、无功能或受损。
[0164]
在下面的小节中进一步详细描述了本文所述的各个方面。
[0165]
iii.抗铜蓝蛋白抗体和抗体混合物
[0166]
本文提供了以特定结构和/或功能特征为特征的抗铜蓝蛋白抗体(例如，分离的单克隆抗铜蓝蛋白酶抗体)。在某种程度上，本披露内容涉及具有定义的cdr、可变区以及重链序列和轻链序列的抗铜蓝蛋白抗体。
[0167]
因此，在一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含选自由以下组成的组的重链可变区和轻链可变区对的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列：
[0168]
(a)分别为seq id no:25和26，
[0169]
(b)分别为seq id no:49和50，
[0170]
(c)分别为seq id no:73和74，
[0171]
(d)分别为seq id no:97和98，
[0172]
(e)分别为seq id no:121和122，
[0173]
(f)分别为seq id no:145和146，
[0174]
(g)分别为seq id no:169和170，以及
[0175]
(h)分别为seq id no:193和194。
[0176]
在一些实施例中，基于kabat编号来定义这些cdr序列。在其他实施例中，基于chothia编号系统定义这些cdr序列。在其他实施例中，基于imgt编号系统定义这些cdr序列。
[0177]
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含：
[0178]
(a)分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0179]
(b)分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0180]
(c)分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0181]
(d)分别包含seq id no:77、78和79所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:80、81和82所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含：
[0196]
(a)分别包含seq id no:17、18和19所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:20、21和22所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0197]
(b)分别包含seq id no:41、42和43所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:44、45和46所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0198]
(c)分别包含seq id no:65、66和67所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:68、69和70所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0199]
(d)分别包含seq id no:89、90和91所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:92、93和94所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0200]
(e)分别包含seq id no:113、114和115所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:116、117和118所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0201]
(f)分别包含seq id no:137、138和139所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:140、141和142所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0202]
(g)分别包含seq id no:161、162和163所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:164、165和166所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或
[0203]
(h)分别包含seq id no:185、186和187所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:188、189和190所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0204]
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含与选自由seq id no:25、49、73、97、121、145、169和193组成的组的氨基酸序列至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列。
[0205]
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，其中该轻链可变区包含与选自由seq id no:26、50、74、98、122、146、170和194组成的组的氨基酸序列至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列。
[0206]
在又一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含与选自由seq id no:25、49、73、97、121、145、169和193组成的组的氨基酸序列至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列，和/或该轻链可变区包含与选自由seq id no:26、50、74、98、122、146、170和194组成的组的氨基酸序列至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的
氨基酸序列。
[0207]
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列：
[0208]
(a)分别为seq id no:25和26，
[0209]
(b)分别为seq id no:49和50，
[0210]
(c)分别为seq id no:73和74，
[0211]
(d)分别为seq id no:97和98，
[0212]
(e)分别为seq id no:121和122，
[0213]
(f)分别为seq id no:145和146，
[0214]
(g)分别为seq id no:169和170，以及
[0215]
(h)分别为seq id no:193和194。
[0216]
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0217]
(a)分别为seq id no:25和26，
[0218]
(b)分别为seq id no:49和50，
[0219]
(c)分别为seq id no:73和74，
[0220]
(d)分别为seq id no:97和98，
[0221]
(e)分别为seq id no:121和122，
[0222]
(f)分别为seq id no:145和146，
[0223]
(g)分别为seq id no:169和170，以及
[0224]
(h)分别为seq id no:193和194。
[0225]
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含重链和轻链，该重链和该轻链包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少75％(例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的氨基酸序列：
[0226]
(a)分别为seq id no:27和28，
[0227]
(b)分别为seq id no:51和52，
[0228]
(c)分别为seq id no:75和76，
[0229]
(d)分别为seq id no:99和100，
[0230]
(e)分别为seq id no:123和124，
[0231]
(f)分别为seq id no:147和148，
[0232]
(g)分别为seq id no:171和172，以及
[0233]
(h)分别为seq id no:195和196。
[0234]
在另一个方面，本文提供了分离的单克隆抗体，其与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合并且包含重链和轻链，该重链和该轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0235]
(a)分别为seq id no:27和28，
[0236]
(b)分别为seq id no:51和52，
[0237]
(c)分别为seq id no:75和76，
[0238]
(d)分别为seq id no:99和100，
[0239]
(e)分别为seq id no:123和124，
[0240]
(f)分别为seq id no:147和148，
[0241]
(g)分别为seq id no:171和172，以及
[0242]
(h)分别为seq id no:195和196。
[0243]
在另一个方面，本文提供了结合到与本文所述的抗铜蓝蛋白抗体(参考抗体)相同的人铜蓝蛋白表位即结合到与参考抗体相同的人铜蓝蛋白表位的抗铜蓝蛋白抗体，其包含：
[0244]
(a)分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab e的cdr序列的抗体)；
[0245]
(b)分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab c的cdr序列的抗体)；
[0246]
(c)分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab g的cdr序列的抗体)；
[0247]
(d)分别包含seq id no:77、78和79所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:80、81和82所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab b的cdr序列的抗体)；
[0248]
(e)分别包含seq id no:101、102和103所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:104、105和106所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab f的cdr序列的抗体)；
[0249]
(f)分别包含seq id no:125、126和127所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:128、129和130所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab a的cdr序列的抗体)；
[0250]
(g)分别包含seq id no:149、150和151所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:152、153和154所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab d的cdr序列的抗体)；
[0251]
(h)分别包含seq id no:173、174和175所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:176、177和178所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab h的cdr序列的抗体)；
[0252]
(i)包含seq id no:25所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:26所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0253]
(j)包含seq id no:49所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:50所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0254]
(k)包含seq id no:73所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:74所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0255]
(l)包含seq id no:97所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0256]
(m)包含seq id no:121所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:122所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0257]
(n)包含seq id no:145所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:146所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0258]
(o)包含seq id no:169所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:170所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0259]
(p)包含seq id no:193所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:194所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0260]
(q)包含seq id no:27所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:28所示氨基酸序列的轻链；
[0261]
(r)包含seq id no:51所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:52所示氨基酸序列的轻链；
[0262]
(s)包含seq id no:75所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:76所示氨基酸序列的轻链；
[0263]
(t)包含seq id no:99所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:100所示氨基酸序列的轻链；
[0264]
(u)包含seq id no:123所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:124所示氨基酸序列的轻链；
[0265]
(v)包含seq id no:147所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:148所示氨基酸序列的轻链；
[0266]
(w)包含seq id no:171所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:172所示氨基酸序列的轻链；或
[0267]
(x)包含seq id no:195所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:196所示氨基酸序列的轻链。
[0268]
