一种含山奈酚的ROS响应型脂质体及其制备方法和应用

一种含山奈酚的ros响应型脂质体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及医药领域，具体涉及一种含山奈酚的ros响应型脂质体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.山奈酚（kaempferol，ka）是一种存在于丹参根等植物中的水溶性酚酸类化合物，是天然的强抗氧化剂，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗凝血、降血压等作用，山奈酚能抑制活性氧（reactive oxygen species，ros）并增强免疫，可用于治疗具有氧化应激和炎性反应病理特征的疾病，特别是用于治疗急性胰腺炎（acutepancreatitis，ap）和重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，sap）。然而，山奈酚缺少易电离的水溶性基团，较难溶于水，代谢吸收快，作用范围不集中，药效用量大，存在副作用增强的风险等特性，使其临床应用受到限制。因此，如何开发中药效应物质山奈酚成分并提高生物利用度，是山奈酚应用于临床亟需解决的问题。
3.近年来，纳米结构脂质载体被广泛应用于包载中药效应物质成分，因其粒径小、稳定性高、包封率高、毒性小等特点，可增加活性成分靶向性、稳定性和生物利用度。该载药系统主要涉及酮缩硫醇键（thioketal，tk）、单硒键、二硒键等特殊结构，响应于炎性伴随ros刺激而促进化学键断裂后破坏系统而释放药物，实现靶向释药并提高药物生物利用度。因此，鉴于胰腺组织炎性损伤ros大量堆积的特性，设计一款装载山奈酚的ros响应型脂质体给药系统，利于稳定山奈酚药效发挥和提高其生物利用率，可提高山奈酚应用于ap/sap的治疗潜力。
4.现目前，大部分研究均是在脂质体内部直接包载山奈酚，由于山奈酚自身存在代谢快、作用范围不集中等特点，脂质体内部的山奈酚在进行释放的过程中，脂质体很可能出现山奈酚释放不均或过早释放的问题，导致山奈酚在体内的效果不稳定或无效，浪费大量的山奈酚。
5.为了增强山奈酚的疗效，目前也有不少研究选择全氟溴辛烷（perfluorooctyl bromide，pfob）作为运载剂，将其与山奈酚一起包覆于脂质体内部，以提高山奈酚的疗效，并提高其在体内的稳定性和生物利用度。然而，pfob具有毒性，山奈酚药效和pfob毒性之间的平衡，也是一个难题，山奈酚和pfob之间的结合，pfob长时间存在，可能导致氟离子积累和毒性反应，不利于人体健康。
6.另外，为了提高山奈酚的疗效，同时避免pfob在人体的毒性作用，目前也有研究在pfob外部包裹一层材料，其作用类似于“保护神”，可以作为pfob的载体防止其毒性散发至人体。然而，包裹pfob的材料在实际应用中仍存在很多不足，包裹材料会影响药物的稳定性和疗效；一些包裹pfob的纳米粒子也具有毒性，需要进行毒性评估和优化；制备包裹pfob的材料需要一些特殊的技术，批量生产的难度大，制备成本也高。
7.综上，现目前对于既能提升山奈酚药效，同时也能降低pfob毒性的研究，其效果不佳且难度大，这些问题需要进一步的研究和解决，以实现山奈酚稳定释药，并减少其用量，
提升生物利用率。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题在于提供一种靶向载药脂质体，以解决现有技术中对于山奈酚药效发挥不佳以及如何降低pfob毒性的问题，实现山奈酚稳定释药，提升其生物利用率。
9.本发明提供的基础方案为：一种含山奈酚的ros响应型脂质体，所述脂质体是dtp脂质体，所述dtp脂质体是以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为脂质体外壳主体的内外双层，以酮缩硫醇键位于脂质体外壳之间 ，所述dtp脂质体内部包载药物为peg-pfob-peg-ka结合体，即为dtp@pppk脂质体。peg和dspe分别是聚乙二醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的英文缩写；所述dtp是dspe-tk-peg的简称缩写；所述dtp@pppk 脂质体是dspe-tk-peg@peg-pfob-peg-ka脂质体的简称缩写。
