可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体为可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途。


背景技术：

2.记忆受损是困扰慢性疼痛患者的常见临床问题，据统计，我国慢性疼痛患者超过3亿人，超过三分之二的慢性疼痛患者表现出记忆损伤症状。然而，因记忆损伤与慢性疼痛发病机制不同，传统镇痛药物不能有效治疗记忆损伤，目前临床上对于慢性疼痛所致的记忆损伤仍缺乏有效的治疗手段。因此，探索治疗记忆损伤的新型药物是当前疼痛研究领域亟待解决的重要科学问题。可溶性环氧化物水解酶(solubleepoxidehydrolase,seh)是花生四烯酸代谢的关键酶之一，seh抑制剂或seh基因敲除已被证实对于心血管疾病、糖尿病、炎症等多种疾病具有治疗作用。探索seh抑制剂在慢性疼痛所致记忆损伤中的作用有助于制备记忆受损的临床治疗药物。


技术实现要素：

3.针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，具体为可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备治疗慢性疼痛所致记忆受损的药物中的应用。
4.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，具体为可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备治疗慢性疼痛所致记忆受损的药物中的应用。
5.进一步的，所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够改善慢性疼痛下的情境记忆行为。
6.进一步的，所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够增强海马体的ampa受体(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体，ampar)蛋白质水平。
7.进一步的，所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够缓解慢性坐骨神经压迫性损伤(chronicconstrictiveinjuryofthe sciaticnerve,cci)导致的慢性疼痛。
8.进一步的，所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够增加外周环氧花生四烯酸(eepoxyeicosatrienoicacids，eets)水平。
9.更进一步的，所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂不影响记忆的形成。
10.采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明首次提出可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备治疗慢性疼痛所致记忆受损的药物中的一种新的医药用途，经实验表明，慢性疼痛动物肝脏的可溶性环氧化物水解酶具有活性显著升高，利用可溶性环氧化物水解酶抑制剂能够显著缓解动物疼痛，且可溶性环氧化物水解酶抑制剂不影响动物记忆的形成，可以显著改善慢性疼痛下的情境记忆行为。
附图说明
11.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
12.图1a、图1b、图1c分别为本发明一典型实施方案中慢性疼痛导致可溶性环氧化物水解酶活性升高(seh寡聚体增加、血浆eet水平降低)结果图；
13.图2为本发明一典型实施方案中可溶性环氧化物水解酶抑制剂显著增加血浆eet水平的实验结果图；
14.图3为本发明一典型实施方案中可溶性环氧化物水解酶抑制剂显著缓解慢性疼痛的实验结果图；
15.图4a和图4b为本发明一典型实施方案中可溶性环氧化物水解酶抑制剂对慢性疼痛动物记忆形成和情境记忆行为的影响实验结果图；
16.图5a和图5b为本发明一典型实施方案中可溶性环氧化物水解酶抑制剂对慢性疼痛动物海马体突触蛋白质的影响实验结果图。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
19.实施例
20.一、实验步骤
21.1.实验动物与实验设计：
22.c57bl/6j小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并于徐州医科大学繁殖。小鼠饲养于温度为23
±
2℃，湿度为40
±