在另一个方面，本文提供了与本文所述的抗铜蓝蛋白抗体(参考抗体)竞争与人铜蓝蛋白结合例如与参考抗体竞争与人铜蓝蛋白结合的抗铜蓝蛋白抗体，其包含：
[0269]
(a)分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab e的cdr序列的抗体)；
[0270]
(b)分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab c的cdr序列的抗体)；
[0271]
(c)分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab g的cdr序列的抗体)；
[0272]
(d)分别包含seq id no:77、78和79所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:80、81和82所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab b的cdr序列的抗体)；
[0273]
(e)分别包含seq id no:101、102和103所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:104、105和106所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab f的cdr序列的抗体)；
[0274]
(f)分别包含seq id no:125、126和127所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:128、129和130所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab a的cdr序列的抗体)；
[0275]
(g)分别包含seq id no:149、150和151所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:152、153和154所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab d的cdr序列的抗体)；
[0276]
(h)分别包含seq id no:173、174和175所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:176、177和178所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab h的cdr序列的抗体)；
[0277]
(i)包含seq id no:25所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:26所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0278]
(j)包含seq id no:49所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:50所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0279]
(k)包含seq id no:73所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:74所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0280]
(l)包含seq id no:97所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:98所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0281]
(m)包含seq id no:121所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:122所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0282]
(n)包含seq id no:145所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:146所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0283]
(o)包含seq id no:169所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:170所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0284]
(p)包含seq id no:193所示氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:194所示氨基酸序列的轻链可变区；
[0285]
(q)包含seq id no:27所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:28所示氨基酸序列的轻链；
[0286]
(r)包含seq id no:51所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:52所示氨基酸序列的轻链；
[0287]
(s)包含seq id no:75所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:76所示氨基酸序列的轻链；
[0288]
(t)包含seq id no:99所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:100所示氨基酸序列的轻链；
[0289]
(u)包含seq id no:123所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:124所示氨基酸序列的轻链；
[0290]
(v)包含seq id no:147所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:148所示氨基酸序列的轻链；
[0291]
(w)包含seq id no:171所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:172所示氨基酸序列的轻链；或
[0292]
(x)包含seq id no:195所示氨基酸序列的重链和包含seq id no:196所示氨基酸序列的轻链。
[0293]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体与上文所列(a)-(x)中的一种或多种参考抗体竞争与人铜蓝蛋白的结合，例如，如使用本领域已知的方法所评估的，例如，如实例3所示。在一些实施例中，抗体与靶标竞争与另一种抗体的结合并且将另一种抗体与靶标的结合抑制至少10％，例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、100％、10％-100％、25％-100％、50％-100％、75％-100％、10％-75％、25％-75％、50％-75％、10％-50％、25％-50％或10％-25％。
[0294]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体以10-7
m或更少、约10-8
m或更少、约10-9
m或更少、约10-10
m或更少、约10-11
m或更少、约10-12
m或更少、约10-7
m至约10-12
m、约10-7
m至约10-11
m、约10-7
m至约10-10
m、约10-8
m至约10-12
m、约10-9
m至约10-12
m、约10-10
m至约10-12
m、约10-10
m至约10-11
m、约10-9
m至约10-11
m、或约10-10
m至约10-11
m的kd与人铜蓝蛋白结合。
[0295]
本文还提供了抗体混合物(例如，抗体组合物或抗体鸡尾酒)，其包含与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合的两种或三种抗体(在单一组合配制品或不同配制品中)，其中该两种或三种抗体选自包含mab e、c、g、b、f、a、d和h的重链和轻链cdr序列、重链和轻链可变区序列或重链和轻链序列的抗铜蓝蛋白抗体(例如，单克隆抗铜蓝蛋白抗体)。在一些实施例中，该抗体混合物包含两种抗体，其以10:1至1:1的比率存在。在其他实施例中，该抗体混合物包含三种抗体，其以1-3:1-3:1-3诸如2:1:1的比率存在。
[0296]
在特定实施例中，该抗体混合物(例如，抗体组合物)包含与铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2的氨基酸序列的人铜蓝蛋白)结合的两种或三种抗体，其中该两种或三种抗体选自由以下组成的组：
[0297]
(a)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab e的cdr序列的抗体)；
[0298]
(b)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab c的cdr序列的抗体)；或
[0299]
(c)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻
链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列(或具有由chothia或imgt编号系统定义的mab g的cdr序列的抗体)。
[0300]
在一些实施例中，该两种或三种抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0301]
(a)分别为seq id no:25和26，
[0302]
(b)分别为seq id no:49和50，以及
[0303]
(c)分别为seq id no:73和74。
[0304]
在一些实施例中，该两种或三种抗体包含重链和轻链，该重链和该轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0305]
(a)分别为seq id no:27和28，
[0306]
(b)分别为seq id no:51和52，以及
[0307]
(c)分别为seq id no:75和76。
[0308]
在一些实施例中，该抗体混合物包含选自子部分(a)-(c)的两种抗体(分别对应于上述与抗cp mab e、c和g相关的实施例)。例如，这两种抗体选自由以下组成的组：子部分(a)和(b)、(a)和(c)、以及(b)和(c)。在一些实施例中，该两种抗体以1-10:1-10，例如，10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的(a):(b)、(a):(c)、(b):(a)、(b):(c)、(c):(a)或(c):(b)比率存在。在特定的实施例中，该两种抗体以2:1的(a):(b)、(a):(c)、(b):(a)、(b):(c)、(c):(a)或(c):(b)比率存在。
[0309]
在一些实施例中，该抗体混合物包含子部分(a)-(c)的抗体(分别对应于上述与抗cp mab e、c和g相关的实施例)。在一些实施例中，这三种抗体以1-10:1-10:1-10，例如，1-3:1-3:1-3，例如，3:1:1、2:1:1、1:1:1、3:3:2、3:3:1、3:2:2、3:2:1、2:3:1、2:2:1、2:3:1、1:3:1或1:2:1的(a):(b):(c)、(a):(c):(b)、(b):(a):(c)、(b):(c):(a)、(c):(a):(b)或(c):(b):(a)比率存在。在特定实施例中，这三种抗体以2:1:1的(a):(b):(c)、(a):(c):(b)、(b):(a):(c)、(b):(c):(a)、(c):(a):(b)或(c):(b):(a)比率存在。
[0310]
评价抗体对人铜蓝蛋白的结合能力的标准测定法在本领域是已知的，包括例如，elisa、蛋白质印迹和ria。实例中还详细描述了合适的测定法。这些抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定法来评估，诸如通过表面等离子体共振(biacore分析)和octet测定法。
[0311]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物用于捕获(例如，免疫捕获)生物样品诸如血清或血浆中的铜蓝蛋白(例如，具有seq id no:1或2所示序列的人铜蓝蛋白)。在一些实施例中，该抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物免疫捕获生物样品中至少约70％，例如，约75％、大约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约85％至约95％、约85％至约96％、约85％至约97％、约85％至约98％、约85％至约99％、约90％至约95％、约90％至约96％、约90％至约97％、约90％至约98％、约90％至约99％的铜蓝蛋白。在一些实施例中，免疫捕获铜蓝蛋白以及后续去除生物样品中的捕获的铜蓝蛋白产生基本上不含铜蓝蛋白的生物样品。在一些实施例中，免疫捕获铜蓝蛋白以及后续去除生物样品中的捕获的铜蓝蛋白产生基本上不含铜蓝蛋白结合铜的生物样品。
[0312]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物用于从诸如血清或血浆的生物样品中耗减(例如，免疫耗减)铜蓝蛋白(例如，人铜蓝蛋白，例如，与铜结合的人铜蓝蛋白)。在一些实施例中，该抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物从生物样品中耗减至少约70％，例如，约75％、大约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约85％至约95％、约85％至约96％、约85％至约97％、约85％至约98％、约85％至约99％、约90％至约95％、约90％至约96％、约90％至约97％、约90％至约98％、约90％至约99％的铜蓝蛋白。在一些实施例中，生物样品中铜蓝蛋白的耗减产生基本上不含铜蓝蛋白的生物样品。在一些实施例中，生物样品中铜蓝蛋白的耗减产生基本上不含铜蓝蛋白结合铜的生物样品。
[0313]
在一些实施例中，在免疫捕获和后续去除免疫捕获的铜蓝蛋白之后，或在使用本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物免疫耗减铜蓝蛋白之后，约15％或更少，例如，约14％或更少、约13％或更少、约12％或更少、约11％或更少、约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、0-15％、0-14％、0-13％、0-12％、0-10％、0-9％、0-8％、0-7％、0-6％、0-5％、0-4％、0-3％、0-2％或0-1％的铜蓝蛋白保留在生物样品(例如，血清或血浆)中。
[0314]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体和抗体混合物用于从生物样品中免疫捕获或免疫耗减铜蓝蛋白，以允许直接测量游离铜浓度(即，非铜蓝蛋白结合铜或ncc)或不稳定结合铜(lbc)浓度。
[0315]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体结合(共价或非共价)到固体支持物上。可以使用本领域已知的任何合适的固体支持物。例如，在一些实施例中，该固体支持物选自由免疫捕获珠、琼脂糖树脂、色谱板、链霉亲和素板和滴定板(例如，微量滴定板)组成的组。在一些实施例中，这些免疫捕获珠是磁性免疫捕获珠。在一些实施例中，这些免疫捕获珠是链霉亲和素包被珠、蛋白g珠、蛋白a珠或蛋白a/g珠。在一些实施例中，这些免疫捕获珠是甲苯磺酰激活珠(例如，甲苯磺酰激活顺磁珠)，例如，甲苯磺酰激活(例如，来自赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific)的m-280和m-450)。在一些实施例中，将该抗体混合物中的一种或多种抗体不可逆地连接到该固体支持物上。在一些实施例中，该抗体或抗体混合物(即，该抗体混合物中的抗体)不可逆地连接到免疫捕获珠。
[0316]