10.现目前，为了提升山奈酚药效，常规手段均是在脂质体内部直接包载山奈酚，由于各种因素如温度会影响脂质体的稳定性和保护效果，大部分研究倾向于脂质体本身结构稳定性的提升，从而增强对包载药物的保护效果，以实现稳定释药。另外一部分研究对于提升山奈酚药效多为前面所述的选择pfob作为运载剂，将其与山奈酚一起包覆于脂质体内部，虽然有助于山奈酚药效的提升，但pfob可能会在人体产生毒性反应；目前也有研究在pfob外部包裹一层材料，作为pfob的载体防止其毒性散发至人体，然而，包裹pfob的材料在实际应用中仍存在很多难题尚难以攻克。
11.基于对山奈酚药效的提升，大部分研究基本是前面几种所述的研究方向，极少有人考虑过将修饰后已降低毒性的pfob与修饰后进一步提升水溶性的山奈酚进行结合，并将其结合体包裹于脂质体内部，然而，本发明却开辟了这种新思路。pfob作为一种人工氧气载体，利用peg的亲水性包裹pfob对其进行修饰，可以帮助提高pfob的生物相容性、疏水性和药代动力学，从而减少pfob毒性。经peg修饰过的pfob，其毒性已经降低，同时也能够提升山奈酚的药效，因此对于本领域技术人员，一般会直接将peg修饰过的pfob与山奈酚进行结合。然而，本发明不仅用peg对pfob进行修饰，同时还利用peg对山奈酚分子也进行修饰，能够进一步提高山奈酚的水溶性和生物利用度。最后再将peg-pfob与peg-ka结合起来，形成peg-pfob-peg-ka结合体，可以充分发挥其药效并提升安全性。
12.在peg-pfob-peg-ka结合体中，pfob作为一种重要的氧输送剂，它分子内部含有大量的氧原子，可以在体内释放氧分子，帮助维持细胞的正常运作。同时，pfob的氧分子可以与山奈酚进行相互作用，增加山奈酚的稳定性。具体来说，pfob中的氧分子可以与山奈酚中的羟基基团发生氢键作用，避免其分子间的氢键断裂，从而使山奈酚分子的结构更加稳定。此外，pfob还可以起到一定的溶剂作用，有助于山奈酚在体内的分散和吸收。
13.此外，dspe生物相容性好，相较于普通的脂质体peg修饰可提升脂质体的亲水性和稳定性，延长山奈酚血液循环时间，促使其有充足的时间到达病灶而提升疗效。tk响应于ros刺激而促进化学键断裂后破坏系统而释放山奈酚，实现靶向释药且提高生物利用度，进一步克服山奈酚代谢快、作用范围不集中、生物利用率低等缺点。另外，纳米脂质体较微泡更小，可到达微泡难以到达的微血管和组织间隙，能够减少药用量。
14.通过本方案所得到的dtp@pppk脂质体，通过实验数据与现有技术相比，本发明的
dtp@pppk脂质体具有规则的形态且尺寸较小，粒径均一，分散性好，具有良好的稳定性。此外，本发明的dtp@pppk脂质体释药率好；干预胰腺组织病理损伤程度评分佳；抑制血清脂肪酶和血清淀粉酶的水平更佳。
15.优选的，所述结合体中含有fe3o4纳米颗粒。本技术中，可以通过peg的修饰降低pfob的毒性，此外，另一种降低pfob毒性的途径为降低pfob的使用量，pfob的使用量减少，其毒性也就自然降低。然而，pfob的使用量减少，其作为氧气载体的作用会受到限制。因此，本发明在peg-pfob-peg-ka结合体中添加fe3o4纳米颗粒，以提高pfob的氧气载体作用。fe3o4加入到peg-pfob-peg-ka结合体中，可以减小pfob分子之间的间距，从而进一步促进氧气的释放、提高pfob的氧运输能力，因此在实际应用中能够减少pfob的用量，进一步降低其对人体的毒性。
