一组多肽TSM1突变体及其应用

一组多肽tsm1突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一组多肽tsm1突变体及其应用。


背景技术：

2.补体系统是机体固有免疫防御的重要组成部分，包括一系列不耐热、经活化后具有酶活性的补体蛋白，以及其对应补体受体和调节蛋白质[1]，同时也是机体固有免疫和适应性免疫的桥梁[2]。补体活化过程及其活化所形成的产物可介导细胞溶破、调理吞噬、炎症反应、清除免疫复合物等一系列重要的生物学效应。补体系统是高度复杂的生物反应系统。生理情况下，血浆中补体成分多以无活性的酶前体形式存在，但在受到某些内源性或外源性物质激活后，通过不同途径的级联酶促反应激活补体系统。这些途径分为经典途径[3]、旁路途经[4]、凝集素途径[5]，以及近年发现的备解素途径[6]、蛋白酶解途径[7]。
[0003]
某些情况下，补体过度消耗或激活被认为是免疫介导性和炎症性疾病的主要致病因素，不仅可使大量补体无益消耗，导致机体抗感染能力下降，而且会使机体发生剧烈炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，从而造成正常组织细胞损伤，导致全身炎症反应综合征、脓毒症，自身免疫系统疾病、年龄相关黄斑水肿、肾脏疾病和移植排斥等多种疾病[8-12]。
[0004]
无论是补体系统，还是凝血系统或纤溶系统，其活化都依赖于一系列丝氨酸蛋白酶的酶解级联反应，因此活性多肽丝氨酸蛋白酶抑制剂具有潜在的抗补体和抗凝等活性。我们前期已从寄生绦虫中筛选出具有抗凝和抗补体双活性的kunitz多肽tsm1(专利号zl201810463151.9)。
[0005]
据此，本技术以多肽tsm1为模板，根据组成蛋白质的20个氨基酸分类和性质差异，分子设计10个多肽tsm1衍生物，并开展其制备和抗凝抗补体功能评价研究。
[0006]
参考文献
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技术实现要素：

