一种基于多肽水凝胶的海绵贴剂及其制备方法和应用

1.本发明属于敷料技术领域，具体涉及一种基于多肽水凝胶的海绵贴剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.细菌感染是伤口愈合过程中的常见现象，会引发严重的炎症反应，进而延缓愈合，给患者带来负担。抗菌敷料在日常生活中常被用于抗伤口感染治疗。传统抗菌敷料具有低成本易于批量制备等优点。但同时也存在透气性差、组织渗出液吸收能力不足、缺乏促进伤口愈合功能等。近年来，随着材料科学的发展，越来越多的新型敷料被报道，其中基于水凝胶的新型抗菌敷料因具有制备简单、易于功能化等特点而备受关注。抗菌水凝胶通常包含两种主要结构单元，其一是形成水凝胶的骨架基质(例如海藻酸钙、琼脂糖、明胶)，其二是具有抗菌功能的活性基团或添加剂(例如阳离子聚合物、抗生素、纳米抗菌颗粒)。通过在制备过程中添加特殊的活性物质还可以赋予抗菌水凝胶更多的功能，包括促进伤口愈合，止血等。此外，抗菌水凝胶因含有大量水分而呈现出柔软的凝胶状态，使得其对伤口也具有良好的亲和性从而减轻患者的病痛。因为这些优点，近年来，各种各样的抗菌水凝胶被大量报道。毫无疑问，这些研究极大丰富了抗菌敷料的种类，为抗伤口感染提供了更多选择。尽管如此，基于水凝胶的抗菌敷料也存在着不可忽视的缺点，包括透气性差，较高的存储和运输成本等。如何在保留抗菌水凝胶优点的基础上克服其缺点，是构建新型抗菌敷料需要努力的方向。
3.海绵材料是一类质地柔软轻盈的多孔材料。海绵材料轻盈的质地使得其便于运输与存储，它的多孔特性使得其具有良好的透气性及较强的溶液吸附能力。这些特性正是抗菌水凝胶所缺少的。海绵材料制备的关键是材料孔道的形成，常用方法主要包括模板法、发泡法、致孔剂法、相分离法、冻干法等。冻干法是一种以水凝胶为基础制备海绵材料的简易方法。该方法中，水凝胶在低温条件下内部的水凝结成微冰晶从而形成多孔结构，再利用冷冻干燥技术使冰晶升华从而得到多孔海绵。利用冻干法构建基于抗菌水凝胶的抗菌海绵不仅可以保留抗菌水凝胶的功能，同时还具有海绵透气性、溶液吸附能力等优点。显然，基于水凝胶的抗菌海绵是一种理想的抗菌敷料。遗憾的是，目前为止，基于水凝胶抗菌海绵的研究却鲜有报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的问题，本发明提供一种基于多肽水凝胶的海绵贴剂，解决了水凝胶抗菌海绵的匮乏，利用琼脂糖为骨架基质，配合抗菌肽的抗菌活性，形成抗菌水凝胶，经冻干处理得到抗菌海绵贴剂。
5.为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
6.一种基于多肽水凝胶的海绵贴剂，以琼脂糖为骨架基质，以抗菌肽为抗菌活性成分构建成水凝胶，并利用冻干法将水凝胶转变为抗菌海绵。
7.所述海绵贴剂的制备方法，包括：
8.步骤1，在高温水浴条件下，将琼脂糖溶解去离子水中搅拌均匀，得到琼脂糖溶解液，所述琼脂糖溶解液的质量浓度为2％；
9.步骤2，将抗菌肽加入至琼脂糖溶解液中恒温搅拌，得到混合物，然后将混合物冷却处理，得到抗菌肽水凝胶(akf-12h)，所述抗菌肽在混合物中的质量浓度为0-5mg/ml，恒温搅拌的温度为40℃；所述冷却处理的温度为4℃，时间为1h；
10.步骤3，将抗菌水凝胶切片，然后冰冻处理并冻干，得到海绵贴剂(akf-12s)，所述冰冻处理的温度为-80℃，时间为4h。
11.所述抗菌肽为十二烷基肽，且其序列为kklrlkiafkff，简称为kf-12。
12.所述抗菌肽利用基于fmoc保护的固相合成法制备得到。