16.本发明还提供了含山奈酚的ros响应型脂质体制备方法，包括下述步骤：步骤一：peg-pfob-peg-ka结合体的制备（1） 将pfob和带有羟基的peg在酸催化下进行酯化反应，制得peg修饰的pfob分子即peg-pfob，并对其进行充分的纯化处理；（2）将山奈酚与peg进行酯化反应，制得peg-ka，并对其进行充分的纯化处理；（3）将peg-pfob和peg-ka进行混合，加入催化剂、缓冲剂，再进行亲核加成反应，最后通过纯化和干燥得到peg-pfob-peg-ka结合体；步骤二：包载peg-pfob-peg-ka结合体的脂质体制备（1）将dppc、胆固醇、dspe-tk-peg2000和peg-pfob-peg-ka放至烧瓶，再加入溶剂使其溶解；（2）在50℃条件下，进行旋蒸直至形成脂质薄膜；（3）加入缓冲液溶解薄膜，再进行离心取沉淀，用缓冲液重悬，即可制得dtp@ppp脂质体。
17.优选的，步骤一（3）中所述的亲核加成反应催化剂为n,n'-二甲基乙二胺。n,n'-二甲基乙二胺（n,n-dimethylethylenediamine，dmeda）在反应中可以作为稳定剂，帮助保持反应物的活性，并且可以加速反应速率，提高反应效率，同时也可以降低反应的温度和副反应的产生。此外，n,n'-二甲基乙二胺还具有较好的溶剂能力，可用于溶解多种有机物质，从而促进反应进行。因此，在peg-pfob-peg-ka结合体的制备中，选择n,n'-二甲基乙二胺作为催化剂，有助于提高反应的产率和效率，可以在较短的时间内得到纯净的产物。
18.优选的，所述催化剂n,n'-二甲基乙二胺所添加的质量为反应物的5%-10%，对山奈酚的药效影响最小，并且可以提升山奈酚的产率。
19.优选的，步骤一（3）中所述的缓冲剂为na3po4。
20.优选的，所述步骤一（3）中的反应时长为5-8小时。
21.优选的，步骤一（3）中所述反应温度介于40-60℃之间。在反应过程中，过高的反应温度会引起山奈酚结构变化、分解和失活，进而影响peg-pfob-peg-ka结合体的质量和药效。反之，过低的反应温度则会导致反应速率过慢、反应不完全等情况，也不利于产品的制备。因此，在制备peg-pfob-peg-ka结合体过程中，反应温度介于40-60℃之间，可以得到具有良好药效的产品。
22.本发明所述的任一一种含山奈酚的ros响应型脂质体，涉及具有氧化应激和炎性
反应病理特征疾病的应用。
23.本发明所述的任一一种含山奈酚的ros响应型脂质体，具体涉及在急性胰腺炎和重症急性胰腺炎的应用。
附图说明
24.图1为本发明dspe-tk-peg载体材料的核磁氢谱鉴定图。
25.图2为本发明的透射电镜代表图，其中（a）为dtp@pppk的透射电镜代表图，（b）为含fe3o4的dtp@pppk的透射电镜代表图。
26.图3为本发明各脂质体平均粒径统计图。
27.图4为本发明各脂质体电位图。
28.图5为本发明dtp@pppk脂质体7天粒径大小和电位变化图。
29.图6为本发明含有fe3o4的dtp@pppk脂质体7天粒径大小和电位变化图。
30.图7为本发明响应于ros的dtp@pppk的释药率。
31.图8为本发明各脂质体响应于100 μm h2o2的释药率。
32.图9为本发明各脂质体的细胞实验-体外安全性考察统计细胞活力图。
33.图10为本发明各脂质体的动物实验-体内安全性考察各组织病理损伤代表图。
34.图11为本发明各脂质体对胰腺组织病理的影响示意图。
35.图12为本发明各脂质体对胰腺组织病理损伤的程度评分。
36.图13为本发明各脂质体抑制血清脂肪酶水平。
37.图14为本发明各脂质体抑制血清淀粉酶水平。
具体实施方式
38.下面通过具体实施方式进一步详细的说明：实施例1、包载peg-pfob-peg-ka结合体的脂质体（dtp@pppk）制备方法，包括下述步骤：步骤一：peg-pfob-peg-ka结合体的制备（1）取60μl pfob和3ml peg放入反应瓶中；加入0.5%催化剂对甲苯磺酸，在85℃ 下反应3-4小时；将反应后得到的peg-pfob分子进行分离和纯化，得到纯净的peg-pfob。