表现出根据本领域已知和本文所述的方法确定的上述一种或多种功能特性(例如，生化、免疫化学、细胞、生理或其他生物活性等)的抗体将被理解为与相对于在没有抗体的情况下(例如，或当存在具有不相关特异性的对照抗体时)所见的在特定活性上的统计学显著差异有关。例如，该抗铜蓝蛋白抗体诱导的测量参数(例如，免疫捕获或免疫耗减效率)的增加引起测量参数的至少10％，诸如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(即2倍)、3倍、5倍或10倍的统计学显著增加。相反，抗铜蓝蛋白抗体诱导的测量参数(例如，残留在生物样品中的铜蓝蛋白的量)的降低引起至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的统计学显著降低。
[0317]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体的vh结构域连接到恒定结构域以形成重链，例如，全长重链。在一些实施例中，该vh结构域连接到人免疫球蛋白的恒定结构域，
例如igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igasec、igd和ige，或其变体(例如，包含效应子功能降低或无效应子功能的fc区的变体)，或来自另一物种(例如，兔)的等同物。在一些实施例中，该vh结构域连接到兔免疫球蛋白的恒定结构域(例如，seq id no:3的重链恒定结构域)。相似地，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体的vl结构域连接到恒定结构域(例如，人恒定结构域或seq id no:4的兔恒定结构域)以形成轻链，例如，全长轻链。
[0318]
在某些实施例中，与亲本多肽的天然序列恒定区或恒定区相比，该变体或改变的恒定区具有至少一个氨基酸取代、插入和/或缺失，例如，在该亲本多肽的天然序列恒定区或恒定区中约1至约100个氨基酸取代、插入和/或缺失。在一些实施例中，本文的变体或改变的恒定区将与天然序列恒定区和/或亲本多肽的恒定区具有至少约70％的同源性(相似性)或同一性，以及在一些情况下至少约75％，在其他情况下至少约80％的同源性或同一性，以及在其他实施例中至少约85％、90％或95％的同源性或同一性。该变体或改变的恒定区也可以包含一个或多个氨基酸缺失或插入。此外，该变体恒定区可以包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其导致改变的翻译后修饰，包括例如改变的糖基化模式。重组dna技术可以用于设计这些抗体中的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，例如，在可变区和/或恒定区中。如以下中所述的标准dna诱变技术：例如，sambrook等人(1989)“molecular cloning:a laboratory manual,2
nd edition,[分子克隆：实验室手册，第2版]”cold spring harbor laboratory press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约；harlow和lane(1988)；borrebaek,antibody engineering—a practical guide[抗体工程实用指南](1992)；johne等人,jimmunol methods[免疫学方法杂志]160:191-198(1993)，国际公开号wo 06/53301；以及美国专利号7,704,497。
[0319]
本文披露的抗铜蓝蛋白抗体包括所有已知形式的抗体和具有抗体样特性的其他蛋白质支架。例如，该抗体可以是人源化抗体、双特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗体(例如，具有兔可变区序列和人恒定区序列的嵌合抗体)或具有抗体样特性的蛋白质支架，诸如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。该抗体也可以是fab、fab’2、scfv、亲和体、高亲合性多聚体(avimer)、纳米抗体或结构域抗体。可以使用标准重组dna技术从vh和v
l
序列制备全长抗体，并且编码所需恒定区序列的核酸可以可操作地连接到可变区序列。抗铜蓝蛋白抗体的示例性序列显示在表19中。
[0320]
本文所述的抗铜蓝蛋白抗体和抗铜蓝蛋白酶抗体的混合物(例如，mab鸡尾酒)在很长一段时间内是稳定的。在某些实施例中，该抗体或抗体混合物例如在液态或固态下，例如在2℃-8℃的温度下具有至少9个月的保质期，例如，至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月、9-36个月、9-24个月、9-18个月、12-36个月、12-24个月、12-18个月、18-36个月、18-24个月或24-36个月。稳定性可以例如通过该抗体或抗体混合物的cp结合活性来测量，例如通过实例中所述的elisa来测量。在某些实施例中，例如当使用实例中描述的方法时，本文所述的抗体或抗体混合物例如当在2℃-8℃的温度下储存时，在至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月、3-9个月、3-12个月、3-24个月、3-36个月、6-9个月、6-12个月、6-24个月、6-36个月、9-12个月、9-24个月、9-36个月、12-24个月、12-36个月、18-24个月、18-36个月或24-36个月内，相对于基线(例如，新鲜制备的抗体或抗体混合物)显示cp结合活性的小于20％损失(例如，小于15％损失、小于10％损失、或小于5％损失)。
[0321]
iv.核酸
[0322]
本文还提供了编码本文所述的抗体的核酸分子。这些核酸可以存在于全细胞中，以细胞裂解物的形式存在，或以部分纯化或基本纯的形式存在。因此，本文还提供了包含这些核酸分子的宿主细胞，以及包含这些核酸的表达载体。本文所述的核酸可以是例如dna或rna，并且可以包含或不包含内含子序列。在某些实施例中，该核酸是cdna分子。
[0323]
本文所述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤表达的抗体，可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cdna。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码该抗体的核酸。
[0324]
在一些实施例中，本文提供了编码本文所述的任何抗铜蓝蛋白抗体的vh和/或vl序列、或重链和/或轻链序列的核酸分子。例如，在一些实施例中，提供了包含选自由seq id no:197-228组成的组的核苷酸序列的核酸。在一些实施例中，提供了编码在选自由seq id no:197-228组成的组的核苷酸序列内的重链可变区和/或轻链可变区、或重链和/或轻链、或其抗原结合部分的核酸。还提供了包含本文所述的核酸(例如，核酸分子)或核酸组的宿主细胞。
[0325]
一旦获得编码可变区区段的dna片段，就可以通过标准重组dna技术进一步操纵这些dna片段，例如，将可变区基因转换为全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。在这些操纵中，编码vl或vh的dna片段可操作地连接到编码另一种蛋白质的另一个dna片段，诸如抗体恒定区(例如，seq id no:229或230)或柔性接头。如在本上下文中所用，术语“可操作地连接”旨在指两个dna片段连接，使得由两个dna片段编码的氨基酸序列保持在框架内。
[0326]
通过将编码vh的dna可操作地连接到另一个编码重链恒定区(铰链、ch1、ch2和/或ch3)的dna分子，可以将编码vh区的分离的dna转换为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域是已知的(参见例如，kabat,e.a.等人(1991)sequences of proteins of immunological interest[免疫学目的蛋白质序列],第五版,美国卫生与公众服务部,nih出版号91-3242)，并且涵盖这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。在一些实施例中，该重链恒定区是兔重链恒定区。
[0327]
该重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，或来自其他物种(例如，兔)的等同物。对于fab片段重链基因，该编码vh的dna可以与仅编码重链ch1恒定区的另一个dna分子可操作地连接。该重链恒定区也可以是兔igg恒定区(例如，seq id no:229)。
[0328]
通过将编码vl的dna可操作地连接到编码轻链恒定区cl的另一个dna分子，可以将编码vl区的分离的dna转换为全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域是已知的(参见例如，kabat,e.a.等人(1991))，并且涵盖这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。该轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。在一些实施例中，该轻链恒定区是兔轻链恒定区(例如，seq id no:230)。
[0329]
在一些实施例中，编码重链可变区和轻链可变区或重链和轻链的核酸分子存在于单个表达载体中。在一些实施例中，编码重链可变区和轻链可变区或重链和轻链的核酸分子存在于多个表达载体(一组表达载体)中，这些表达载体可以一起引入宿主细胞中，使得该重链可变区和轻链可变区或重链和轻链在细胞中共表达。
[0330]
可通过将编码vh和vl的dna片段可操作地连接到编码本领域已知的柔性接头的另一个片段来产生scfv基因，使得vh序列和vl序列可表达为连续单链蛋白，其中vl区和vh区通过柔性接头连接(参见例如，bird等人(1988)science[科学]242:423-426；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；mccafferty等人,(1990)nature[自然]348:552-554)。
[0331]
本文还提供了具有保守序列修饰(即，在翻译核酸分子时不改变所得氨基酸序列的取代)的核酸分子，例如，用于密码子优化。
[0332]
iv.生产方法
[0333]
根据本披露内容，用于产生抗体(例如，抗铜蓝蛋白抗体)或其抗原结合片段的合适方法在本领域是已知的(参见，例如，美国专利号7,427,665；7,435,412；以及7,408,041，这些专利中每一个的披露内容通过引用以其整体并入本文)并且在本文中描述。重组技术可以用于基于单克隆抗体的序列产生抗体。
[0334]
重组dna技术可以用于修饰非人细胞中产生的抗体的一个或多个特征。因此，可以构建嵌合抗体(例如，包含兔可变区和人恒定区的抗体)。此外，抗体可以通过cdr移植和任选的框架修饰进行人源化。参见美国专利号5,225,539和7,393,648，这些专利中每一个的内容通过引用并入本文。
[0335]
重组dna技术可用于根据既定程序产生抗体，包括细菌或哺乳动物细胞培养中的程序。在此类实施例中，选择的细胞培养系统分泌抗体产物。
[0336]
在一些实施例中，本文披露的抗体的生产方法包括培养已经用杂合载体转化的宿主，例如，大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如cho细胞)。该载体包括一个或多个含有启动子的表达盒，该启动子可操作地连接到编码信号肽的第一dna序列，该信号肽在适当的阅读框中连接到编码抗体蛋白的第二dna序列(例如，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体的重链和/或轻链可变区、或重链和轻链)。然后收集并分离该抗体蛋白。任选地，表达盒可以包括可操作地连接到编码抗体蛋白的多顺反子(例如，双顺反子)dna序列的启动子，其各自单独可操作地连接到适当阅读框中的信号肽。
[0337]
也可以通过体内繁殖哺乳动物细胞来获得大量所需的抗体。哺乳动物宿主细胞的体外增殖在合适的培养基中进行，该培养基包括通常的标准培养基(例如像杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium，dmem)或rpmi 1640培养基)，任选地由哺乳动物血清(例如，胎牛血清)或微量元素和生长维持补充剂(例如饲养细胞，诸如正常小鼠腹腔渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞、2-氨基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等)进行补充。细菌细胞或酵母细胞等宿主细胞的增殖同样在本领域已知的合适的培养基中进行。例如，对于细菌，合适的培养基包括培养基le、nzcym、nzym、nzm、极品肉汤、sob、soc、2
×
yt或m9基本培养基。对于酵母，合适的培养基包括培养基ypd、yepd、基本培养基或完全基本省却成分培养基(complete minimal dropout medium)。
[0338]
体外生产提供了相对纯的抗体配制品，并且允许扩大生产以提供大量所需的抗体。用于细菌细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞培养的技术是本领域中已知的，并且包括同质悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)和固定化或包埋的细胞培养(例如，在中空纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷盒上)。
[0339]
前述和其他技术在例如以下中讨论：kohler和milstein,(1975)nature[自然]
256:495-497；美国专利号4,376,110；harlow和lane,antibodies:a laboratory manual[抗体：实验室手册],(1988)冷泉港，其披露内容全部通过引用并入本文。用于制备重组抗体分子的技术在上述参考文献中以及在例如以下中描述：wo 97/08320；美国专利号5,427,908；美国专利号5,508,717；smith(1985)science[科学]225:1315-1317；parmley和smith(1988)gene[基因]73:305-318；de la cruz等人(1988)j.biol.chem.[生物化学杂志]263:4318-4322；美国专利号5,403,484；美国专利号5,223,409；wo 88/06630；wo 92/15679；美国专利号5,780,279；美国专利号5,571,698；美国专利号6,040,136；davis等人(1999)cancer metastasis rev.[癌症转移评论]18(4):421-5；以及taylor等人(1992)nucleic acids research[核酸研究]20:6287-6295；tomizuka等人(2000)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]97(2):722-727，它们每一个的内容通过引用以其整体并入本文。
[0340]
为了分离抗体，可以浓缩培养上清液或腹水中的免疫球蛋白，例如，通过硫酸铵沉淀、针对吸湿性材料诸如聚乙二醇的透析、经由选择性膜过滤等。如果需要和/或期望，通过常规色谱方法纯化抗体，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、deae-纤维素色谱法和/或(免疫)亲和色谱法，例如，用一种或多种衍生自铜蓝蛋白表达细胞系的表面多肽或合成铜蓝蛋白片段肽、或蛋白-a或蛋白-g的亲和色谱法。
[0341]
抗体及其片段可以是“嵌合的”。嵌合抗体及其抗原结合片段包含来自两种或更多种不同物种(例如，兔和人)的部分。可以用剪接到人恒定结构域基因区段中的所需特异性的兔可变区来产生嵌合抗体(例如，美国专利号4,816,567)。
[0342]