10％的标准动物房，12h/12h(8:00照明)昼夜节律，自由饮食。本实验经徐州医科大学动物伦理委员会审批，并严格按照国家卫生研究院的实验室动物护理和使用指南执行。
23.2.试剂：
24.可溶性环氧化物水解酶抑制剂购自美国cayman chemical公司。
25.3.抗体：
26.seh抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；其他抗体购自美国cell signaling technology公司；辣根过氧化物酶标二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。
27.4.慢性神经病理性疼痛模型构建：
28.采用小鼠单侧坐骨神经压迫性损伤(chronic constrictive injury ofthe sciatic nerve,cci)模型。小鼠麻醉、消毒并切开左侧股骨上段皮肤，钝性剥离肌肉，暴露股骨中段下方坐骨神经。用3根无菌、不可吸收的4-0丝线以适当力度结扎坐骨神经，结扎间隔约1.0mm。回纳坐骨神经，缝合伤口并消毒，待小鼠完全清醒后放回原饲养笼内。对照组不进行坐骨神经结扎，其余步骤相同。
29.5.条件性恐惧记忆实验：
30.提前一个小时把动物放到实验房间或附近适应环境，条件性恐惧训练(环境a)：将小鼠置于实验箱中自由探索3分钟，呈现30秒的纯音刺激(cs，3.7khz，80db)，在纯音刺激的最后1秒，给予小鼠单次电击(us，0.65ma，1s)，共进行四次配对刺激训练，间隔80秒；最后一次配对刺激后，让小鼠在实验箱内自由活动2分钟。恐惧环境检测(环境a)：将小鼠置于实验箱中自由探索3分钟。
31.6.血浆eets测定：
32.小鼠血浆样品加入等体积的内标液，低温充分震荡，使蛋白充分变性，将样品放入-80℃冰箱沉淀蛋白1.5小时，离心吸取上清液，并通过滤膜过滤。应用超高效液相色谱串联质谱法(uplc-ms/ms)进行检测，检测结果使用tracefinder 3.3sp1软件进行处理与分析。
33.7.western blot分析：
34.取对应小鼠组织于裂解液中，经超声破碎后以12000g离心15min并取上清液用于western blot分析。使用上海碧云天公司产bca试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品上样后经sds-page电泳并转移至pvdf膜上。随后用5％脱脂牛奶封闭1h后孵育一抗(1:1000)4℃过夜。次日，洗膜后室温孵育二抗(1:5000)1h,最后使用uvitecaliance q9仪器自动曝光，并在image j软件中进行条带信号的分析。
35.8.数据分析：
36.所有数值采用均数(mean)
±
标准误(sem)表示。两组间比较使用双边两独立样本t检验，三组间比较采用单因素方差分析并并采用lsd法进行两两比较。p《0.05认为差异有统计学意义。
37.二、实验结果
38.1.慢性疼痛导致可溶性环氧化物水解酶活性升高
39.可溶性环氧化物水解酶(seh)的寡聚体水平(oligomer)水平及环氧花生四烯酸(eet)水平是衡量seh酶活性的重要指标。肝脏是seh表达最高的组织，图1a和图1b结果表明，相比于假手术组(sham)，慢性疼痛组(cci)小鼠肝脏seh的单体(monomer)水平无显著差异，而oligomer水平显著增加；eet包括四种同分异构体(5,6-eet、8,9-eet、11,12-eet、14,15-eet)，其中14,15-eet与seh的亲和力最高，图1c结果表明，慢性疼痛组(cci)小鼠血浆14,15-eet水平显著低于假手术组(sham)。以上结果说明慢性疼痛会增强seh酶活性。
40.2.抑制剂对可溶性环氧化物水解酶酶活性的影响
41.为了评估抑制剂对可溶性环氧化物水解酶(seh)酶活性的影响，我们采用了一种常用的抑制剂(tppu)，腹腔注射seh的抑制剂tppu后，相比于对照组(control)，tppu组小鼠血浆eet水平显著升高，说明seh的抑制剂能够抑制seh的酶活性，可溶性环氧化物水解酶抑制剂显著增加血浆eet水平的实验结果图具体可以参照图2。
42.3.可溶性环氧化物水解酶抑制剂对慢性疼痛的影响
43.疼痛缩足阈值是检测小鼠疼痛行为的重要手段，为检测可溶性环氧化物水解酶抑制剂对慢性疼痛的影响，我们检测了慢性疼痛小鼠在注射溶剂和注射抑制剂后小鼠的疼痛缩足阈值，图3结果表明：注射抑制剂组小鼠(cci+tppu)疼痛缩足阈值显著高于注射溶剂组(cci+vehicle)小鼠，说明可溶性环氧化物水解酶抑制剂能够显著降低慢性疼痛。
44.4.可溶性环氧化物水解酶抑制剂对慢性疼痛所致记忆受损的影响