39.（2）在反应瓶中加入10mg山奈酚和1g活性化合物二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide，dcc）；溶解50ml peg和催化剂在另一个溶剂中，将其加入反应瓶中与前一步反应混合；随后对反应溶液进行搅拌和反应，反应时间为4-6小时；过滤、洗涤并进行纯化，最终得到peg-ka结合物。
40.（3）在一个干燥、惰性气体保护下的反应瓶中，加入0.3ml peg-pfob（此处peg-pfob的量还可为0.1ml、0.5ml、0.7ml，本发明仅展示出peg-pfob代表性用量为0.3ml的情况）和15mg peg-ka（此处peg-ka的量还可为5mg、10mg、20mg，本发明仅展示出peg-ka代表性用量为15mg的情况）以及10ml n,n'-二甲基乙二胺，使其混合均匀；在混合物中慢慢加入na3po4（ph6.5、0.05mol/l），并用磁力搅拌导入气体，直至获得均一混合物。在温度为50℃的条件下，反应5-8小时，直至反应完成；得到产物后，对其进行纯化，去除未反应的原料、催化剂、缓冲剂和其他残留物，得到纯净的peg-pfob-peg-ka结合体；最后进行干燥，得到固体产
物。
41.步骤二：包载peg-pfob-peg-ka脂质体的制备（1）精密称取6mg二棕榈酰磷脂酰胆碱（1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidy1-choline，dppc）、2mg胆固醇、2mg dspe-tk-peg2000和1mg peg-pfob-peg-ka（根据步骤一中peg-pfob和peg-ka用量的不同，所得到的peg-pfob-peg-ka结合体一共有16种，用1-16依次对其进行编号，此处所采用的peg-pfob-peg-ka结合体为具有代表性的7号peg-pfob-peg-ka，即peg-pfob用量为0.3ml、peg-ka用量为15mg的情况），移至圆底烧瓶中，加入10 ml 三氯甲烷使其充分溶解；（2）通过旋转蒸发仪以转速80 rpm和50℃条件下，旋蒸1h，直至氯仿挥发后形成脂质薄膜；（3）加入2 ml 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered solution，pbs）缓冲液，使用摇床震荡1h充分溶解薄膜；（4）将上述溶液倒入离心管，并将其置于离心机中，以8000 rpm离心3次，每次5 min，进行离心；取沉淀，用1 ml pbs缓冲液重悬，即可制得dtp@pppk脂质体。
42.实施例2、实施例2与实施例1的不同之处在于：将实施例1步骤一中的第（2）小步骤替换为如下的新操作步骤：（2）在反应瓶中加入10mg山奈酚和1g活性化合物 dcc；取50 ml peg，将其和催化剂溶解在另一溶剂中，再加入10mg fe3o4（此处fe3o4的量还可为5mg、15mg、20mg、25mg，本发明仅展示出fe3o4代表性用量为10mg的情况）磁性纳米颗粒进行反应，然后将其加入反应瓶中与前一步反应混合；随后对反应溶液进行搅拌和反应，反应时间为5-8小时；过滤、洗涤并进行纯化，最终得到含有fe3o4的peg-ka结合物。同时，将步骤一（1）中pfob的量由60 μl替换为40 μl；将步骤一（3）中的peg-ka替换为含有fe3o4的peg-ka结合物。此外，将步骤二（1）中的peg-pfob-peg-ka结合体替换为含有fe3o4的peg-pfob-peg-ka结合体（此处所采用的含有fe3o4的peg-pfob-peg-ka结合体，其fe3o4的用量为10mg），其余操作步骤均与实施例1相同，按照此制备方法，可制得含有fe3o4的dtp@pppk脂质体。
43.对比例1、ka药物，购自medchemexpress（mce）公司。
44.对比例2、对比例2与实施例1的不同之处在于：省去实施例1步骤一的全部制备步骤，将步骤二（1）中的药物peg-pfob-peg-ka替换为ka即可，其余操作步骤均与实施例1相同，按照此制备方法，可制得dspe-tk-peg@ ka，即dtp@k脂质体。