还考虑到了非人(例如，兔)抗体的“人源化”形式(例如，本文披露的抗铜蓝蛋白抗体的人源化形式)。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，它们典型地取自“输入”可变结构域。制备人源化抗体的方法通常在本领域是公知的。例如，人性化基本上可以按照以下方法执行：winter及其同事(参见，例如，jones等人(1986)nature[自然]321:522-525；riechmann等人(1988)nature[自然]332:323-327；和verhoeyen等人(1988)science[科学]239:1534-1536)，通过用啮齿动物cdr或cdr序列取代人抗体的对应序列。另见，例如，staelens等人(2006)mol immunol[分子免疫学]43:1243-1257。人源化兔抗体的方法在本领域是已知的(参见，例如，us 2009/0104187、us 2016/0347864、us 2018/0127493、us专利号9,593,161、wo 04/016740、wo 08/144757、wo 05/016950，weber等人,experimental&molecular medicine[实验与分子医学]2017；49:e305；yu等人,plos one[公共科学图书馆期刊]2010；5；e9072；yu等人,biochem biophys res commun[生物化学与生物物理研究通讯]2013；436:543-50；borras等人,j biol chem[生物化学杂志]2010；285:9054-66；rader等人,j biol chem[生物化学杂志]2000；275:13668-76；steinberger等人,j biol chem[生物化学杂志]2000；275:36073-78；waldmeier等人,mabs 2016；8:726-70；rader等人,pnas 1998；95:8910-15。
[0343]
在一些实施例中，人源化形式的非人(例如，兔)抗体是人抗体(受体抗体)，其中受体抗体的高变(cdr)区残基被来自具有所需特异性、亲和力和结合能力的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等非人物种(供体抗体)的高变区残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区残基也被对应的非人残基替代(所谓的“反向突变”)。此外，噬菌体展示文库可以用于改变抗体序列内选定位置的氨基酸。人源化抗体的特性也受到人框架选择的影响。此外，人源化和嵌合抗体可以被修饰以包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基，
以便进一步改进抗体特性，例如像亲和力或效应子功能。
[0344]
在一些实施例中，产生表达包含编码抗铜蓝蛋白抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域、或重链和/或轻链的插入物的重组dna的细胞系。
[0345]
此外，编码抗铜蓝蛋白抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域、或抗铜蓝蛋白抗体的重链和/或轻链的dna可以酶促或化学合成，以含有编码重链可变结构域和/或轻链可变结构域、或重链和/或轻链、或其突变体的可信dna序列。可信dna的突变体是编码上述抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域、或重链和/或轻链的dna，其中一个或多个氨基酸被缺失、插入、或与一个或多个其他氨基酸交换。在一些实施例中，在人源化和表达优化应用中，一种或多种所述修饰位于抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的cdr之外。
[0346]
如本文所用，术语“突变体dna”也包括沉默突变体，其中一个或多个核苷酸被具有编码一种或多种相同氨基酸的新密码子的其他核苷酸替代。术语突变体序列也包括简并序列。简并序列在遗传密码的意义上是简并的，因为无限数量的核苷酸被其他核苷酸替代，而不会导致最初编码的氨基酸序列的改变。此类简并序列可能因其不同的限制性位点和/或特定密码子(这些密码子是特定宿主优选的，特别是大肠杆菌优选的)的频率而可用以获得重链鼠可变结构域和/或轻链鼠可变结构域的最佳表达。术语“突变体”旨在包括通过根据本领域已知的方法体外诱变可信dna而获得的dna突变体。
[0347]
为了组装完整的四聚体免疫球蛋白分子和表达嵌合抗体，将编码重链可变结构域和轻链可变结构域的重组dna插入物与编码重链恒定结构域和轻链恒定结构域的对应dna融合，然后转移到合适的宿主细胞中，例如在掺入杂合载体后。
[0348]
另一个实施例涉及编码重组多肽的重组dna，其中重链可变结构域和轻链可变结构域通过间隔子基团连接，任选地包含促进抗体在宿主细胞中加工的信号序列和/或编码促进抗体纯化的肽和/或切割位点和/或肽间隔子和/或药剂的dna序列。编码药剂的dna旨在为编码可用于诊断或治疗应用的药剂的dna。因此，特别指示出了作为毒素或酶的药剂分子，尤其是能够催化激活前药的酶。编码这种药剂的dna具有编码天然存在的酶或毒素的dna、或其突变体的序列，并且可以通过本领域已知的方法制备。
[0349]
因此，单克隆抗体可以是不与其他药剂(例如，可检测标记)缀合的裸抗体。可替代地，单克隆抗体可以与药剂缀合，例如像细胞毒性剂、小分子、激素、酶、生长因子、细胞因子、核酶、拟肽物、化学品、前药、包括编码序列的核酸分子(诸如反义、rnai、基因靶向构建体等)、可检测标记(例如，nmr或x射线造影剂、荧光分子等)、或促进与固体支持物结合的部分(例如，his标签、flag标签、myc标签、ha标签等)中至少一者。
[0350]
几种可能的载体系统可用于在哺乳动物细胞中表达克隆的重链基因和轻链基因。一类载体依赖于将所需基因序列整合到宿主细胞基因组中。具有稳定整合的dna的细胞可以通过同时引入选择性标记物抗性基因来选择，诸如大肠杆菌gpt(mulligan和berg(1981)proc natl acad sci usa[美国国家科学院院刊],78:2072)或tn5 neo(southern和berg(1982)mol appl genet.[分子遗传学和基因组学]1:327)。可选择标记基因可以连接到待表达的dna基因序列，或者通过共转染将其引入同一细胞中(wigler等人(1979)cell[细胞]16:77)。第二类载体利用赋予染色体外质粒自主复制能力的dna元件。这些载体可以衍生自动物病毒，诸如牛乳头瘤病毒(sarver等人(1982)proc natl acad sci usa[美国国家科学
院院刊],79:7147)、多瘤病毒(deans等人(1984)proc natl acad sci usa[美国国家科学院院刊]81:1292)、或sv40病毒(lusky和botchan(1981)nature[自然]293:79)。
[0351]
由于免疫球蛋白cdna仅由代表编码抗体蛋白的成熟mrna的序列组成，因此免疫球蛋白mrna的合成需要调节基因转录和rna加工的额外基因表达元件。这些元件可以包括剪接信号、转录启动子(包括诱导型启动子)、增强子和终止信号。掺入此类元件的cdna表达载体包括由以下中描述的那些：okayama和berg(1983)mol cell biol[分子细胞生物学]3:280；cepko等人(1984)cell[细胞]37:1053；和kaufman(1985)proc natl acad sci usa[美国国家科学院院刊]82:689。
[0352]
v.免疫缀合物
[0353]
本文所述的抗铜蓝蛋白抗体可以在表达和纯化后进行修饰。这些修饰可以是共价修饰或非共价修饰。此类修饰可以通过例如使多肽的靶向氨基酸残基与能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应而引入抗体中。可以使用多种标准中的任何一种来选择合适的修饰位点，包括例如抗体的结构分析或氨基酸序列分析。
[0354]
在一些实施例中，抗体可以与异源部分缀合。异源部分可以是例如异源多肽或可检测标记，诸如但不限于放射性标记、酶标记、荧光标记或发光标记。合适的异源多肽包括例如抗原标签(例如，flag、多组氨酸、血凝素(ha)、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)或麦芽糖结合蛋白(mbp))，用于纯化抗体或片段或促进免疫捕获和/或免疫耗减。异源多肽还包括可用作诊断或可检测标记物的多肽，例如萤光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)或氯霉素乙酰转移酶(cat)。合适的放射性标记包括例如
32
p、
33
p、
14
c、
125
i、
131
i、
35
s和3h。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(fitc)、绿色荧光蛋白(gfp)、dylight 488、藻红蛋白(pe)、碘化丙锭(pi)、percp、pe-alexa700、cy5、别藻蓝蛋白和cy7。发光标记包括例如各种发光镧系元素(例如，铕或铽)螯合物中的任何一种。例如，合适的铕螯合物包括二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)的铕螯合物。酶标记包括例如碱性磷酸酶、cat、萤光素酶和辣根过氧化物酶。异源多肽可以作为融合蛋白掺入抗铜蓝蛋白抗体中。生成编码抗体-异源多肽融合蛋白的核酸的方法在抗体工程领域是公知的，并在例如dakappagari等人(2006)j immunol[免疫学杂志]176:426-440中描述。
[0355]
两种蛋白质(例如，抗铜蓝蛋白抗体和异源部分)可以使用许多已知化学交联剂中的任何一种进行交联。此类交联剂的实例是那些通过包括“阻碍”二硫键的键连接两个氨基酸残基的交联剂。在这些连接中，交联单元内的二硫键受到保护(通过阻碍二硫键任意侧的基团)不被例如还原型谷胱甘肽或酶二硫化物还原酶的作用还原。一种合适的试剂，4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶二硫基)甲苯(smpt)，利用一种蛋白质上的末端赖氨酸和另一种蛋白质上的末端半胱氨酸在两种蛋白质之间形成这样的键。也可以使用通过每种蛋白质上的不同偶联部分而交联的异双功能试剂。其他可用的交联剂包括但不限于连接两个氨基(例如，n-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)、两个巯基(例如，1,4-双-马来酰亚胺丁烷)、一个氨基和一个巯基(例如，间-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯)、一个氨基和一个羧基(例如，4-[对叠氮水杨酰胺]丁胺)、以及存在于精氨酸侧链中的氨基和胍基(例如，对叠氮苯基乙二醛一水合物)的试剂。
[0356]
在一些实施例中，放射性标记可以直接与抗体的氨基酸骨架缀合。可替代地，放射性标记可以作为较大分子(例如，间-[
125
i]碘苯基-n-羟基琥珀酰亚胺([
125
i]mipnhs)中
的
125
i)的一部分包括在内，该分子与游离氨基结合形成相关蛋白质的间-碘苯基(mip)衍生物(参见，例如，rogers等人(1997)j nucl med[核医学杂志]38:1221-1229)或螯合物(例如，与dota或dtpa)结合，该螯合物又与蛋白质骨架结合。将放射性标记或含有它们的更大分子/螯合物与本文所述的抗铜蓝蛋白抗体缀合的方法在本领域是已知的。此类方法包括在促进放射性标记或螯合物与蛋白质结合的条件(例如，ph、盐浓度和/或温度)下孵育具有放射性标记的蛋白质(参见，例如，美国专利号6,001,329)。
[0357]
将荧光标记(有时称为“荧光团”)与蛋白质(例如，抗铜蓝蛋白抗体)缀合的方法在蛋白质化学领域中是已知的。例如，荧光团可以使用附着在荧光团上的琥珀酰亚胺基(nhs)酯或四氟苯基(tfp)酯部分与蛋白质的游离氨基(例如，赖氨酸)或巯基(例如，半胱氨酸)基团缀合。在一些实施例中，荧光团可以缀合到异双功能交联剂部分，诸如磺基-smcc。合适的缀合方法包括在促进荧光团与蛋白质结合的条件下将抗体蛋白质或其片段与荧光团一起孵育。参见，例如，welch和redvanly(2003)handbook of radiopharmaceuticals:radiochemistry and applications[放射性药物手册：放射化学与应用],约翰威利父子公司(john wiley and sons)(isbn 0471495603)。
[0358]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体可以例如用改进稳定性的部分进行修饰。例如，抗体或片段可以如以下中所描述聚乙二醇化：例如，lee等人(1999)bioconjug chem 10(6):973-8；kinstler等人(2002)advanced drug deliveries reviews[先进药物递送综述]54:477-485；和roberts等人(2002)advanced drug delivery reviews[先进药物递送综述]54:459-476。稳定部分可以将抗体(或片段)的稳定性或保留率改进至少1.5(例如，至少2、5、10、15、20、25、30、40或50或更多)倍。
[0359]
在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体可以被糖基化。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以经受酶或化学处理，或从细胞中产生，使得抗体或片段具有减少的糖基化或不存在糖基化。产生具有减少的糖基化的抗体的方法在本领域是已知的，并且描述于以下中：例如，美国专利号6,933,368；wright等人(1991)embo j 10(10):2717-2723；和co等人(1993)mol immunol[分子免疫学]30:1361。
[0360]
vi.使用方法
[0361]
本文提供了使用本文所述的抗铜蓝蛋白抗体和抗体混合物的方法。这些抗体和抗体混合物特别可用于从例如生物样品诸如人血清或血浆中免疫捕获铜蓝蛋白(例如，人铜蓝蛋白)。然后可以从生物样品中去除免疫捕获的铜蓝蛋白，以产生基本上耗尽铜蓝蛋白的生物样品(例如，小于10％，例如，小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％剩余的铜蓝蛋白)，允许直接测量游离铜浓度，诸如ncc或lbc浓度。本文所述的抗体和抗体混合物也可用于测量lbc浓度，如下文进一步详细描述的。该抗体和抗体混合物也适合用于标准分子生物学方法，诸如elisa、免疫印迹和免疫共沉淀。
[0362]
游离铜的测量方法
[0363]
本文提供了用于测量生物样品中铜浓度的方法。例如，所披露的方法提供了样品中游离铜的有效和准确的直接测量，并且消除了与当前使用的方法相关的一些问题，诸如估计出的ncc的生物学上不可能的负值，其基于来自全功能非威尔逊病cp值的特征的不正确假设。本文披露的方法提供了游离铜的准确和可靠的定量，因为它们直接测量游离铜(即，不是估计值)。
[0364]
因此，在一个方面，本文提供了一种测量生物样品中游离铜浓度的方法。在该方法中，样品和与铜蓝蛋白结合的免疫捕获试剂(即，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体和抗体混合物)接触，并且去除捕获的铜蓝蛋白，从而获得非铜蓝蛋白样品。然后测量非铜蓝蛋白样品中的游离铜浓度。
[0365]
一般来说，任何含有铜蓝蛋白的样品都是生物样品(例如，血清、血浆)并且可以用于本文所述的方法。威尔逊病的特征之一是血清铜蓝蛋白浓度小于200μg/ml。因此，在一些实施例中，本文所述的方法中使用的生物样品是铜蓝蛋白浓度小于约200μg/ml的那些。在一些实施例中，本文所述的方法中使用的样品是铜蓝蛋白浓度在约200μg/ml至约400μg/ml范围内的样品。
[0366]
在某些实施例中，该样品是人血浆或人血清样品。在一些实施例中，该样品是人血浆。在一些实施例中，该样品是人血清。在一些实施例中，该样品是哺乳动物血浆或哺乳动物血清样品。
[0367]
在本文所述的方法中，该样品和与铜蓝蛋白结合的免疫捕获试剂(即，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物)接触。去除捕获的铜蓝蛋白产生非铜蓝蛋白样品。
[0368]
在某些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物固定在固体支持物上，并且用作免疫捕获试剂。在一些实施例中，本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物被配置为在与铜蓝蛋白复合后固定在固体支持物上。可以使用本领域已知的任何合适的固体支持物。例如，在某些实施例中，该固体支持物是选自磁珠、琼脂糖树脂、色谱板、链霉亲和素板和滴定板的至少一种固体支持物。在至少一个实施例中，该固体支持物是磁珠。在另一个实施例中，该固体支持物选自琼脂糖树脂、色谱板、链霉亲和素板和滴定板。
[0369]
图9b(左分图)以图形方式显示了一种方法的示例性实施例，该方法包括用本文披露的抗cp抗体或抗体混合物包被珠，将所得的抗体包被珠与含cp的样品组合，将包被珠与样品一起孵育，然后去除珠，得到非铜蓝蛋白样品和铜蓝蛋白样品。
[0370]