13.所述抗菌肽的制备方法包括：a1，将200mg 2-氯三苯甲基氯树脂(2-ctc)树脂(负载量:1.082mmol/g)在通入氮气的条件下用无水二氯甲烷(dcm)浸泡1h，随后抽干并交替用4ml dmf/dcm清洗6次，a2，将fmoc保护的第一个氨基酸(8.0eq)溶解在无水dcm中并加入到上述树脂中，然后滴加n,n-二异丙基乙胺(dipea6.0eq)，反应1.5h；a3，将未反应的树脂在甲醇与dcm的1:1混合液中与dipea反应15min，再用dmf洗涤5次；a4，往上述树脂中加入4ml哌啶(20％的dmf溶液)，反应20min，随后用4ml dmf清洗5次；a5，将fmoc受保护的氨基酸(3.0eq)和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu 3.0eq)溶解在4ml无水n’n-二甲基甲酰胺(dmf)中，并加入到上述树脂中，随后加入dipea(6.0eq)，反应2h后用dmf洗涤5次之后；a6，反复a4和a5进行氨基酸逐个偶联，直至得到目标序列的抗菌肽；a7，用2ml tfa/h2o/tps(95∶2.5∶2.5)的混合溶液加入到偶联完成的树脂中，反应40分钟后分离出溶液，并通过旋转蒸发浓缩肽溶液；a8，利用乙醚在冰水中沉淀粗肽，离心并保留，即得到抗菌肽。
14.所述抗菌肽的纯度＞85％。
15.所述海绵贴剂用于伤口愈合领域。进一步的，所述海绵贴剂可作为伤口贴片，用于预防皮肤伤口感染。
16.从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
17.1.本发明解决了水凝胶抗菌海绵的匮乏，利用琼脂糖为骨架基质，配合抗菌肽的抗菌活性，形成抗菌水凝胶，经冻干处理得到抗菌海绵贴剂。
18.2.本发明设计并合成了新型抗菌肽kklrlkiafkff(kf-12)，该抗菌肽在c端具有两个苯丙氨酸，能够使其在水溶液中通过疏水相互作用而形成自组装体。在后续的反应中，自组装效应有利于多肽稳定的掺杂入琼脂糖凝胶中以形成结构稳定的水凝胶海绵。
19.3.本发明制备的海绵贴剂对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出良好的抗菌性能，具有广泛的应用前景。
20.4.本发明制备的海绵贴剂能够有效的预防皮肤伤口感染，具有明显的促进伤口愈合的作用。
附图说明
21.图1是本发明实施例1中的抗菌肽检测情况，包括：(a)kf-12肽的化学结构式:kklrlkiafkff。(b)kf-12肽的hplc图谱。(c)kf-12肽的质谱图。
22.图2是含不同浓度抗菌肽kf-12的肽水凝胶(akf-12h)图像(a)及冻干后得到的相应海绵(akf-12s)的图像(b)。(c)fitc孵育的琼脂糖水凝胶和akf-12h(d)。(e)0.01μm的fitc以及用akf-12h浸泡24h水溶液的荧光发射光谱。(f)琼脂糖海绵和海绵akf-12s的ftir光谱。
23.图3是本发明实施例制备的海绵akf-12s的性能，其中，(a)海绵akf-12s的sem图像。(b)不同抗菌肽浓度的akf-12s随时间变化的吸水量柱状图。(c)不同抗菌肽浓度的海绵akf-12s的孔隙率。(d)akf-12h和akf-12s的机械性能测试。
24.图4是不同抗菌肽含量的海绵akf-12s对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性；其中，(a)大肠杆菌和金黄色葡萄球菌与含有不同浓度抗菌肽的akf-12s孵育3min和30min后进行涂板培养得到的菌落图像。大肠杆菌(b)和金黄色葡萄球菌(c)与含有不同浓度抗菌肽的海绵akf-12s孵育后的细菌存活率。
25.图5 37℃下用不同浓度的kf-12肽与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌孵育18h后进行涂板所得的菌落照片。
26.图6是未处理和与海绵akf-12s孵育的细菌活/死染色荧光图像。