45.对比例3、对比例3与实施例1的不同之处在于：省去实施例1步骤一的全部制备步骤，将步骤二（1）中的药物peg-pfob-peg-ka替换为ka，同时在实施例1步骤二（3）与（4）之间增加以下步骤：（4）转移至15ml离心管中，加入60μl pfob，声振仪于冰浴和功率为100w的条件下，声振5 min，频率为开5s关5s；。其余操作步骤均与实施例1相同，按照此制备方法，可制得dspe-tk-peg@pfob-ka，即dtp@pk脂质体。
46.对比例4、对比例4与实施例1的不同之处在于：省去实施例1步骤一中的（2）与（3）这两个小步骤，将步骤二（1）中的药物peg-pfob-peg-ka替换为ka，同时在实施例1步骤二（3）与（4）之间增加以下步骤：（4）转移至15ml离心管中，加入200μl peg-pfob，声振仪于冰浴和功率为100w的条件下，声振5 min，频率为开5s关5s。其余操作步骤均与实施例1相同，按照此制备方法，可制得dspe-tk-peg@peg-pfob-ka，即dtp@ppk脂质体。
47.dtp@pppk脂质体的包封率与载药量、理化性质研究及其药效评价和应用
一、dtp@pppk脂质体的包封率与载药量包封率和载药量考察：取2 ml三氯甲烷破坏脂质体，离心，取上清液，通过紫外分光光度仪检测含量并计算包封率和载药量。计算公式为：包封率（%）=（包载入脂质体内的ka质量/投入的ka质量）
×
100%载药量（%）=（包载入脂质体内的ka质量/脂质体总质量）
×
100%测定结果如表1所示，由表可知，实施例一的dtp@pppk和实施例二含fe3o4的dtp@pppk脂质体的包封率和载药量明显高于对比例二的dtp@k、对比例三的dtp@pk、对比例四的dtp@ppk脂质体，且实施例二含fe3o4的dtp@pppk的包封率和载药量略优于实施例一的dtp@pppk脂质体。
48.表1所制备各脂质体的包封率及载药量（n=3）药物组包封率（%）载药量（%）对比例二（dtp@k）82.31
±
2.174.15对比例三（dtp@pk）83.46
±
2.134.51对比例四（dtp@ppk）84.98
±
1.235.78实施例一（dtp@pppk）85.34
±
3.316.09实施例二（含fe3o4的dtp@pppk）85.47
±
2.816.11二、dtp@pppk脂质体的理化性质研究对前面所述的实施例1-2、对比例1-4进行相应的理化性质研究。
49.如图1所示，核磁结果显示在~2.8 ppm处可观察到tk键的峰值，peg的特征性峰值出现在~4 ppm，并在~1.5和~3ppm 处可观察到 dspe的峰。以上结果证实我们成功合成了dspe-tk-peg。
50.（1）各脂质体的形态表征用pbs溶液将10μl dtp@pppk和含有fe3o4的dtp@pppk脂质体稀释100倍后，取适量于透射电镜下观测纳米药物的形态和体积。由图2（a）、图2（b）可知，实施例一的dtp@pppk脂质体和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk脂质体均具有规则的圆形形态，其尺寸大小较为均一，具备良好的材料体系。施例一的dtp@pppk纳米脂质体和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk纳米脂质体尺寸小，可到达人体的微血管和组织间隙，能够减少药用量。
51.（2） 各脂质体的粒径和电位分析脂质体的粒径和zeta电位分析是dtp@pppk脂质体表征的重要指标之一，本次实验通过马尔文粒径仪测量样品组的粒径大小和zeta电位，所有样品均为稀释10倍后进行检测。不同样品的粒径和zeta电位电位结果如图3和图4所示，实施例一的dtp@pppk脂质体粒径为203.3
±
4.63 nm，zeta电位为-22.71
±
1.76 mv，实施例二含有fe3o4的dtp@pppk脂质体的粒径为215.3
ꢀ±
4.09nm，zeta电位为-23.52