本文所述的抗cp抗体和抗体混合物显示了cp耗减的高效率，这可以通过在免疫捕获后测量生物样品(例如，血浆或血清样品)中的铜蓝蛋白来测定。在一些实施例中，该抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物从生物样品中耗减至少约70％，例如，约75％、大约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约85％至约95％、约85％至约96％、约85％至约97％、约85％至约98％、约85％至约99％、约90％至约95％、约90％至约96％、约90％至约97％、约90％至约98％、约90％至约99％的铜蓝蛋白。在一些实施例中，生物样品中铜蓝蛋白的耗减产生基本上不含铜蓝蛋白的生物样品。在一些实施例中，生物样品中铜蓝蛋白的耗减产生基本上不含铜蓝蛋白结合铜的生物样品。
[0371]
在一些实施例中，约15％或更少，例如，约14％或更少、约13％或更少、约12％或更少、约11％或更少、约10％或更少、约9％或更少、约8％或更少、约7％或更少、约6％或更少、约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、0-15％、0-14％、0-13％、0-12％、0-10％、0-9％、0-8％、0-7％、0-6％、0-5％、0-4％、0-3％、0-2％或0-1％的铜蓝蛋白在使用本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物免疫捕获和耗减铜蓝蛋白之后，保留在生物样品(例如，血清或血浆)中。
[0372]
在一些实施例中，测量非铜蓝蛋白样品中的铜浓度。一般来说，使用电感耦合等离
子体质谱法(icp-ms)来测量铜浓度。可以使用适合于测量铜浓度的其他分析方法，包括但不限于电感耦合等离子体-光发射光谱法(icp-oes)和塞曼石墨炉原子吸收光谱法(zeeman graphite furnace atomic absorption spectroscopy，gfaas)。
[0373]
在一些实施例中，在测量铜浓度之前，将内标引入非铜蓝蛋白样品中。在某些实施例中，该内标包含铜、铑和铟中至少一者。在某些实施例中，该内标包含铜和铑中至少一者。
[0374]
在本文所述的方法中，通过本文所述的抗铜蓝蛋白抗体和抗体混合物去除铜蓝蛋白，以获得非铜蓝蛋白样品和免疫捕获的铜蓝蛋白样品。在一些实施例中，可以进一步评价该免疫捕获的铜蓝蛋白样品。例如，在某些实施例中，本文所述的方法进一步包括测量免疫捕获的铜蓝蛋白样品的铜蓝蛋白浓度。一般来说，使用质谱法测量铜蓝蛋白浓度。也可以使用适合于测量样品中蛋白质浓度的其他分析方法。在一些实施例中，质谱法或其他分析方法具有至少约5μg/ml的分析物(即，铜蓝蛋白)检测限。铜蓝蛋白浓度可以使用例如液相色谱质谱法(lc-ms)得到。在其他实施例中，本文所述的方法进一步包括测量免疫捕获的铜蓝蛋白样品的铜浓度。关于测量非铜蓝蛋白样品中的铜，可以如上提供测量铜浓度(例如，使用电感耦合等离子体质谱法)。
[0375]
直接测量免疫捕获的铜蓝蛋白样品中的铜浓度和铜蓝蛋白浓度可以提供铜与铜蓝蛋白的比率，其可以用作铜代谢相关障碍(诸如威尔逊病)和治疗的另一个诊断参数。因此，在一个实施例中，本文所述的方法进一步包括基于免疫捕获的铜蓝蛋白中的铜浓度和铜蓝蛋白浓度来测定铜与铜蓝蛋白的比率。
[0376]
用于治疗威尔逊病的治疗剂之一是四硫钼酸二胆碱(bc-ttm)，它通过将过量的铜与四硫钼酸盐阴离子缔合来去除过量的铜。当四硫钼酸盐与组织或血液中与蛋白质缔合的铜结合时，与蛋白质/铜(典型地是白蛋白/铜)形成紧密结合的三联复合物。这种四硫钼酸盐-铜-白蛋白三联复合物(“tpc”)的形成是bc-ttm作用机制的标志，并且将bc-ttm同不与铜形成蛋白质复合物的螯合剂区分开来。因此，钼(mo)已经被用作替代测量，以估计bc-ttm暴露和调整有效治疗剂量。
[0377]
本文提供的方法允许直接定量ncc，即使在接受bc-ttm的患者中也是如此。例如，这些方法还允许直接测量四硫钼酸盐-铜-白蛋白三联复合物(tpc，也称为mac或mo-alb-cu)中的铜浓度。
[0378]
因此，在一些实施例中，本文所述的方法进一步包括使非铜蓝蛋白样品与钼捕获试剂接触以获得钼样品。该钼捕获试剂可以是螯合竞争试剂或洗涤剂。在一些实施例中，该方法进一步包括测量该钼样品中的钼结合铜的浓度。关于测量非铜蓝蛋白样品中的铜，可以如上提供测量铜浓度。例如，使用电感耦合等离子体质谱法测量该钼样品的铜浓度。准确的非铜蓝蛋白结合铜的浓度可以通过从非铜蓝蛋白样品中的铜浓度减去钼样品中的铜浓度来获得。在一些实施例中，在与钼捕获试剂接触之前，对非铜蓝蛋白样品进行超滤或用免疫捕获试剂接触，以去除血浆超滤铜。
[0379]
在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括使非铜蓝蛋白样品与螯合剂接触，该螯合剂与该样品中存在的不稳定结合铜结合。在一些实施例中，这种螯合剂不结合tpc中存在的铜。然后可以从该样品中除去tpc，留下包含不稳定结合铜的样品(“不稳定结合铜样品”)。
[0380]
本文所述的方法中使用的螯合剂可以选自与不稳定结合铜结合的任何螯合剂，诸
如作为非限制性实例，盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀、青霉胺和乙二胺四乙酸(也称为edta)。在一些实施例中，该螯合剂包括edta。
[0381]
加入该螯合剂后，可以任选地混合和/或孵育所得样品。可以通过本领域普通技术人员已知的任何合适技术(包括作为非限制性实例的过滤)从非铜蓝蛋白样品中去除tpc。在一些实施例中，在去除tpc之后离心该样品。
[0382]
如上所述，本文所述的方法进一步包括测量该不稳定结合铜样品中的铜浓度。一般来说，可以使用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)来测量铜浓度。可以使用适合于测量铜浓度的其他分析方法，包括但不限于电感耦合等离子体-光发射光谱法(icp-oes)和塞曼石墨炉原子吸收光谱法(gfaas)。
[0383]
图9b(右分图)以图形方式显示了一种方法的示例性实施例，该方法进一步包括使非铜蓝蛋白样品与螯合剂接触，孵育所得混合物，去除tpc，并且测量该不稳定结合铜样品中的铜浓度。
[0384]
在一些实施例中，在测量铜浓度之前，将内标引入不稳定结合铜样品中。在一些实施例中，该内标包含铜、铑和铟中至少一者。在一些实施例中，该内标包含铜和铑中至少一者。
[0385]
鉴定或诊断患者的方法
[0386]
本文还提供了鉴定或诊断患有铜代谢相关疾病或障碍的患者的方法，该方法包括根据本文所述的方法测量来自患者的样品中非铜蓝蛋白结合铜的浓度，以及使用非铜蓝蛋白结合铜的浓度的鉴定或诊断患有该疾病或障碍的患者。
[0387]
在另一个方面，本文还提供了鉴定或诊断患有铜代谢相关疾病或障碍的患者的方法，该方法包括根据本文所述的方法测量来自患者的样品中不稳定结合铜的浓度，以及使用不稳定结合铜的浓度来鉴定或诊断患有该疾病或障碍的患者。
[0388]
在一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是威尔逊病。在一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是铜毒性(例如，由于高暴露于硫酸铜杀真菌剂、摄入高铜饮用水、过度使用铜补充剂等)。在一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是铜缺乏、门克斯病或遗传性铜蓝蛋白缺乏症。在一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是选自由以下组成的组的一种或多种疾病或障碍：学业不良、痤疮、注意力缺乏/多动症、肌萎缩侧索硬化、动脉粥样硬化、自闭症、自身免疫性疾病、阿尔茨海默病、念珠菌过度生长、慢性疲劳、肝硬化、抑郁症、肾上腺素活性升高、铜蛋白升高、去甲肾上腺素活性升高、情绪崩溃、纤维肌痛、频繁发怒、老年相关的铜排泄受损、高度焦虑、脱发、肝病、活动过度、甲状腺功能减退、对雌激素不耐受、对避孕药不耐受、k-f环、学习障碍、多巴胺活性低、多发性硬化、神经问题、氧化应激、帕金森病、注意力不集中、聚焦不良、免疫功能差、耳鸣、过敏、对食用色素敏感、对贝类敏感、皮肤金属不耐受、皮肤敏感、睡眠问题和指甲上白斑。
[0389]
治疗方法
[0390]
本文提供了治疗患有铜代谢相关疾病或障碍(例如，使用本文所述的抗体、抗体混合物和方法诊断的疾病或障碍)的患者和监测对该患者的治疗的方法。
[0391]
在本文所述的治疗方法的一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是威尔逊病。在本文所述的治疗方法的一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是铜毒性(例如，由于高暴露于硫酸铜杀真菌剂、摄入高铜饮用水、过度使用铜补充剂等)。在本文所述的治疗方法
的一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是铜缺乏、门克斯病或遗传性铜蓝蛋白缺乏症。在本文所述的治疗方法的一些实施例中，该铜代谢相关疾病或障碍是选自以下至少一种：学业不良、痤疮、注意力缺乏/多动症、肌萎缩侧索硬化、动脉粥样硬化、自闭症、自身免疫性疾病、阿尔茨海默病、念珠菌过度生长、慢性疲劳、肝硬化、抑郁症、肾上腺素活性升高、铜蛋白升高、去甲肾上腺素活性升高、情绪崩溃、纤维肌痛、频繁发怒、老年相关的铜排泄受损、高度焦虑、脱发、肝病、活动过度、甲状腺功能减退、对雌激素不耐受、对避孕药不耐受、k-f环、学习障碍、多巴胺活性低、多发性硬化、神经问题、氧化应激、帕金森病、注意力不集中、聚焦不良、免疫功能差、耳鸣、过敏、对食用色素敏感、对贝类敏感、皮肤金属不耐受、皮肤敏感、睡眠问题和指甲上白斑。
[0392]
在一些实施例中，这些方法包括根据本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法测量来自患者的样品中非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度；使用非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度诊断患有该铜代谢相关疾病或障碍的患者；以及向患有该疾病或障碍的患者施用有效量的治疗剂。
[0393]
在一些实施例中，这些方法包括向患有该铜代谢相关疾病或障碍的患者施用有效量的治疗剂，其中使用来自患者的样品中的非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度将患者鉴定为患有疾病或障碍，该浓度是如通过本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法中的一种或多种来测量的。
[0394]
在一些实施例中，该方法包括向患者施用第一有效量的治疗剂；根据本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法测量来自患者的样品中非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度；使用非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度调节该治疗剂的第一有效量，以获得第二有效量；以及向患有该疾病或障碍的患者施用该第二有效量的治疗剂，其中该第二有效量的治疗剂通过包括根据本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法测量来自该患者的样品中非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度的方法来测定。
[0395]
威尔逊病的治疗目标是去除身体组织中积累的铜，随后防止铜的再积累。d-青霉胺和曲恩汀是两种可以用于治疗有症状的威尔逊病的螯合剂。d-青霉胺可以被视为一线疗法；然而，一些患者在经历不良事件后需要改用曲恩汀。青霉胺的非限制性实例包括(威朗制药国际公司(valeant pharmaceuticals,inc.))和(迈兰特制品公司(mylan specialty lp))。曲恩汀也可以用作一线疗法。曲恩汀的非限制性实例包括盐酸曲恩汀(诸如(威朗制药国际公司))和四盐酸曲恩汀(诸如(gmporphan sa))。治疗的目标可能包括防止铜再积累和维持治疗。锌盐(非限制性实例包括(乙酸锌)(梯瓦制药(teva pharmaceuticals))和(乙酸锌二水合物)(利康罕见病公司(recordati rare diseases)))可以用于维持治疗，也可以用作包括例如无症状患者在内的患者的一线疗法，以减少铜吸收。过去将四硫钼酸铵作为一种潜在的治疗选择进行了研究。四硫钼酸二胆碱(bc-ttm)是一种铜蛋白结合剂，也可以用于治疗威尔逊病。bc-ttm能够快速形成高特异性的铜蛋白复合物，对肝脏和血液中的游离铜进行解毒，并且促进铜的胆汁排泄。
[0396]
在一些实施例中，该治疗剂选自由以下组成的组：四硫钼酸二胆碱、锌(或锌盐)、盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀和青霉胺。在其他实施例中，该治疗剂包含四硫钼酸二胆碱。在一些实施例中，该治疗剂被配制成包含药学上可接受的载剂的药物组合物。
[0397]
先前已经确定了bc-ttm的治疗有效量。例如，在某些实施例中，bc-ttm可以在每天约15至60mg的范围内施用。在某些实施例中，bc-ttm以每天约15mg的量施用。在某些实施例中，bc-ttm以每天约30mg的量施用(例如，每天两次服用约15mg或每天一次服用两片15mg片剂)。在某些实施例中，bc-ttm以每天约45mg的量施用(例如，每天三次服用约15mg或每天一次服用三片15mg片剂)。在某些实施例中，bc-ttm以每天约60mg的量施用(例如，每天四次服用约15mg或每天一次服用四片15mg片剂)。
[0398]
在某些其他实施例中，bc-ttm可以在每隔一天约15至60mg的范围内施用。在某些实施例中，bc-ttm以每隔一天约60mg的量施用。在某些实施例中，bc-ttm以每隔一天约15mg的量施用。在某些实施例中，bc-ttm以每隔一天约30mg的量施用。在某些实施例中，bc-ttm以每隔一天约45mg的量施用。在某些实施例中，bc-ttm以每隔一天约60mg的量施用。
[0399]
在一些实施例中，第二有效量低于第一有效量。在其他实施例中，第二有效量高于第一有效量。
[0400]
在另一方面，本文提供了鉴定适合用四硫钼酸二胆碱治疗的受试者的方法，该方法包括根据本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法测量来自受试者的样品中非铜蓝蛋白结合铜的浓度，使用非铜蓝蛋白结合铜的浓度鉴定适合用四硫钼酸二胆碱治疗的受试者，以及任选地给被鉴定为适合用四硫钼酸二胆碱治疗的受试者施用治疗有效量的四硫钼酸二胆碱。
[0401]
在另一方面，本文提供了鉴定适合用四硫钼酸二胆碱治疗的受试者的方法，该方法包括根据本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法测量来自受试者的样品中不稳定结合铜的浓度，使用不稳定结合铜的浓度鉴定适合用四硫钼酸二胆碱治疗的受试者，以及任选地给被鉴定为适合用四硫钼酸二胆碱治疗的受试者施用治疗有效量的四硫钼酸二胆碱。
[0402]
铜代谢生物标记物
[0403]
生物样品中的游离铜浓度可以指示可能在患者血液中循环并且在患者组织和器官中积累的游离铜的浓度。因此，如通过本文所述的使用抗体或抗体混合物的ncc测定方法和lbc测定方法测量的ncc和/或lbc可以是患者铜代谢的生物标记物。更特别地，如通过本文所述的使用抗体或抗体混合物的ncc测定方法和nbc测定方法测量的ncc和/或lbc可以用于诊断、鉴定患有本文所述的铜代谢相关障碍或疾病的患者或监测对该患者的治疗。
[0404]
可以将该生物标记物与健康受试者或患者中可作为阈值水平的特定的经验证的游离铜浓度参考范围进行比较。在一些实施例中，将该生物标记物与阈值进行比较，例如，特定目的患者群体亚组(例如像族群、年龄、性别、并存疾病和其他因素)中游离铜浓度的特定的经验证的参考范围。
[0405]
vii.试剂盒
[0406]
本文提供了用于测量生物样品(例如，人血浆或血清样品)中的铜浓度，特别是游离铜浓度(例如，ncc和/或lbc)的试剂盒。
[0407]
在一些实施例中，这些试剂盒包含本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物，任选地包含在单个小瓶或容器中，并且包括使用说明书，例如，关于从样品(例如，生物样品)中免疫捕获铜蓝蛋白的使用说明书。在一些实施例中，这些试剂盒包含本文所述的抗铜蓝蛋白抗体或抗体混合物、本文所述的螯合剂和使用说明书。