[0020]
本发明首先涉及一组tsm1多肽的突变体，所述的突变体以tsm1多肽为模板，对其序列中的y20残基进行氨基酸替换，具体的突变体为：y20s、y20k、y20d、y20g、y20h、y20l、y20m、y20n、y20w和y20v，
[0021]
所述的tsm1多肽的氨基酸序列为：
[0022]
kmsyinrcnlpissgqcrgyflrygydseadecrrfvysgcrgnrnnfftynecmnrcymrfk。
[0023]
本发明还涉及编码所述的tsm1多肽的突变体的核苷酸序列。
[0024]
本发明还涉及所述的tsm1多肽的突变体的如下用途，
[0025]
(1)制备抗凝血的药物；
[0026]
(2)制备抗补体的药物。
[0027]
优选的，所述的抗凝血药物为抑制内源性凝血的药物，所述的内源性凝血途径指，延长部分活化凝血酶原时间(aptt)。
[0028]
优选的，所述的抗补体药物为，抑制补体c1q、c2、c3、c4、c5和/或c6的药物。
[0029]
优选的，所述的抗补体药物用于预防和/或治疗由于补体过度激活导致的脓毒症。
[0030]
本发明的有益效果在于，在之前工作的基础上，对tms1多肽进行了突变筛选，获得了生物学活性更强的突变体。
附图说明
[0031]
图1、多肽tsm1突变体的sds-page鉴定，
[0032]
1a、泳道1为蛋白marker、泳道2为tsm1、泳道3为tsm1y20s、泳道4为tsm1y20、泳道5为tsm1y20d、泳道6为tsm1y20g、泳道7为tsm1y20h；
[0033]
1b、泳道1为蛋白marker、泳道2为tsm1、泳道3为tsm1y20l、泳道4为tsm1y20m、泳道5为tsm1y20n、泳道6为tsm1y20w、泳道7为tsm1y20v。
[0034]
图2、多肽tsm1突变体的抗凝功能评价，
[0035]
2a、2b、2c分别为多肽的aptt、pt、tt检测，x轴表示多肽的终浓度。y轴表示多肽组与阴性对照组(pbs组)aptt、pt、tt时间的比值。
[0036]
图3、多肽tsm1突变体的抗补体功能评价，x轴表示终浓度为10μm的不同多肽。y轴表示多肽对补体的抑制率，阴性对照为gvb缓冲液，阳性对照为超纯水。
[0037]
图4、多肽tsm1突变体的抗补体浓度依耐性评价，x轴表示不同浓度的多肽，多肽浓度为0、2.5μm、5μm、7.5μm、10μm、15μm、20μm；y轴表示多肽对补体的抑制率。
[0038]
图5、抗补体多肽tsm1y20g的抗补体机制
[0039]
5a为tsm1y20g与补体孵育后回补缺失血清后致敏绵羊红细胞溶血率；
[0040]
5b为tsm1y20g对不同补体靶点的抑制率。
[0041]
图6、多肽tsm1y20g对lps诱导小鼠重度脓毒症的生存曲线，
[0042]
x轴为观察时间，y轴为小鼠生存率。
具体实施方式
[0043]
实施例1、多肽tsm1突变体的分子设计和制备
[0044]
具体的，以tsm1多肽为模板，针对其序列中的y20残基，进行氨基酸替换，共设计了tsm1y20s、tsm1y20k、tsm1y20d、tsm1y20g、tsm1y20h、tsm1y20l、tsm1y20m、tsm1y20n、tsm1y20w和tsm1y20v共10个突变体。
[0045]
tsm1多肽的氨基酸序列为：
[0046]
kmsyinrcnlpissgqcrgyflrygydseadecrrfvysgcrgnrnnfftynecmnrcymrfk
[0047]
制备含有目的序列的重组质粒，将其转入de3得到表达菌，采用tsm1多肽类似的方式制备。一般地，转化成功的菌液在含3％kana lb液体培养基中活化，扩大培养后加入iptg(终浓度1mm)诱导，继续培养4h。诱导好的菌液离心弃上清，沉淀用冰pbs重悬，利用超声破壁后离心弃上清，沉淀用冰pbst洗涤两次再次离心，沉淀用0.03g/ml还原型谷胱甘肽变性液重悬，室温变性2h。高速离心后上清在含0.012g/ml氧化型谷胱甘肽复性液中16℃缓慢复性。将复性液用超滤管浓缩脱盐，用rp-hplc分析纯化，纯化后的蛋白液用真空冷冻冻干机冻成干粉，并做质量检定(sds-page凝胶电泳见图1)和分装。
[0048]
实施例2、多肽tsm1突变体的抗凝血功能
[0049]
(一)多肽的抗凝功能评价
[0050]
多肽的aptt功能检测：
[0051]
1、打开tsa9000c凝血仪，预热适量的aptt试剂和cacl2试剂；
[0052]
2、1mlep管中依次加入25μl不同浓度的多肽,阴性对照(ddh2o)和阳性对照(肝素的终浓度为2.14μg/ml)，50μl健康人血浆，室温孵育15分钟，孵育期间输入样品信息和aptt检测项目；
[0053]
3、将ep管放入仪器上样位，检测中仪器自动加入50μl aptt试剂和50μl cacl2试剂；
[0054]
4、将数据导入excel表格，用作图软件prism作图。
[0055]
多肽的pt功能检测：
[0056]
1、打开tsa9000c凝血仪，预热适量的pt试剂；
[0057]
2、1mlep管中依次加入25μl不同浓度的多肽,阴性对照(ddh2o)和阳性对照(肝素的终浓度为2.14μg/ml)，50μl健康人血浆，室温孵育15分钟，孵育期间输入样品信息和pt检测项目；
[0058]
3、将ep管放入仪器上样位，检测中仪器自动加入100μl aptt试剂；
[0059]
4、将数据导入excel表格，用作图软件prism作图。
[0060]
多肽的tt功能检测：
[0061]
1、打开tsa9000c凝血仪，预热适量的tt试剂；
[0062]
2、1mlep管中依次加入25μl不同浓度的多肽，阴性对照(ddh2o)和阳性对照(肝素的终浓度为2.14μg/ml)，100μl健康人血浆，室温孵育15分钟，孵育期间输入样品信息和pt检测项目；
[0063]
3、将ep管放入仪器上样位，检测中仪器自动加入100μl aptt试剂；
[0064]
4、将数据导入excel表格，用作图软件prism作图。
[0065]
结果显示(图2)，tsm1的突变体对内源性凝血途径有抑制作用，其延长aptt时间倍数与野生型tsm1相比较变化不大，对外源性凝血途径(pt)和共同凝血途径均无抑制作用。
[0066]
实施例3、多肽的抗补体功能评价
[0067]
本实验利用兔抗羊血清作为溶血素将绵羊红细胞致敏，致敏绵羊红细胞在ca2+、mg2+的条件下能激活补体经典途径，从而使绵羊红细胞发生溶血，溶血程度与补体含量成正比例关系。
[0068]
(一)补体效价的测定
[0069]