±
0.80 mv，证实本实验所制备实施例一的dtp@pppk及实施例二含有fe3o4的dtp@pppk脂质体粒径均一，分散性好，稳定性较强。同时，从zeta电位可以看出，各脂质体电位相差不大，较为均一，均符合要求。
52.（3）dtp@pppk脂质体的稳定性连续7天用光学显微镜观测实施例一的dtp@pppk及实施例二含有fe3o4的dtp@pppk脂质体的粒径大小和电位变化，如图5和图6所示，7天内未发现dtp@pppk脂质体及含有fe3o4的dtp@pppk脂质体的粒径和zeta电位有明显变化，说明实施例一的dtp@pppk脂质体与实施
例二含有fe3o4的dtp@pppk脂质体具有良好的稳定性。
53.（4）响应于ros的dtp@pppk的释药率考察向样品组中分别加入不同浓度的h2o2溶液，处理24h后，通过高效液相色谱法检测溶液中的药物浓度。如图7所示，随着h2o2刺激浓度的增高，dtp@pppk的释药率呈浓度梯度增加，表明其响应于ros刺激而释药增加。如图8所示，发现实施例一的dtp@pppk脂质体与实施例二含有fe3o4的dtp@pppk的释药率高于对比例二的dtp@k、对比例三的dtp@pk、对比例四的dtp@ppk脂质体，且实施例二含有fe3o4的dtp@pppk的释药率高于实施例一的dtp@pppk。
54.三、dtp@pppk脂质体的药效评价及应用对前面所述的实施例1、对比例1-4进行相应的动物实验。
55.一）、动物实验的具体操作步骤如下：步骤一：小鼠模型的构建方法以1%戊巴比妥钠（1μl/g）进行腹腔注射麻醉小鼠，于小鼠腹部正中切口入腹，轻轻地将十二指肠牵出开口，置于生理盐水浸润的无菌纱布上，充分暴露胰胆管和十二指肠乳头；使用动脉血管夹把肝脏组织的下方总胆管部位夹紧闭合，小型手术牵引针穿透十二指肠边缘，便于平铺组织，将1 ml 注射器针头穿透十二指肠后，用24 g留置针的软管顺着十二指肠乳头处插入到胰胆管中，将3.5%牛磺胆酸钠生理盐水通过微量注射泵以0.1 ml/min匀速缓慢注入，直至剂量达到0.1 ml/100 g，去除动脉夹和牵引针后，双层关腹。采用同样方法和同剂量生理盐水注射处理对照组小鼠，其余处理均与模型组相同。
56.步骤二：血清的收集与检测自牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射24 h后，呼入co2麻醉小鼠，快速开腹，摘取心脏快速剪碎，用1 ml注射器充分吸取血液于1.5 ml ep管，室温静置30 min，3000 rpm 离心10min，取上清，3500 rpm再次离心5 min。收集上清，于-20 ℃短期保存，-80 ℃环境长期保存。
57.将收集到的小鼠血液，于 3500 rpm，室温条件下，离心10 min，通过使用罗氏的全自动生化分析仪测量小鼠血清中脂肪酶和淀粉酶含量；用于初步评价胰腺炎模型的程度。
58.步骤三：胰腺组织的收集与检测快速离体切取胰腺组织，各自分为两部分，一部分组织置于10％中性甲醛缓冲液中，于脱色摇床上室温固定24-36 h，脱水，石蜡包埋，切片后进行苏木素-伊红(he)染色。另一部分组织于生理盐水中漂洗两次后，滤纸吸水，置于冻存管中，放在液氮中进行保存，以便后期实验使用，一般可用于elisa、western blot等检测实验。
59.步骤四：药物干预（1）成功构建sap小鼠模型前1h，通过腹腔注射实施例一的dtp@pppk药物（25或50 mg/kg），24h后，收集血清和胰腺组织；（2）成功构建sap小鼠模型前1h，通过腹腔注射实施例二含有fe3o4的dtp@pppk药物（25或50 mg/kg），24h后，收集血清和胰腺组织；（3）成功构建sap小鼠模型前1h，通过腹腔注射对比例一的ka药物（25或50 mg/kg），24h后，收集血清和胰腺组织；（4）成功构建sap小鼠模型前1h，通过腹腔注射对比例二的dtp@k药物（25或50 mg/kg），24h后，收集血清和胰腺组织；