[0408]
这些试剂盒还可以包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括试剂
盒上提供的或与试剂盒一起提供的任何文字、营销材料或记录材料，或以其他方式伴随试剂盒的材料。在一些实施例中，该使用说明书包括特定目的群体亚组(例如像族群、年龄、性别、并存疾病和其他因素)中游离铜浓度的特定的经验证的参考范围(阈值)。
[0409]
在一些实施例中，本文披露的试剂盒可以用于鉴定或诊断患有铜代谢相关障碍或疾病的患者。在其他实施例中，本文披露的试剂盒可以用于随时间监测患者体内的游离铜。
[0410]
在一些实施例中，本文所述的试剂盒可以形成包含用于在治疗铜代谢相关疾病或障碍(诸如威尔逊病)中使用的治疗剂和使用说明书的试剂盒的一部分。
[0411]
‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑‑
[0412]
本发明由以下实例进一步说明，这些实例不应被解释为进一步的限制。贯穿本技术引用的序列表、附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
[0413]
实例
[0414]
除非另有指示，否则根据制造商的说明书使用以下实例中提及的市售试剂。除非另有说明，本发明使用已知的重组dna技术程序，诸如在以下教科书中描述的那些程序：sambrook等人,同上；ausubel等人,current protocols in molecular biology[当代分子生物学实验手册](格林出版联营公司和威利国际科学公司,纽约,1989)；innis等人,pcr protocols:a guide to methods and applications[pcr实验手册：方法和应用指南](academic press,inc.[学术出版社公司]:纽约,1990)；harlow等人,antibodies:alaboratory manual[抗体：实验室手册](cold spring harbor press[冷泉港出版社]:冷泉港,1988)；gait,oligonucleotide synthesis[寡核苷酸合成](irl出版社:牛津,1984)；freshney,animal cell culture[动物细胞培养],1987；coligan等人,current protocols in immunology[当代免疫学实验手册],1991。
[0415]
实例1：抗铜蓝蛋白(抗cp)单克隆抗体的生成
[0416]
通过用纯化的人铜蓝蛋白(雅典研究与技术公司(athens research&technology))免疫接种三只不同的兔，生成了一系列针对抗铜蓝蛋白(cp)的单克隆抗体(mab)。
[0417]
使用ficoll paque(ge医疗集团(ge healthcare))通过密度梯度离心从免疫接种的兔中分离外周血单核细胞(pbmc)。将纯化的人铜蓝蛋白通过可用的伯胺与dylight 488缀合，并且与兔pbmc以及对兔igg和igm具有特异性的荧光标记抗体(bethyl实验室)一起孵育。
[0418]
使用facsjazz(贝迪公司(becton dickinson))，结合铜蓝蛋白的igg阳性细胞被单独分选到96孔板的孔中，并且提供人il-2(prospec)、人il-21(prospec)和可溶性兔cd40l以刺激增殖和抗体分泌。12天后，通过elisa评价96孔培养上清液中是否存在能够结合铜蓝蛋白的抗体。发现1,336个孔中有250个含有铜蓝蛋白特异性抗体。
[0419]
尝试克隆36个b细胞培养物的各个抗体重链和轻链对，通过elisa，这些b细胞培养物表现出稳健铜蓝蛋白结合(每只兔12个培养物，以采样每个培养物的抗体多样性)。简而言之，通过rt-pcr扩增ighg vh和igk1 vl，然后克隆到细菌质粒载体中以生成全长重链和轻链。这些载体包含cmv启动子和生长激素聚腺苷酸化信号序列，以促进在哺乳动物细胞中的表达。将全长重链和轻链表达载体共转染到6孔板中的悬浮适应hek-293细胞中，用于瞬
时产生抗体以用于后续的筛选。
[0420]
通过琼脂糖凝胶电泳对vh和vl pcr产物可视化、vh和vl序列分析、瞬时条件培养基兔igg定量和瞬时条件培养基铜蓝蛋白结合活性测定法的组合，确定36个克隆尝试中有29个使得回收到vh和vl，并且成功瞬时产生能够结合人铜蓝蛋白的重组抗体，并且其中28种抗体在序列上是独特的。
[0421]
实例2：抗cp mab的表征
[0422]
从实例1中描述的过程获得总共28种功能性抗cp mab，并且测试其各种特性。
[0423]
28个重组抗cp mab的铜蓝蛋白结合测试如下。用在buph碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(赛默飞公司(thermofisher))中的10ug/ml山羊抗兔igg-fc(bethyl实验室)包被透明的96孔板(能肯公司(nunc)，maxisorp)并且在4度下孵育过夜。丢弃包被溶液，并且在室温下用pbs中的1％ bsa封闭板2小时，然后丢弃封闭溶液。将28个抗cp mab瞬时条件培养基在含有1％ bsa的pbs-t中稀释至50ng/ml，并且在封闭板上室温孵育1小时。用单独的含有1％ bsa的pbs-t或用含有50ng/ml非cp特异性兔mab的瞬时条件培养基孵育阴性对照孔。
[0424]
在用tbs-t洗涤3次后，在室温下用下列之一探询捕获的mab 1小时：
[0425]-在pbs-t中稀释的20ng/ml纯化的人铜蓝蛋白(雅典研究与技术公司)，
[0426]-在pbs-t中1:10稀释的肝素锂正常人血浆，
[0427]-在pbs-t中1:10,000稀释的肝素锂正常人血浆，或
[0428]-单独的pbs-t。
[0429]
在用tbs-t洗涤3次后，在室温下用在含有1％ bsa的pbs-t中稀释的100ng/ml生物素化的多克隆山羊抗铜蓝蛋白(bethyl实验室)探测结合的铜蓝蛋白1小时。
[0430]
在用tbs-t洗涤3次后，在室温下用在stabilzyme(舒尔默迪克斯公司(surmodics))中的40ng/ml缀合有hrp的链霉亲和素(赛默飞公司)孵育各孔30分钟。
[0431]
在用tbs-t洗涤3次后，在室温下通过加入tmb底物(舒尔默迪克斯公司)经由生物素化的山羊抗铜蓝蛋白/链霉亲和素-hrp复合物检测抗cp mab结合的铜蓝蛋白。15分钟后，通过加入0.18m硫酸停止hrp-tmb反应，并且使用分光光度计测量450nm处的吸光度。
[0432]
如图1所示，虽然1:10血浆的背景值较高(参见稀释缓冲液(“dilb”)，其对应于没有捕获到mab和非cp特异性抗体(“ns mab”))，但所有28个mab都与内源性人cp结合。考虑到抗体之间一致的高信号，根据该数据进行排序是不可能的。因此，另外使用进一步稀释的血浆(1:10,000)测试抗cp mab，这得到了在每种分析物(即，1:10,000血浆和纯化的cp)的结果之间具有良好相关性的cp结合强度排序，如图2和3所示。在图3中，dilb和ns mab显示为正方形。两种mab(aa和bb，在图3中显示为三角形)显示与血浆cp和纯化的cp的结合之间的相关性较差。
[0433]
接下来，测试抗cp mab从netn缓冲液中的纯化cp中免疫耗减cp的能力。简而言之，将50ul蛋白g dynabead与6ug未纯化的mab一起孵育2.5小时。去除mab cm，并且将珠与netn缓冲液中的10ug纯化的cp一起孵育过夜。去除cp溶液(免疫沉淀(“ip”)后输入)，用netn洗涤珠，并且用凝胶上样缓冲液洗脱结合的蛋白质。使5％的洗脱液在sds-page凝胶上运行，后续用a80-124a多克隆抗体进行蛋白质印迹，并且用兔抗山羊-hrp二抗进行检测。ip前输入(0.33ug)与使用a80-124a(阳性对照)和多克隆非免疫兔igg(阴性对照)进行的ip一起包括在凝胶上。以与从珠释放的蛋白质相同的方式分析3.3％的ip后输入。
[0434]
如图4所示，所有的抗cp mab和多克隆抗体都能够捕获cp。表1中提供了上面讨论的mab的物理特性的概述(基于1:10k血浆关于cp结合强度从高到低排序)。
[0435]
表1.抗cp抗体的物理特性
[0436][0437][0438]1igg浓度是指未纯化的瞬时转染条件培养基(cm)
[0439]2克隆型主要基于cdr3同源性描述了mab的相关性。克隆型字母指示家族，而独特的编号指示独特的家族成员。
[0440]3a450列代表来自elisa实验的数据。
[0441]4因序列数据质量而产生不明确性。
[0442]
基于表1所示的结合强度排序，选择前8种抗cp mab，并且进一步如下表征它们的结合特性。
[0443]
通过在悬浮适应hek-293细胞中以50ml规模瞬时转染产生这8种抗cp mab，并且使用蛋白a纯化。抗体产量显示在表2中。
[0444]
表2.抗cp抗体产量
[0445]
抗cp mab产量(mg)a1.3b0.8c0.4d1.3e1.0f1.1g1.8h1.3
[0446]
为了评估这8种抗cp mab与cp的结合，以50:1生物素:mab摩尔比使抗体生物素化。按预计在对包被cp的竞争框并(competition binning)elisa中使用生物素化的mab，评价8种抗cp mab结合以10、2和0.4ug/ml包被的cp的能力。以50ng/ml测试根据实例1生成的原始cm，并且以50、10、2和0.4ng/ml测试生物素化和非生物素化、纯化的抗cp mab。图5a-5h显示了抗cp mab与以0.4ug/ml包被的cp的结合，并且使用抗兔igg二抗检测，其中“b
‑”
表示生物素化的纯化的抗cp mab；“nb
‑”
表示非生物素化的纯化的抗cp mab；“cm
‑”
表示未纯化的瞬时转染条件培养基抗cp mab。
[0447]
所有8种抗cp mab都与包被cp结合，生物素化对cp结合影响很小或没有影响。纯化的抗cp mab与包被cp结合，类似于原始未纯化的cm。
[0448]
如图6所示，当用链霉亲和素-hrp(sa-hrp)检测时，生物素化的抗cp mab与包被cp结合的信号强度低于用抗兔igg-hrp检测时。对包被cp的最强结合物是mab c、e和g。在非饱和条件下(0.4ug/ml cp包被，10ng/ml mab)，如通过抗兔hrp和sa-hrp检测到的针对生物素化的mab的结合所获得的信号通常具有良好的相关性，这表明所有mab都以相似程度被生物素化(图7)。值得注意的是，许多mab显现出相比它们结合溶液中cp的情况，结合包被cp的情况相对较差(图8)。
[0449]
实例3：纯化的抗cp mab的竞争框并
[0450]
为了评估8种抗cp抗体中的任何一种是否相互竞争与cp结合，执行了以下elisa研究。
[0451]
简而言之，将cp以0.4ug/ml包被在板上过夜。然后用1％ bsa封闭板4小时，用10ug/ml未标记的封闭抗体孵育1小时，然后在不洗涤的情况下，用50ng/ml生物素化的探针抗体(probe antibody)孵育1小时。洗涤板，后续用sa-hrp孵育30分钟，随后再次洗涤。然后
将板用tmb底物孵育30分钟或15分钟，如下所述，并且通过加入0.18m硫酸停止反应，并在a450下读取。实验在两个板上执行，板1的tmb孵育时间为30分钟，板2的tmb孵育时间为15分钟。在板1上测试对包被cp较弱的结合物，在板2上测试较强的结合物，在板之间有一些重复。探针ab/封闭ab相互作用显示在表3中，并且表4和5中提供了所有8种抗cp mab和在包被cp上显示出最稳健的信号的5种mab(如图6所示)的框并结果概述。
[0452]
表3.抗cp抗体框并结果
[0453][0454]
表3中的数字对应于百分比。
[0455]
》75％：未被封闭抗体抑制的探针抗体结合(无竞争)
[0456]
25％≤x≤75％：被封闭抗体部分抑制的探针抗体结合(部分竞争)
[0457]
《25％：被封闭抗体显著抑制的探针抗体结合(显著竞争)
[0458]
表4.抗cp抗体框并概述
[0459][0460]
ni：无抑制；pi：部分抑制；si：显著抑制
[0461]
b-：生物素化
[0462]
表5.5种抗体的抗cp抗体框并概述
[0463][0464]
ni：无抑制；pi：部分抑制；si：显著抑制
[0465]
基于以下选择mab e、c和g进行进一步的免疫捕获测试：它们与包被和溶液相cp(包括内源性血浆cp)的良好结合、生物素化时与cp的结合的保留以及不存在交叉竞争结合包被cp。
[0466]
实例4：通过cp测定法测量抗cp mab的免疫捕获效率
[0467]
为了测试e、c和g单独使用以及以两种或三种抗cp mab的混合物使用时免疫捕获人肝素锂血浆样品中cp的能力，进行了以下cp测定法，其中评价了不同mab、mab混合物和多克隆抗体(pab)从人肝素锂血浆中免疫捕获人cp的效率。实验程序的示意图显示在图9a中。
[0468]
cp是人血浆中的内源性组分。因此，在血浆中制备校准标准品或qc样品是不可行的。使用痕量铜bsa缓冲液作为替代基质制备校准标准品。
[0469]
制备
[0470]
通过将约0.1ml tween-20加入约1000ml的1x pbs缓冲液中并且充分混合来制备封闭缓冲液。
[0471]
用9.75ml封闭缓冲液稀释250μl的20mg/ml痕量铜bsa溶液并且充分混合来制备bsa缓冲液(0.5mg/ml)。通过向bsa溶液中加入edta溶液，随后通过30kda分子量截留(mwco)过滤器过滤，制备痕量铜bsa溶液，得到在水中的20mg/ml痕量铜bsa溶液。
[0472]
通过将50ml 1m tris-hcl缓冲液(ph 8.5)稀释在950ml纯化水中并且充分混合以获得50mm tris缓冲溶液(ph 8.5)来制备tris缓冲液。
[0473]
通过将92.4mg的dtt用10ml的50mm tris缓冲液(ph 8.5)溶解并且充分混合以获得60mm二硫苏糖醇(dtt)溶液来制备ddt溶液。
[0474]
通过将185mg碘乙酰胺与5ml的50mm tris缓冲液(ph 8.5)溶解并且充分混合以获得200mm碘乙酰胺溶液来制备碘乙酰胺溶液。
[0475]
通过向100μg胰蛋白酶中加入1ml的50mm tris缓冲液(ph 8.5)以获得0.1mg/ml的终浓度并并且充分混合来制备胰蛋白酶溶液。
[0476]
通过向约20μl样品中加入约190μl的bsa缓冲液(0.5mg/ml)来制备对照样品。
[0477]
为了制备抗cp抗体包被珠，将约50mg磁珠(m-280甲苯磺酰激活磁珠)与500μl偶联缓冲液a(0.1m硼酸盐缓冲液，ph 9.5)和500μl偶联缓冲液c(偶联缓冲液a中的3m硫酸铵，ph 9.5)以及60μl 10mg/ml抗cp抗体一起在37℃下旋转孵育过夜(约18小时)。在用抗体孵育后，将包被珠与1ml偶联缓冲液d(50mm tris中的5mg/ml bsa，ph 8.5)一起加入，并且在37℃下旋转孵育1小时。最后，将抗体包被珠以40mg/ml的最终珠浓度重新悬浮在1.25ml bsa缓冲液中。
[0478]
cp的免疫捕获
[0479]
将约200μl包被有抗cp抗体(约96μg)的珠(约8mg)加入到96孔lobind板(eppendorf)各孔中的约20μl的人血浆或在bsa缓冲液中制备的cp(800μgcp/ml)(即std8，见表10)中。将板密封，以约500rpm离心大约1分钟，并且在室温下在板振荡器上以1000rpm孵育大约1.5小时。将板以约500rpm离心大约1分钟。
[0480]
使用kingfisher flex纯化系统从孔中去除包被珠(剩余溶液包含ncc级分)，并且用约300μl封闭缓冲液洗涤两次，用约300μl水洗涤一次。用约200μl的30mm hcl洗脱珠上的cp大约10分钟。该免疫捕获程序分离了cp并且生成了ncc级分(约210μl)。
[0481]
在is加标、胰蛋白酶消化和分析之前，对照样品没有进行免疫捕获。
[0482]
is加标
[0483]
向每个孔中加入约10μl内标(is)加标物(在水中的2μg/ml gayplsiepig[(
13
c5,
15
n)val]r肽(seq id no:232))。将孔以约500rpm离心大约1分钟，然后在低设定下涡旋大约1分钟。将约50μl从每个孔转移到新的96孔lobind板(eppendorf)上的新孔。
[0484]
胰蛋白酶消化
[0485]
向每个孔中加入以下：约10μl的1m tris缓冲液(ph 8.5)、约50μl的50mm tris缓冲液(ph 8.5)和10μl的60mm dtt溶液。将板密封，以约500rpm离心约1分钟，并且在约60℃下在板振荡器上以约900rpm孵育大约60分钟。在用dtt孵育后，允许板的温度冷却到约室温。
[0486]
向每个孔中加入约10μl的200mm碘乙酰胺溶液，并且将板在黑暗下孵育大约30分钟。向每个孔中加入约20μl胰蛋白酶(0.1mg/ml)，并且将板在约60℃下在板振荡器上以约900rpm孵育大约1.5小时。向每个孔中加入约15μl的在水中的10％甲酸。将板涡旋大约3分