27.图7是本发明实施例制备的海绵贴剂在细胞中的存活率，其中，(a)不同处理方式下小鼠背部大肠杆菌感染伤口随时间变化图像。(ⅰ:未做处理，ⅱ:粘贴普通创可贴，ⅲ:粘贴琼脂糖海绵，ⅳ:粘贴海绵akf-12s)。(b)对治疗10天后获得的小鼠皮肤组织进行h&e染色的组织学成像图片。(从左到右:未做处理、粘贴普通创可贴、粘贴琼脂糖海绵、粘贴海绵akf-12s)。比例尺＝100μm。(c)海绵akf-12s存在时a549细胞的存活率。(d)治疗10天后各组小鼠的相对创面面积(采用image j软件分析测量)。
具体实施方式
28.结合图1至图7，详细说明本发明的一个具体实施例，但不对本发明的权利要求做任何限定。
29.实施例1：
30.一种基于多肽水凝胶的海绵贴剂，包括如下步骤：
31.步骤1，抗菌肽的制备：所述抗菌肽为十二烷基肽，其序列结构为kklrlkiafkff，简称为kf-12，所述抗菌肽的制备方法包括：a1，将200mg 2-氯三苯甲基氯树脂(2-ctc)树脂(负载量:1.082mmol/g)在通入氮气的条件下用无水二氯甲烷(dcm)浸泡1h，随后抽干并交替用4ml dmf/dcm清洗6次，a2，将fmoc保护的第一个氨基酸(8.0eq)溶解在无水dcm中并加入到上述树脂中，然后滴加n,n-二异丙基乙胺(dipea6.0eq)，反应1.5h；a3，将未反应的树脂在甲醇与dcm的1:1混合液中与dipea反应15min，再用dmf洗涤5次；a4，往上述树脂中加入4ml哌啶(20％的dmf溶液)，反应20min，随后用4ml dmf清洗5次；a5，将fmoc受保护的氨基酸(3.0eq)和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu 3.0eq)溶解在4ml无水n’n-二甲基甲酰胺(dmf)中，并加入到上述树脂中，随后加入dipea(6.0eq)，反应2h后用dmf洗涤5次之后；a6，反复a4和a5进行氨基酸逐个偶联，直至得到目标序列的抗菌肽；a7，用2ml tfa/h2o/tps(95∶2.5∶2.5)的混合溶液加入到偶联完成的树脂中，反应40分钟后分离出溶液，并通过旋转蒸发浓缩肽溶液；a8，利用乙醚在冰水中沉淀粗肽，离心并保留，即得到抗菌肽。该抗菌肽的结构如图1a所示，并通过rp-hplc(cst daiso c
18 column，250
×
4.6mm，5μm)
测定，如图1b和图1c所示，所得肽的纯度》85％，使用甲醇(0.1％ tfa)/水(0.1％ tfa)作为流动相，220nm紫外光进行检测；
32.步骤2，将kf-12肽加入至40℃的质量浓度为2％的琼脂糖水溶液中搅拌，获得含不同浓度抗菌肽(0.5,1.25,2,2.5,3.75,5mg/ml)的混合物，并将混合物在4℃下冷却1h，得到不同浓度的抗菌肽水凝胶(akf-12h)；
33.步骤3，将抗菌水凝胶切片，然后在-80℃选冰冻处理4h并冻干，得到海绵贴剂(akf-12s)。
34.如图2a所示，水凝胶akf-12h呈现出无色和半透明的外观。通过冷冻干燥水凝胶获得白色海绵akf-12s(图2b)。fitc标记结果显示，只有肽kf-12掺杂的琼脂糖水凝胶可以被fitc均匀标记(图2c和2d)，表明kf-12在akf-12h中分布均匀，且稳定结合在其中没有游离出来(图2e)。海绵质地柔软且轻，通过ftir对其成分进行了测定。如图2f所示，3400cm-1
处的宽峰归因于-nh2和-oh的拉伸振动，1545cm-1
和1080cm-1
附近的峰归因于苯环的骨架振动和c-o键的拉伸振动，在1675cm-1