（5）成功构建sap小鼠模型前1h，通过腹腔注射对比例三的dtp@pk药物（25或50 mg/kg），24h后，收集血清和胰腺组织；（6）成功构建sap小鼠模型前1h，通过腹腔注射对比例四的dtp@ppk药物（25或50 mg/kg），24h后，收集血清和胰腺组织。
60.统计方法应用spss 24.0统计软件进行统计，实验数据均以均值
ꢀ±ꢀ
标准误差（
ꢀ±ꢀ
s.e.m）表示，组间差异比较用anova/dunnet’s检验，p《0.05为有统计学意义。
61.二）、dtp@pppk脂质体的药效评价及应用（1）毒性评价如图9所示，脂质体干预腺泡细胞不同时间段后，其细胞存活率并未随着时间延长而产生变化，各时间段药物干预后的细胞存活率统计无差异，说明脂质体不会对腺泡细胞产生细胞内毒性，且实施例一的dtp@pppk和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk安全性较佳。
62.dtp@pppk对细胞安全性较佳，进一步检测dtp@pppk对小鼠肝、脾、肾、肺组织的影响。用脂质体干预健康雄性小鼠，于不同时间点取小鼠各组织器官进行he染色观察其病理学变化，如图10所示，发现小鼠肝、脾、肺、肾组织并未出现病理学变化，说明脂质体不会对小鼠产生病理影响，因此证实dtp@pppk具有良好的体内安全性。
63.（2）胰腺组织病理的改善效果如图11可知，sap表现为小鼠胰腺组织中大量的炎性细胞浸润区域说明炎性反应被激活和胰腺小叶间隙增大而出现水肿；甚至是损伤严重的区域出现坏死的情况，表现为腺泡细胞形态异常、细胞边界模糊、细胞之间混乱。根据进一步的考察发现，对比例一的ka、对比例二的dtp@k、对比例三的dtp@pk、对比例四的dtp@ppk、实施例一的dtp@pppk和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk均可在不同程度上改善上述病理表现，而且肉眼可见dtp@pppk干预后胰腺组织中出现的炎性浸润、水肿和坏死情况最少。因此，脂质体对胰腺组织的干预作用，相比于对比例一的ka、对比例二的dtp@k、对比例三的dtp@pk、对比例四的dtp@ppk的干预效果，实施例一的dtp@pppk脂质体和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk改善效果最好，可应用于急性胰腺炎（ap）和重症急性胰腺炎（sap）。
64.（3）胰腺组织病理损伤程度评分根据上述图11的组织图，进行评分指数统计分析，如图12所示，对对比例一的ka、对比例二的dtp@k、对比例三的dtp@pk、对比例四的dtp@ppk、实施例一的dtp@pppk和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk干预胰腺组织病理损伤的程度进行评分，发现实施例一的dtp@pppk脂质体和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk较ka、dtp@k、dtp@pk、dtp@ppk改善胰腺病理损伤效果更佳，且实施例二含有fe3o4的dtp@pppk改善胰腺病理损伤效果优于实施例一的dtp@pppk。
65.（4）dtp@pppk抑制血清脂肪酶水平临床sap的表现之一是血清脂肪酶明显增高。如图13所示，含ka的药物均抑制血清脂肪酶升高，考察dtp@pppk、含有fe3o4的dtp@pppk、ka、dtp@k、dtp@pk和dtp@ppk抑制血清脂肪酶的水平，发现实施例一的dtp@pppk和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk较对比例一的ka、对比例二的dtp@k、对比例三的dtp@pk、对比例四的dtp@ppk效果更佳。
66.（5）dtp@pppk抑制血清淀粉酶水平临床sap的另一表现是血清淀粉酶明显增高。如图14所示，含ka的药物均抑制血清