钟，并且以约3500rpm离心大约5分钟。
[0487]
分析
[0488]
将来自每个孔的约5μl样品注入液相色谱串联质谱仪(lc-ms/ms)(sciex/api 6500)，该质谱仪安装有waters acquity uplc beh c18柱(50x 2.1mm，1.7微米)，在以下条件下运行*：
[0489]
表6：lc-ms/ms条件
[0490][0491][0492]
*注意：可以调整仪器条件以优化反应。
[0493]
测定每个样品的ncc级分(n＝3)和对照(n＝3)中的相对cp浓度，即特征肽gayplsiepigvr(seq id no:231)的峰面积相对于内标(is)gayplsiepig[(
13
c5,
15
n)val]r(seq id no:232)的峰面积的比率，根据以下方程式：
[0494]
相对cp浓度＝[特征肽的峰面积]/[is的峰面积])
[0495]
通过与对照样品(n＝3)的情况相比评估ncc级分(n＝3)中的平均相对cp浓度测定抗cp抗体的免疫捕获(ic)效率，根据以下方程式：
[0496]
免疫捕获效率(％)＝1
–
([nc中的平均相对cp浓度]/[对照中的平均相对cp浓度])。
[0497]
结果
[0498]
表7概述了抗cp mab、mab混合物和pab的ic效率。如表7所示，在人肝素锂血浆样品(377.3μg/ml)中的不同cp浓度和bsa缓冲液中800μg/ml纯化的(》95％纯度)cp(西格玛奥德里奇(sigma aldrich))下，mab和mab混合物显示出相对一致的免疫捕获效率。然而，从血浆中较低的cp浓度(377.3μg/ml)到较高的cp浓度(800μg/ml)，多克隆抗体的免疫捕获效率显著下降，平均下降了12％，表明单独的以及特别地呈混合物的mab比多克隆抗体更有效地捕获cp。具体而言，在非饱和条件(800μg/ml cp)下，单独使用的每种抗cp mab显示出比多克隆抗cp抗体更高的免疫捕获效率。此外，包括两种抗cp mab的每种抗体混合物显示出比单独使用的抗cp mab更强的免疫捕获效率。最后，具有所有三种抗cp mab的抗体混合物显示出最强的免疫捕获效率。
[0499]
表7.抗cp mab、mab混合物和pab的免疫捕获效率
[0500][0501][0502]
1.mab1对应于mab e，mab2对应于mab c，mab3对应于mab g，mab4对应于无关的抗cp抗体，并且pab对应于来自bethyl实验室公司(蒙哥马利，德克萨斯州)的市售山羊抗人铜蓝蛋白多克隆抗体。
[0503]
2.mab混合物(1,2,3)(每份样品96μg总mab)为mab1(48μg):mab2(24μg):mab3(24μg)＝2:1:1。
[0504]
3.mab混合物(1,2)(每份样品96μg总mab)为mab1(64μg):mab2(32μg)＝2:1。
[0505]
4.mab混合物(1,3)(每份样品96μg总mab)为mab1(64μg):mab3(32μg)＝2:1。
[0506]
实例5：使用cp测定法进行的抗cp单克隆和多克隆抗体的cp耗减比较
[0507]
本实例将抗cp mab混合物(1,2,3)(即，以2:1:1比率存在的mab e、c和g)与来自bethyl实验室公司(蒙哥马利，德克萨斯州)的市售山羊抗人铜蓝蛋白多克隆抗体(pab)进
行比较，如通过测量经由mab混合物(1,2,3)或pab从cp样品免疫捕获cp后ncc级分中剩余的平均cp浓度评估的。使用实例4中描述的cp测定法来进行实验。
[0508]
简而言之，使用包被mab混合物(1,2,3)或pab(批次#1)的珠，对两种浓度的cp样品(即人肝素锂血浆和std8(见表10))的六个重复进行cp的免疫捕获。根据实例4中描述的程序制备包被珠。即，将0.6mg抗体(mab混合物(1,2,3)或pab批次#1)加入磁珠(m-280甲苯磺酰激活磁珠)中并且孵育过夜，使得每个试管中包被珠的最终体积为1.25ml。
[0509]
为了从样品中提取cp，向每个20μl cp样品中加入200μl抗体包被珠。加入到每个cp样品中的抗体(mab混合物(1,2,3)或pab批次#1)总量相同(即每个样品总共96μg抗体)。
[0510]
然后对cp样品进行实例4中描述的cp免疫捕获的剩余步骤，从而分离cp并且生成每个cp样品的ncc级分。然后将ncc级分进行实例4所述cp测定法的剩余步骤：即，is加标、胰蛋白酶消化和使用lc-ms/ms测量cp浓度。
[0511]
如表8所示，在mab混合物(1,2,3)的情况下每个浓度水平下耗减cp的ncc级分中的平均cp浓度比pab批次#1的情况低得多。
[0512]
表8.使用mab混合物(1,2,3)与pab(批次#1)得到的cp耗减
[0513][0514]
std8：cp标准校准品(800μg cp/ml bsa缓冲液)；bql：低于定量限度；na：不适用；sd：标准偏差；cv：变异系数
[0515]
使用包被有mab混合物(1,2,3)或不同批次的pab(批次#2)的珠，在两种浓度(即，低和高qc)的cp样品上进行进一步的免疫捕获实验。根据上述和实例4中的方法制备包被珠。即，通过向珠中加入相同量的关于mab混合物(1,2,3)和pab批次#2(0.6mg)的相应抗体来制备包被珠，并且最终将相同总量的相应抗体(每个样品96μg抗体)加入到每个20μl cp样品中用于免疫捕获。
[0516]
对cp样品进行与上述和实例4中相同的cp免疫捕获步骤，从而分离cp并且生成每个cp样品的ncc级分。然后将ncc级分进行上述和实例4所述cp测定法的剩余步骤：即，is加
标、胰蛋白酶消化和使用lc-ms/ms测量cp浓度。
[0517]
如表9所示，用mab混合物(1,2,3)在每个浓度水平下耗减cp的ncc级分中的平均cp浓度比用pab批次#2低得多。
[0518]
表9.使用mab混合物(1,2,3)与pab(批次#2)得到的cp耗减
[0519][0520]
bql：低于定量限度；alq：超过定量限度；na：不适用；sd：标准偏差；cv：变异系数
[0521]
实例6：生物样品中cp浓度的定量
[0522]
为了鉴定抗cp mab混合物(1,2,3)对人肝素锂血浆中cp的免疫捕获和定量的能力，对实例4中描述的cp测定法的铜蓝蛋白-免疫捕获-洗脱-消化lc-ms/ms方法(测定范围为5-800μg/ml)执行了准确度和精密度运行，在每个20μl样品中使用大约96μg的抗cp mab混合物(1,2,3)对cp进行免疫捕获。
[0523]
使用痕量bsa缓冲液中的cp校准标准品制备lloq(5μg/ml)、低qc(15.0μg/ml)和中qc(250μg/ml)样品，并且通过在具有预先确定的内源性cp浓度的混合人肝素锂血浆基础上加标cp来制备高qc(600μg/ml)样品。
[0524]
简而言之，将约20μl校准标准品或qc样品与约200μl包被珠一起加入，然后进行实例4中披露的cp免疫捕获步骤。然后消化含有捕获的cp的hcl洗脱级分，并且注入lc-ms/ms，用于按照实例4中描述的步骤进行分析。
[0525]
表10所示的校准标准品结果和表11所示的qc样品数据符合预定义的验收标准，证明抗cp mab混合物(1,2,3)可以用于测定肝素锂人血浆中的cp浓度。
[0526]
表10.cp校准标准品的反算浓度
[0527][0528]
表11.铜蓝蛋白的运行内准确度和精密度
[0529][0530][0531]
*值超出可接受的容许范围，并且包括在统计计算中。
[0532]
实例7：人肝素锂血浆和血清中lbc的定量
[0533]
非铜蓝蛋白结合铜(ncc)和不稳定结合铜(lbc)测定法通过分别测量生物样品(例如，血浆或血清)中ncc和lbc的浓度，可用于诊断、治疗和监测铜代谢相关疾病。在2020年9月11日提交的pct专利申请公开号wo 2021/05080和2019年9月12日提交的美国临时专利申请号62/899,498、2019年12月6日提交的62/944,498和2020年1月8日提交的62/958,432中详细描述了这两种测定法，这些专利的内容通过引用并入。ncc测定法的示例性实施例以图形方式显示在图9b(左分图)中。lbc测定法的示例性实施例以图形方式显示在图9b(左分图和右分图组合)中。
[0534]
简而言之，这些测定法需要使用与cp结合的免疫捕获试剂(例如，本文披露的mab或mab混合物，诸如在前述实例中生成和表征的mab)从样品中去除cp的初始步骤。捕获的cp被去除，留下非cp样品。在ncc测定法中，测量ncc样品中的铜浓度。在lbc测定法中，使ncc样品进一步与结合lbc的螯合剂接触，如下文实验所述。去除非lbc级分，留下lbc样品，并且通过电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测量lbc样品中的铜浓度。在一些实施例中，也通过lc-ms/ms测量洗脱的cp样品中的cp浓度，如实例6中所述。
[0535]
lbc测定法
[0536]
来自52名健康个体的人肝素锂血浆和血清的匹配组从bioivt获得。
[0537]
在用本文披露的抗cp mab混合物(1,2,3)替代山羊抗人cp抗体，执行如2020年1月8日提交的美国临时申请号62/958,432(其通过引用以其整体并入本文)的实例10中所述的经验证的lbc生物分析测定方法后，通过icp-ms(agilent 8900)测定血浆和血清样品中lbc的浓度。
[0538]
简而言之，首先通过用抗cp mab混合物(1,2,3)进行免疫捕获来去除cp，以获得ncc级分，随后用edta螯合ncc溶液，然后过滤以收集滤液中不稳定结合形式的铜。
[0539]
更具体地说，将约20μl的每个生物样品与约200μl包被有抗cp mab混合物(1,2,3)的珠(每个样品约96μg总抗cp mab)一起加入孔中，然后进行实例4中披露的免疫捕获步骤，生成每个样品的ncc级分。
[0540]
将每个样品的约200μl的ncc级分转移到干净的无金属试管中，然后将约60μl螯合加标溶液(45.5mm edta(sigma bioultra)和456μm l-组氨酸(sigma bioultra))添加到每个样品中。将这些样品轻轻充分混合，然后在大约37℃下孵育约1小时。任选地，试管可以被离心。
[0541]
将每个孵育的样品转移到2％硝酸洗涤的30k mwco离心过滤器(再生纤维素膜)(密理博公司(millipore)，amiconultra)中，并且在约25℃下以大约14,000x g离心约35分钟。
[0542]
将约200μl的滤液转移到新的干净的无金属塑料试管中，并且将约600μl的在h2o中的0.1％ hno3加入到无金属塑料管中。
[0543]
向上述每个无金属试管中加入约10μl的铑内标加标物(100ng/ml)。然后将每个试管以大约3500rpm离心约1分钟，并且涡旋以充分混合。
[0544]
lbc的定量通过icp-ms(agilent 8900)执行，使用铑作为内标，并在表12和13中概述的条件和参数下操作。使用同心micromist雾化器，喷雾室温度保持在约2℃。分析在he msms气体模式下执行。
[0545]
表12.icp-ms自动进样器及操作条件*
[0546][0547][0548]
*可对条件进行调整，以优化反应并且最大限度地减少携流效应。
[0549]
表13.icp-ms条件**
[0550][0551]
**可以调整仪器条件以优化反应。
[0552]
打开icp-ms系统等离子体，单击“是”执行自动调谐。使用调谐溶液(安捷伦公司(agilent))执行自动调谐和调谐检查。icp-ms系统用预热的默认设置进行平衡。然后进样以进行icp-ms测量。
[0553]
通过icp-ms来分析处理后的样品以及在替代基质(在水中的0.1％硝酸)中制备的两条校准曲线和质量控制(qc)。未进行免疫捕获的标准样品和qc最初在0.1％硝酸中稀释，稀释因子为13.5，以解释免疫捕获过程中出现的样品稀释因子。将每个稀释的标准品或qc样品中的约200μl进一步稀释在600μl的0.1％硝酸中，随后用10μl的铑内标加标物进行加
标。在所有运行中替代基质中的标准曲线和qc符合预定义的验收标准。
[0554]
来自52个健康个体的人血浆和血清中的lbc浓度结果显示在表14中。
[0555]
表14.来自52个健康个体的人肝素锂血浆和血清中的lbc浓度的测定
[0556]
[0557]
[0558][0559]
实例8：稀释剂中铜和生物样品中lbc的定量
[0560]
在本实例中，如通过运行内测量准确度和精密度所评估的，评价了抗cp mab混合物(1,2,3)(即2:1:1比率的抗体e、c和g的混合物)在lbc测定法中的性能。
[0561]
在稀释剂(即，在水中的0.1％硝酸)中制备以下四个qc浓度的铜样品：5ng/ml(qc lloq)、15ng/ml(qc低)、250ng/ml(qc中)和750ng/ml(qc高)。
[0562]
此外，在筛选的人血浆中制备以下四种qc浓度的铜样品：5ng/ml+平均测量背景浓度(qc基质lloq)、15ng/ml+平均测量背景浓度(qc基质低)、250ng/ml(qc基质中)和750mg/ml(qc基质高)。
[0563]
简而言之，使用60μl的mab混合物(1,2,3)来包被磁珠，并且根据实例7中披露的免疫捕获步骤，将这些珠用于免疫捕获人血浆样品(即qc基质样品)中的cp。然后将校准样品和所得的耗减cp的基质样品进行如实例7所述的lbc测定法的剩余步骤。
[0564]
如表15(稀释剂中的铜)和表16(人血浆中的lbc)所示，铜测量的运行内准确度符合稀释剂中预定义的验收标准(即准确度在
±
15％以内(lloq为在
±
20％以内))和人血浆中预定义的验收标准(准确度在
±
20％以内(lloq为在
±
25％以内))。这些结果表明，mab混合物(1,2,3)不会干扰铜测量的准确性和精密度。
[0565]
表15.稀释剂中铜的运行内准确度和精密度
[0566][0567]
*值超出可接受的容许范围，并且在统计计算中排除
[0568]
表16.人血浆中lbc的运行内准确度和精密度
[0569][0570]
*值超出可接受的容许范围，并且在统计计算中排除实例9：mab混合物(1,2,3)的稳定性
[0571]
在本实例中，测定了mab混合物(1,2,3)以及mab混合物(1,2,3)中三种抗体(即抗体e、c和g)的单独每一种的稳定性(保质期)。
[0572]
简而言之，将mab e、c和g以及mab混合物(1,2,3)(即2:1:1比率的抗体e:c:g)(均为在含0.09％叠氮化钠的bbs中10mg/ml)等分到两个小瓶(a&b)中，各自的体积足以进行四等份定性cp结合elisa和分析尺寸排阻色谱法(asec)。小瓶储存在4℃。如实例2所述执行定性cp结合elisa。
[0573]
图10a-10d显示了抗体和mab混合物(1,2,3)在所有测试时间点(即0个月、3个月、6个月和9个月)的cp结合活性的比较。在9个月时，抗体c和g的活性有随时间降低的趋势，但mab混合物(1,2,3)或其最浓缩的组分mab e的cp结合活性没有显著变化。
[0574]
对于mab完整性和均一性的asec测定，将10ul的10mg/ml mab储备液以0.7ml/min在biorad enrich sec650柱上运行，柱体积为24ml。配对的a和b小瓶的色谱图实际上是同一的。表17概述了作为总峰面积的百分比的完整单体mab峰面积数据，并且显示在9个月的过程中，单独mab或mab混合物(1,2,3)样品都没有经历完整性或尺寸均一性的显著变化。此外，如概述了主峰面积(与mab浓度成比例)的表18所示，在9个月的过程中，单个mab或mab混合物(1,2,3)样品都没有经历表观单体mab浓度的显著变化。
[0575]
表17：sec分析-单体峰面积/所有峰面积
[0576][0577]
表18：sec分析-主峰面积
[0578][0579][0580]
总之，mab混合物(1,2,3)的elisa和asec数据没有表明在9个月的过程中cp结合活性、结构完整性/均一性或浓度有任何显著损失。在单个抗体水平上，三种单独mab中有两种的cp结合活性有轻微的时间依赖性降低，但完整性、均一性或浓度没有变化。
[0581]
实例10：铜代谢相关疾病的诊断
[0582]
该实例描述了通过测量患者生物样品(例如，血清或血浆)中的非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜水平并且将其与健康受试者的参考范围进行比较来诊断患有铜代谢相关疾病的患者。
[0583]
可以在未受影响的健康个体中测定非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的参考(阈
值)水平。简而言之，根据本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法，例如，实例7中所述的ncc和/或lbc测定法，抽取健康个体的血液并且进行测试。根据族群、年龄、性别、并存疾病和其他因素评价和细分所得的铜水平。参考水平可以用每个亚群的标准偏差来测定。每个亚组最少评价120人。