处观察到明显的酰胺键吸附带。ftir光谱也清楚地表明了海绵中成功掺杂kf-12肽。通过扫描电镜成像，进一步证实了海绵的多孔结构。如图3a所示，在sem图像中清晰地观察到多孔结构。海绵的孔径为几十微米并且由薄片结构堆积而成。多孔结构有利于抗菌过程中组织液的吸收。随后通过吸水性实验验证了海绵对液体的吸收能力。如图3b所示，所有海绵均表现出较高的吸水能力，akf-12s海绵的吸水能力达到其自身质量的20倍以上且孔隙率大于90％(图3c)。最后，如应力-应变曲线所示(图3d)，当akf-12h水凝胶被压缩至20％应变时，样品被破坏并且具有差的抗压强度。相反，akf-12s海绵可压缩至98％应变而不受损，表现出优异的抗压性能。
35.以上述实施例制备的产品进行检测：
36.1.抗菌活性检测：
37.本发明采用平板计数法研究了不同抗菌肽含量的海绵akf-12s对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。简言之，将细菌溶液滴入海绵中，培养一定时间后，将带有细菌的海绵压碎并稀释。将细菌悬液转移至lb琼脂平板上，37℃孵育12h并对菌落进行计数。通过lb琼脂平板上的菌落形成单位数来评估抗菌效果。如图4所示，对于大肠杆菌来说，海绵akf-12s中抗菌肽浓度的增加导致细菌存活率显著降低。随着孵育时间延长至30min，抗菌肽含量为1.25mg/ml的海绵akf-12s能有效杀灭93％以上的细菌(图4b)，且比3min更显著。令人惊讶的是，当海绵akf-12s中抗菌肽的浓度增加到2mg/ml时，几乎没有细菌存活。在金黄色葡萄球菌中也观察到了类似的现象，在抗菌肽浓度为5mg/ml时，孵育30分钟可杀死近97％的细菌(图4c)。相比之下，对照组的细菌存活率保持稳定。上述结果表明，随着海绵akf-12s中抗菌肽浓度的增加和孵育时间的延长，细菌的存活率显著降低。综上所述，海绵akf-12s对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抗菌活性。
38.此外，kf-12肽的最小抑制浓度(mic)如图5所示。对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的mic值分别为128μg/ml(超过80％的抑制)和64μg/ml。值得注意的是，就kf-12肽来说，对两种菌株的抗菌效果略有不同。抗菌效果的差异可能与两种细菌的细胞壁结构不同有关。金黄色葡萄球菌具有典型的肽聚糖层，相对稳定；然而，大肠杆菌的肽聚糖层较为稀疏，比金黄色葡萄球菌的细胞壁更脆弱。因此，kf-12肽对大肠杆菌具有较强的抗菌作用。
39.2.活死染色实验。
40.通过使用含有syto 9和pi的live/dead baclight
tm
细菌活性试剂盒进行活/死染色，初步探讨了抗菌机制。syto-9是一种能够透过细胞膜的绿色荧光核酸染料，pi对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透并使之红染。如图6所示，未经处理的细菌显示出强烈的绿色荧光，而经海绵akf-12s处理的细菌则显示出强烈的红色荧光，表明海绵akf-12s对细菌膜的显著破坏，细菌膜的破坏可能是海绵活性的原因。
41.3.对皮肤创面感染的抗菌活性评价
42.考虑到伤口应用对敷料安全性的高要求，我们进一步研究了海绵akf-12s对哺乳动物细胞的细胞毒性。采用mtt法测定海绵akf-12s在a549细胞中的存活率。如图7c所示，即使与最高浓度的抗菌肽海绵akf-12s孵育后，细胞存活率仍可保持在80％以上，充分证明了海绵akf-12s具有良好的生物安全性。之后我们构建了小鼠皮肤伤口感染模型，进一步验证抗菌海绵贴片的实用性能。用创面大小和恢复程度评价海绵akf-12s促进创面愈合的能力。如图7a和7d所示，海绵akf-12s组创面面积于第3天降至50％，其余组有部分黄色脓液流出且伴有部分发红。第10天，海绵akf-12s组创面已形成焦痂，愈合速度明显快于其他组(创面闭合率为96.31％)，与体外抗菌结果一致。