淀粉酶升高，考察考察dtp@pppk、含有fe3o4的dtp@pppk、ka、dtp@k、dtp@pk和dtp@ppk抑制血清淀粉酶的水平，发现实施例一的dtp@pppk和实施例二含有fe3o4的dtp@pppk较对比例一的ka、对比例二的dtp@k、对比例三的dtp@pk、对比例四的dtp@ppk效果更佳，且实施例二含有fe3o4的dtp@pppk抑制血清淀粉酶的水平优于实施例一的dtp@pppk。
67.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种含山奈酚的ros响应型脂质体，其特征在于：所述脂质体是dtp脂质体，所述dtp脂质体是以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为脂质体外壳主体的内外双层，酮缩硫醇键位于脂质体外壳的双层结构之间，所述dtp脂质体内部包载药物为peg-pfob-peg-ka结合体，即为dtp@pppk脂质体。2.如权利要求1所述的含山奈酚的ros响应型脂质体，其特征在于：所述结合体中含有fe3o4纳米颗粒。3.权利要求1所述含山奈酚的ros响应型脂质体制备方法，包括下述步骤：步骤一：peg-pfob-peg-ka结合体的制备（1） 将pfob和带有羟基的peg在酸催化下进行酯化反应，制得peg修饰的pfob分子即peg-pfob，并对其进行充分的纯化处理；（2）将山奈酚与peg进行酯化反应，制得peg-ka，并对其进行充分的纯化处理；（3）将peg-pfob和peg-ka进行混合，加入催化剂、缓冲剂，再进行亲核加成反应，最后通过纯化和干燥得到peg-pfob-peg-ka结合体；步骤二：包载peg-pfob-peg-ka结合体的脂质体制备（1）将dppc、胆固醇、dspe-tk-peg2000和peg-pfob-peg-ka放至烧瓶，再加入溶剂使其溶解；（2）在50℃条件下，进行旋蒸直至形成脂质薄膜；（3）加入缓冲液溶解薄膜，再进行离心取沉淀，用缓冲液重悬，即可制得dtp@pppk脂质体。4.如权利要求3所述的含山奈酚的ros响应型脂质体制备方法，其特征在于：步骤一（3）中所述的亲核加成反应催化剂为n,n'-二甲基乙二胺。5.如权利要求4所述的含山奈酚的ros响应型脂质体制备方法，其特征在于：所述催化剂n,n'-二甲基乙二胺所添加的质量为反应物的5%-10%。6.如权利要求3所述的含山奈酚的ros响应型脂质体制备方法，其特征在于：步骤一（3）中所述的缓冲剂为na3po4。7.如权利要求3所述的含山奈酚的ros响应型脂质体制备方法，其特征在于：所述步骤一（3）中的反应时长为5-8小时。8.如权利要求3所述的含山奈酚的ros响应型脂质体制备方法，其特征在于：步骤一（3）中所述反应温度介于40-60℃之间。9.权利要求1-2任一所述的一种含山奈酚的ros响应型脂质体，涉及具有氧化应激和炎性反应病理特征疾病的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用具体涉及在急性胰腺炎和重症急性胰腺炎的应用。

技术总结
本发明涉及医药领域，具体涉及一种含山奈酚的ROS响应型脂质体及其制备方法和应用，以解决现有技术中对于山奈酚药效发挥不佳以及如何降低PFOB毒性的问题，实现山奈酚稳定释药，提升其生物利用率。所述脂质体是一种含山奈酚的ROS响应型脂质体，所述脂质体是DTP脂质体，所述DTP脂质体是以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为脂质体外壳主体的内外双层，以酮缩硫醇键位于脂质体外壳之间，所述DTP脂质体内部包载药物为PEG-PFOB-PEG-KA结合体，即为DTP@PPPK脂质体，DTP@PPPK脂质体能够充分发挥其药效并提升安全性。其药效并提升安全性。其药效并提升安全性。


技术研发人员：文娥 王志刚 冯易 陈青秋 程洪峰 罗朋 方明晓
受保护的技术使用者：重庆医科大学附属第二医院
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/16