[0584]
将根据本文所述的使用抗体或抗体混合物的方法，例如，实例7中所述的ncc和/或lbc测定法，采集出现被认为与铜代谢相关的症状的患者的血液样品并且进行分析。将所得的ncc或lbc值与上述相关健康参考范围相比，用于鉴定那些患有铜代谢相关障碍(诸如威尔逊病)的患者。被鉴定为患有铜代谢相关障碍的患者可以用与治疗特定障碍或疾病相关的治疗剂进行治疗。例如，被诊断为威尔逊病的患者可以用至少一种选自bc-ttm、盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀、锌(或其盐)和/或青霉胺中至少一者的治疗剂进行治疗。
[0585]
表19：序列概述。
[0586]
[0587]
[0588]
[0589]
[0590]
[0591]
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[0594]
[0595]
[0596]
[0597]
[0598]
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[0600]
[0601]
[0602]
[0603]
[0604]
[0605]
[0606]
[0607]
[0608]
[0609]
[0610]
[0611]
[0612]
[0613][0614]
等同物：
[0615]
本领域技术人员将认识到，或者能够使用不超过常规实验来确定本文披露的具体实施例的许多等同物。这样的等同物旨在涵盖在以下权利要求中。

技术特征：
1.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含选自由以下组成的组的重链可变区和轻链可变区对的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列和轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列：(a)分别为seq id no:25和26，(b)分别为seq id no:49和50，以及(c)分别为seq id no:73和74。2.一种与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合的分离的抗体，该抗体包含：(a)分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；(b)分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；或(c)分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列。3.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含与选自由seq id no:25、49和73组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。4.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，其中该轻链可变区包含与选自由seq id no:26、50和74组成的组的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列。5.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少85％同一的氨基酸序列：(a)分别为seq id no:25和26，(b)分别为seq id no:49和50，以及(c)分别为seq id no:73和74。6.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)分别为seq id no:25和26，(b)分别为seq id no:49和50，以及(c)分别为seq id no:73和74。7.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链和轻链，该重链和该轻链包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列：(a)分别为seq id no:27和28，(b)分别为seq id no:51和52，以及(c)分别为seq id no:75和76。8.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且包含重链和轻链，该重链和该轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)分别为seq id no:27和28，(b)分别为seq id no:51和52，以及(c)分别为seq id no:75和76。9.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且与如前述权利要求中任一项所述的抗体竞争与铜蓝蛋白结合。10.一种分离的抗体，其与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合并且结合到与如前述权利要求中任一项所述的抗体相同的人铜蓝蛋白表位。11.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。12.如权利要求1-6和9-11中任一项所述的抗体，其中该抗体选自由igg1、igg2、igg3、igg4、或其变体组成的组。13.如权利要求1-6和9-11中任一项所述的抗体，其中该抗体是兔抗体。14.如权利要求13所述的抗体，其中该抗体是igg抗体。15.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中该抗体与人生物样品中的铜蓝蛋白结合。16.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中该人生物样品是人血浆或人血清。17.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中该血浆是含有肝素锂的人血浆。18.如前述权利要求中任一项所述的抗体，其中该抗体与纯化的人铜蓝蛋白结合。19.一种包含如权利要求1-18中任一项所述的抗体的免疫缀合物，该抗体与药剂连接。20.如权利要求19所述的免疫缀合物，其中该药剂是可检测标记。21.一种核酸，其编码如权利要求1-18中任一项所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。22.一种核酸，其包含选自由seq id no:197-228组成的组的核苷酸序列。23.一种表达载体，其包含如权利要求21所述的核酸或者一个或多个如权利要求22所述的核酸。24.一种细胞，其用如权利要求23所述的表达载体进行了转化。25.一种包含与人铜蓝蛋白(seq id no:1)结合的两种或三种抗体的抗体混合物，其中该两种或三种抗体选自由以下组成的组：(a)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:5、6和7所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:8、9和10所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；(b)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:29、30和31所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:32、33和34所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列；以及(c)包含以下的分离的抗体：分别包含seq id no:53、54和55所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列，以及分别包含seq id no:56、57和58所示氨基酸序列的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3序列。26.如权利要求25所述的抗体混合物，其中该两种或三种抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和该轻链可变区包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)分别为seq id no:25和26，
(b)分别为seq id no:49和50，以及(c)分别为seq id no:73和74。27.如权利要求25或26所述的抗体混合物，其中该两种或三种抗体包含重链和轻链，该重链和该轻链包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)分别为seq id no:27和28，(b)分别为seq id no:51和52，以及(c)分别为seq id no:75和76。28.如权利要求25-27中任一项所述的抗体混合物，其中该抗体混合物包含选自子部分(a)-(c)的两种抗体。29.如权利要求28所述的抗体混合物，其中该抗体混合物包含选自由以下组成的组的两种抗体：子部分(a)和(b)、(a)和(c)、以及(b)和(c)。30.如权利要求28或29所述的抗体混合物，其中该两种抗体以(a):(b)、(a):(c)、(b):(a)、(b):(c)、(c):(a)或(c):(b)比率为2:1存在。31.如权利要求25-30中任一项所述的抗体混合物，其中该抗体混合物包含子部分抗体(a)、(b)和(c)。32.如权利要求31所述的抗体混合物，其中子部分抗体(a),(b)和(c)以(a):(b):(c)、(a):(c):(b)、(b):(a):(c)、(b):(c):(a)、(c):(a):(b)或(c):(b):(a)比率为2:1:1存在。33.如权利要求1-18和25-32中任一项所述的抗体或抗体混合物，其中将该抗体混合物中的一种或多种抗体固定在固体支持物上。34.如权利要求1-18和25-32中任一项所述的抗体或抗体混合物，其中该抗体混合物中的一种或多种抗体被配置为在与铜蓝蛋白复合后固定在固体支持物上。35.如权利要求1-18和25-34中任一项所述的抗体或抗体混合物，其中将该抗体混合物中的一种或多种抗体固定在免疫捕获珠上。36.如权利要求35所述的抗体或抗体混合物，其中该免疫捕获珠是链霉亲和素包被珠、蛋白g珠、蛋白a珠、蛋白a/g珠和甲苯磺酰激活珠。37.如权利要求35或权利要求36所述的抗体或抗体混合物，其中这些珠是磁性免疫捕获珠。38.如权利要求25-37中任一项所述的抗体或抗体混合物，其中将该抗体混合物中的一种或多种抗体不可逆地连接到这些免疫捕获珠上。39.如权利要求33或权利要求34所述的抗体或抗体混合物，其中该固体支持物包括琼脂糖树脂、色谱板、链霉亲和素板和滴定板中至少一者。40.一种用于测量生物样品中铜浓度的试剂盒，其包含如权利要求1-18和25-39中任一项所述的抗体或抗体混合物，以及使用说明书。41.如权利要求40所述的试剂盒，其进一步包含螯合剂。42.一种测量生物样品中非铜蓝蛋白结合铜的浓度的方法，该方法包括：(a)使该生物样品与包含如权利要求1-18和25-39中任一项所述的抗体或抗体混合物的免疫捕获试剂接触，以形成免疫捕获的铜蓝蛋白，(b)去除该免疫捕获的铜蓝蛋白以获得非铜蓝蛋白样品，以及(c)测量该非铜蓝蛋白样品中的铜浓度。
43.如权利要求42所述的方法，其中使用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测量该非铜蓝蛋白样品中的铜浓度。44.一种测量生物样品中不稳定结合铜的浓度的方法，该方法包括：(a)使该生物样品与包含如权利要求1-18和25-39中任一项所述的抗体或抗体混合物的免疫捕获试剂接触，以形成免疫捕获的铜蓝蛋白，(b)去除该免疫捕获的铜蓝蛋白以获得非铜蓝蛋白样品，(c)使该非铜蓝蛋白样品与螯合剂接触，该螯合剂与不稳定结合铜结合，(d)去除非不稳定结合铜以获得不稳定结合铜样品，以及(e)测量该不稳定结合铜样品中的铜浓度。45.如权利要求44所述的方法，其中使用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测量该不稳定结合铜样品中的铜浓度。46.如权利要求45所述的方法，该方法进一步包括在测量该铜浓度之前将内标引入该不稳定结合铜样品中。47.如权利要求46所述的方法，其中该内标包含铜和铑中至少一者。48.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中该螯合剂选自由青霉胺、盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀和edta组成的组。49.如权利要求48所述的方法，其中该螯合剂包括edta。50.如权利要求44-49中任一项所述的方法，其中去除该非不稳定结合铜进一步包括获得非不稳定结合铜样品。51.如权利要求50所述的方法，该方法进一步包括测量该非不稳定结合铜样品中的铜浓度。52.如权利要求50或51中任一项所述的方法，其中该非不稳定结合铜样品包含钼。53.如权利要求52所述的方法，该方法进一步包括测量该非不稳定结合铜样品中的钼浓度。54.如权利要求42-53中任一项所述的方法，其中去除该免疫捕获的铜蓝蛋白进一步包括获得免疫捕获的铜蓝蛋白样品。55.如权利要求54所述的方法，该方法进一步包括测量该免疫捕获的铜蓝蛋白样品中的铜蓝蛋白浓度。56.如权利要求55所述的方法，其中使用质谱法测量该铜蓝蛋白浓度。57.如权利要求56所述的方法，其中该质谱法具有至少约5μg/ml的分析物检测限。58.如权利要求56或57所述的方法，其中该质谱法包括液相色谱质谱法(lc-ms)。59.如权利要求55-58中任一项所述的方法，其中该生物样品中的铜蓝蛋白浓度小于约200μg/ml。60.如权利要求55-59中任一项所述的方法，该方法进一步包括测量该免疫捕获的铜蓝蛋白样品中的铜浓度。61.如权利要求60所述的方法，其中使用电感耦合等离子体质谱法测量该免疫捕获的铜蓝蛋白样品中的铜浓度。62.如权利要求42-61中任一项所述的方法，其中该生物样品是人血浆或人血清。63.如权利要求42-62中任一项所述的方法，其中该生物样品来自患有或疑似患有铜代
谢相关疾病或障碍的患者。64.如权利要求63所述的方法，其中该铜代谢相关疾病或障碍选自由以下组成的组：威尔逊病、铜毒性、铜缺乏、门克斯病和无铜蓝蛋白血症。65.一种鉴定患有铜代谢相关疾病或障碍的患者的方法，该方法包括：根据如权利要求42-64中任一项所述的方法测量来自该患者的生物样品中的非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度；以及相对于阈值浓度，基于该生物样品中非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度，将该患者鉴定为患有该铜代谢相关疾病或障碍。66.一种治疗已根据如权利要求65所述的方法诊断为患有铜代谢相关疾病或障碍的患者的方法，该方法包括向该患者施用有效量的治疗剂以治疗该铜代谢相关疾病或障碍。67.如权利要求66所述的方法，其中该治疗剂选自由以下组成的组：四硫钼酸二胆碱、锌、盐酸曲恩汀、四盐酸曲恩汀和青霉胺。68.如权利要求66所述的方法，其中该治疗剂是四硫钼酸二胆碱。69.一种将受试者鉴定为适合用四硫钼酸二胆碱治疗的方法，该方法包括：根据如权利要求42-64中任一项所述的方法测定来自该受试者的生物样品中的非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度；相对于阈值浓度，基于该生物样品中非铜蓝蛋白结合铜或不稳定结合铜的浓度，将该受试者鉴定为适合用四硫钼酸二胆碱治疗；以及任选地向该被鉴定为适合用四硫钼酸二胆碱治疗的受试者施用有效量的四硫钼酸二胆碱。70.如权利要求68或权利要求69所述的方法，其中四硫钼酸二胆碱的有效量在每天约15mg至约60mg的范围内。71.如权利要求68-70中任一项所述的方法，其中四硫钼酸二胆碱的有效量为每天约15mg。72.如权利要求68或权利要求69所述的方法，其中四硫钼酸二胆碱的有效量为每隔一天约15mg。

技术总结
本文提供了与铜蓝蛋白结合并且可用于包括在生物样品中检测铜蓝蛋白和免疫捕获铜蓝蛋白在内的各种应用的抗体。这些抗体可用于测量生物样品中非铜蓝蛋白结合铜的浓度和不稳定结合铜的浓度的方法中。定结合铜的浓度的方法中。定结合铜的浓度的方法中。


技术研发人员：大卫
受保护的技术使用者：阿雷克森制药公司
技术研发日：2021.09.10
技术公布日：2023/8/16