1、采集10名健康志愿者的血清(nhs)作为补体，混匀后分装，-80℃冰箱保存。
[0070]
2、500μl绵羊红细胞悬液与1ml冰gvb缓冲液混匀后于4℃、1000rpm离心10分钟，弃上清，洗涤三次。吸取红细胞沉淀20μl加入980μl冰gvb缓冲液制成2％绵羊红细胞。
[0071]
3、致敏绵羊红细胞(ea)的制备：兔抗羊血清作为溶血素用gvb缓冲液稀释为1:1000，与等体积的2％绵羊红细胞(srbc)在37℃水浴30分钟，则srbc致敏完成。
[0072]
4、将补体(nhs)用gvb按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640倍比稀释，按下表1加入各成分，置于37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟，取每管上清200μl于96孔板中，405nm处测吸光度。超纯水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。
[0073]
表1、补体效价测定所加各成分体积(μl)
[0074][0075]
以补体稀释倍数为x轴，各稀释倍数的补体造成的溶血率为y轴，作图。选择能使致敏绵羊红细胞接近全溶的最低补体浓度(本实验为1:20的稀释血清)作为确保体系所需的临界补体浓度。
[0076]
(二)多肽经典途径抗补体活性测定
[0077]
1、取临界浓度的nhs与10μm多肽等体积混匀，37℃水浴10分钟，
[0078]
2、按下表2加入ea、gvb，37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟，取每管上清200μl于96孔板，405nm处测吸光度。
[0079]
3、以多肽作为x轴，溶血抑制率作为y轴作图。实验同时设置补体组、全溶组、gvb组。
[0080]
表2、经典途径抗补体溶血实验所加各成分的体积(μl)
[0081][0082]
多肽的补体抑制率＝(a405补体组－a405多肽组)/(a405补体组－a405 gvb组)
×
100％
[0083]
4、取临界浓度的nhs与0μm、2.5μm、5μm、7.5μm、10μm、15μm、20μm多肽等体积混匀，37℃水浴10分钟，加入ea、gvb，37℃水浴30分钟后，4℃，5000rpm离心10分钟；
[0084]
5、取每管上清200μl于96孔板，405nm处测吸光度。
[0085]
6、以多肽作为x轴，溶血抑制率作为y轴作图。
[0086]
实验同时设置补体组、全溶组、gvb组。
[0087]
结果如图3所示，tsm1突变体的抗补体活性与野生型tsm1相比较，均得到提高(图5)，
[0088]
(三)不同浓度多肽对补体的抑制作用检测
[0089]
选用终浓度为10μm时，补体抑制率达到85％以上的多肽，进行了不同浓度多肽对补体的抑制作用检测，结果显示，
[0090]
(1)多肽组均呈浓度依赖性的抑制补体活性(图4)，各个多肽抑制补体的ic50值分别为：
[0091]
多肽tsm1y20s、2.693+0.050μm
[0092]
tsm1y20sk、2.028+0.065μm
[0093]
tsm1y20sg、1.710+0.580μm
[0094]
tsm1y20h、2.913+0.181μm
[0095]
tsm1y20sl、6.023+0.444μm
[0096]
tsm1y20sm、4.885+0.9798μm。
[0097]
可以看出tsm1y20g抗补体活性较tsm1增强较明显。
[0098]
实施例4、多肽tsm1y20g突变体的抗补体机制研究
[0099]
(一)缺失补体c1q、c3、c4成分血清的制备
[0100]
1、将购买的抗补体c1q、c3、c4成分抗血清稀释为不同浓度与等体积1:20nhs混合孵育15分钟，离心后取上清，进行溶血实验。
[0101]
2、实验结果得出，抗补体c1q、c3和c4成分抗血清分别在稀释比例为1:152、1:64和1:32时，致敏绵羊红细胞溶血抑制率接近100％，作为抑制1:20nhs里的补体c1q、c3、c4成分的临界浓度。
[0102]
因此，将稀释比例为1:152、1:64和1:32的抗补体c1q、c3和c4成分抗血清与1:20nhs混合孵育，离心后取上清，得到c1 q、c3、c4成分缺失血清。缺失补体成分c2、c5、c6、c7、c8人血清是购买的成品，用gvb稀释40倍使用。
[0103]
(二)补体缺失实验
[0104]
tsm1y20g的浓度为15μm时，达到补体最大抑制率。因此，选用15μm的tsm1y20g进行补体缺失实验。
[0105]
1、15μm的tsm1y20g与1:20nhs孵育10min后，不补组回补gvb缓冲液，缺失组回补缺失c1q、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8成分血清；
[0106]
2、不缺组回补1:20nhs若tsm1y20g作用于缺失的补体成分，则不出现溶血现象，反之，则出现溶血现象。
[0107]
gvb缓冲液作为阴性对照，多肽组与阴性对照组差别越大，说明tsm1y20g对补体成分抑制作用越强。结果可得出：tsm1y20g对c1q、c2、c3、c4、c5和c6有抑制作用(图5)。
[0108]
实施例5、多肽tsm1y20g突变体对lps诱导小鼠重度脓毒症的保护作用
[0109]
1、c57bl/6小鼠腹腔注射20mg/kg的lps，小鼠明显竖毛，眼角分泌物增多，大便变稀，腹部明显的肿胀，警觉性明显下降，对周围环境无反应，基本无走动，根据singer,m.[13]判断标准，腹腔注射20mg/kg的lps可诱导小鼠重度脓毒症。
[0110]
2、模型构建成功后，选用抗补体活性明显增强的tsm1y20g评价多肽对小鼠的保护作用，首先进行小鼠生存率分析，实验分为三个组，每组12只小鼠，分为对照组(saline组)、模型组(saline+lps)、治疗组(lps+tsm1y20g)，
[0111]
模型组注射lps前1h腹腔注射saline；
[0112]
治疗组在注射lps(20mg/kg)前1h时，提前腹腔注射tsm1y20g(40mg/kg)；
[0113]
对照组不注射lps，只腹腔注射等量的saline。
[0114]
观察7天，治疗组小鼠存活率为100％，模型组小鼠两天内全部死亡。说明多肽tsm1y20g对小鼠的脓毒症具有保护作用(图6)。
[0115]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