45.在经历条件性恐惧实验训练后，小鼠在相同情境下的僵直时间是评价小鼠记忆水平的重要指标。我们对假手术组(sham)小鼠、慢性疼痛注射溶剂组(cci+vehicle)小鼠、慢性疼痛注射抑制剂组(cci+tppu)小鼠进行了条件性恐惧实验，图4a结果显示，条件性恐惧实验训练后各组小鼠僵直时间无显著差异，说明慢性疼痛及可溶性环氧化物水解酶抑制剂不影响小鼠学习能力；图4b情境记忆检测结果显示，慢性疼痛注射溶剂组(cci+vehicle)小鼠僵直时间显著低于假手术组(sham)小鼠，慢性疼痛注射抑制剂组(cci+tppu)小鼠僵直时间显著高于慢性疼痛注射溶剂组(cci+vehicle)，而与假手术组(sham)小鼠无显著差异。说明慢性疼痛会造成小鼠情境记忆显著受损，而可溶性环氧化物水解酶抑制剂能够显著逆转这种记忆损伤。
46.5.可溶性环氧化物水解酶抑制剂对慢性疼痛所致记忆受损小鼠突触蛋白的影响
47.大脑海马体是调控记忆的重要中枢，海马体内神经元的突触蛋白质表达水平的改变会显著影响记忆水平。据此，我们对各组小鼠海马体突触蛋白质表达水平进行检测，图5a和图5b的western blot结果显示，与假手术组(sham)小鼠相比，慢性疼痛组(cci+vehicle)小鼠nmda(n-甲基-d-天门冬氨酸)受体亚型2a(glun2a)和2b(glun2b)、ampa(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸)受体亚型a1(glua1)、钙调素依赖性蛋白激酶2α(camkⅱα)和β(camkⅱβ)表达水平无显著差异，ampa受体亚型a2(glua2)表达水平显著降低；慢性疼痛注射抑制剂(cci+tppu组)能够显著提高ampa受体亚型a1(glua1)和a2(glua2)表达水平。说明可溶性环氧化物水解酶抑制剂可能是通过提高突触的ampa受体蛋白质水平发挥治疗记忆受损的作用。
48.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。
49.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，其特征在于：具体为可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备治疗慢性疼痛所致记忆受损的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，其特征在于：所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够改善慢性疼痛下的情境记忆行为。3.根据权利要求2所述的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，其特征在于：所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够增强海马体的ampa受体蛋白质水平，所述海马体的ampa受体为α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体。4.根据权利要求3所述的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，其特征在于：所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够缓解慢性坐骨神经压迫性损伤导致的慢性疼痛。5.根据权利要求2所述的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，其特征在于：所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂至少能够增加外周环氧花生四烯酸水平。6.根据权利要求5所述的可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，其特征在于：所述可溶性环氧化物水解酶抑制剂不影响记忆的形成。

技术总结
本发明公开了可溶性环氧化物水解酶抑制剂的新用途，具体为可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备治疗慢性疼痛所致记忆受损的药物中的应用。本发明涉及生物医药技术领域，本发明首次提出可溶性环氧化物水解酶抑制剂在制备治疗慢性疼痛所致记忆受损的药物中的应用，经实验表明，利用可溶性环氧化物水解酶抑制剂能够显著缓解动物疼痛，且可溶性环氧化物水解酶抑制剂不影响动物记忆的形成，可以显著改善慢性疼痛下的情境记忆行为。性疼痛下的情境记忆行为。性疼痛下的情境记忆行为。


技术研发人员：吴周 张红星 曹君利 张锦 余雨媚
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/16