43.此外，我们在第10天收集伤口组织，经h&e染色后获得其光学显微镜照片，并分析愈合状态。如图7b所示，海绵akf-12s组的炎症细胞更少，胶原纤维更致密，上皮细胞拉长，说明伤口部分的再上皮化增强，这是愈合过程中极其重要的一部分。然而其他组均有不同程度的炎症和表皮增生现象。上述结果均表明海绵akf-12s具有多功能特性，能够有效抵抗伤口愈合过程中的细菌感染，减少炎症反应，从而促进伤口愈合。
44.可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，该海绵贴剂以琼脂糖为骨架基质，以抗菌肽为抗菌活性成分构建成水凝胶，并利用冻干法将水凝胶转变为抗菌海绵贴剂。2.根据权利要求1所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述海绵贴剂的制备方法，包括：步骤1，在高温水浴条件下，将琼脂糖溶解去离子水中搅拌均匀，得到琼脂糖溶解液；步骤2，将抗菌肽加入至琼脂糖溶解液中恒温搅拌，得到混合物，然后将混合物冷却处理，得到抗菌肽水凝胶(akf-12h)；步骤3，将抗菌水凝胶切片，然后冰冻处理并冻干，得到海绵贴剂(akf-12s)。3.根据权利要求2所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述步骤1中的琼脂糖溶解液的质量浓度为2％。4.根据权利要求2所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述抗菌肽为十二烷基肽，且其序列为kklrlkiafkff。5.根据权利要求4所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述抗菌肽利用基于fmoc保护的固相合成法制备得到。6.根据权利要求2所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述步骤2中的抗菌肽在混合物中的质量浓度为0-5mg/ml，恒温搅拌的温度为40℃。7.根据权利要求2所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述步骤2中的冷却处理的温度为4℃，时间为1h。8.根据权利要求2所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述步骤3中的冰冻处理的温度为-80℃，时间为4h。9.根据权利要求1所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述海绵贴剂用于伤口愈合领域。10.根据权利要求1所述的基于多肽水凝胶的海绵贴剂，其特征在于，所述海绵贴剂可作为伤口贴片，用于预防皮肤伤口感染。

技术总结
本发明属于敷料技术领域，具体涉及一种基于多肽水凝胶的海绵贴剂及其制备方法和应用，该海绵贴剂以琼脂糖为骨架基质，以抗菌肽为抗菌活性成分构建成水凝胶，接着利用冻干法将水凝胶转变为抗菌海绵贴剂。本发明还提供了该海绵贴剂的具体制备方法和应用。本发明制备的海绵贴剂不仅具有质地柔软、透气性好、溶液吸附能力强等优点，还对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出良好的抗菌性能；同时，该材料在有效抗伤口感染的同时还具有促进伤口愈合的功效，具有广泛的应用前景。本发明展示了一种具有抗菌和促进伤口愈合作用的多功能多肽海绵贴片，解决了多功能多肽抗菌海绵的匮乏问题，同时为多肽水凝胶和海绵材料的构建提供了新的思路。的思路。的思路。


技术研发人员：张志军 李兰新 沈永淼 苏淼
受保护的技术使用者：浙江理工大学
技术研发日：2023.06.21
技术公布日：2023/8/16