技术特征：
1.一组tsm1多肽的突变体，所述的突变体以tsm1多肽为模板，对其序列中的y20残基进行氨基酸替换获得，优选的，所述替换为：y20s、y20k、y20d、y20g、y20h、y20l、y20m、y20n、y20w、y20v；所述的tsm1多肽的氨基酸序列为：kmsyinrcnlpissgqcrgyflrygydseadecrrfvysgcrgnrnnfftynecmnrcymrfk。2.编码权利要求1所述的tsm1多肽的突变体的核苷酸序列。3.权利要求1所述的突变体或权利要求2所述的核苷酸片段的如下应用，(1)制备抗凝血的药物；和/或(2)制备抗补体的药物。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗凝血药物为抑制内源性凝血的药物，所述的内源性凝血途径指，延长部分活化凝血酶原时间(aptt)。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗补体药物为，抑制补体c1q、c2、c3、c4、c5和/或c6的药物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗补体药物用于预防和/或治疗由于补体过度激活导致的脓毒症。

技术总结
本发明涉及一组多肽TSM1突变体及其应用，所述的突变体以TSM1多肽为模板，对其序列中的Y20残基进行氨基酸替换。本发明还涉及所述的突变体的制药应用，所述的药物为(1)制备抗凝血的药物；和/或(2)制备抗补体的药物。和/或(2)制备抗补体的药物。和/或(2)制备抗补体的药物。


技术研发人员：陈宗运 罗旭东 叶祥东 丁莉 朱雯 孙芳 覃陈虎
受保护的技术使用者：湖北医药学院
技术研发日：2023.05.26
技术公布日：2023/8/16