SmD3-b在调控植物干旱和盐胁迫抗性中的应用

smd3-b在调控植物干旱和盐胁迫抗性中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及smd3-b在调控植物干旱和盐胁迫抗性中的应用。


背景技术：

2.葡萄经济效益高，在我国农业生产和经济发展中占有十分重要的地位。我国新疆和宁夏等地区葡萄种植面积大，但是这些地区水资源匮乏，许多葡萄园没有良好的灌溉条件，缺水影响了葡萄的生长发育和产量。另外，土壤盐渍化极大地限制了葡萄的生长和发育，导致减产减收。因此，挖掘葡萄耐旱和耐盐基因，对创制耐旱和耐盐葡萄新品种，推动葡萄产业可持续发展具有重要意义。
3.了解植物如何感知和应对胁迫，对于通过合理的育种和基因工程策略提高植物的抗性至关重要。大多数关于植物胁迫调控基因表达的研究集中在转录水平的基因表达调控；相比之下，胁迫诱导的转录后水平的基因表达调控知之甚少。前体mrna的剪接是大多数真核生物mrna转录和翻译之间的重要步骤，由剪接体完成。剪接体由核糖核蛋白小体(small nuclear ribonucleoprotein，snrnp)和及数百个非snrnp蛋白质动态组成，识别rna前体的剪接位点并催化剪接反应。已有研究表明一些剪接体成分参与了对各种非生物胁迫的响应，超表达某些剪接体或其他剪接因子可以增加植物对胁迫的耐受性。因此，调控这些剪接体成分的表达是增加植物对干旱和盐胁迫的适应能力的有效途径。
4.snrnp由一个或两个小核核糖核酸(small nuclear rna，snrna)，sm或like-sm(sm/lsm)核心蛋白以及若干snrnp相关蛋白组成。sm蛋白是高度保守的rna结合蛋白家族，包括b/b
′
、d1、d2、d3、e、f和g。已有研究表明拟南芥smd3-b突变后导致多效性表型包括延迟开花，根系生长减少，叶脉部分缺陷，毛状体分支数量异常以及花器官数量改变(knock-out mutations of arabidopsis smd3-b induce pleotropic phenotypes through altered transcript splicing，doi:10.1016/j.plantsci.2011.01.011.epub 2011jan 28.)。截止目前，smd3-b在植物中是否具有抗旱功能尚未有研究。另外由于同基因家族的基因在不同物种中的功能并非完全一致，对于来自葡萄的smd3-b是否调控植物盐胁迫抗性也尚不清楚。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供来自于葡萄的smd3-b在调控植物干旱和盐胁迫抗性中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供葡萄smd3-b基因在如下(1)-(2)任一项中的应用：
8.(1)提高植物的耐旱和耐盐能力；
9.(2)培育耐旱和耐盐能力提高的植物品种。
10.进一步的，所述葡萄smd3-b基因为如下i)或ii)所示的核酸分子：
11.i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；
12.ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。
13.本发明的第二方面，提供葡萄smd3-b基因编码的蛋白在如下(1)-(2)任一项中的应用：
14.(1)提高植物的耐旱和耐盐能力；
15.(2)制备提高植物的耐旱和耐盐能力的产品。
16.进一步的，所述葡萄smd3-b基因编码的蛋白为如下(a1)或(a2)所示的蛋白质：
17.(a1)由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
18.(a2)在(a1)中所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
19.本发明的第三方面，提供含有葡萄smd3-b基因的表达盒、重组表达载体或重组菌在如下(1)-(2)任一项中的应用：
20.(1)提高植物的耐旱和耐盐能力；
21.(2)培育耐旱和耐盐能力提高的植物品种。
22.本发明的第四方面，提供一种提高植物对干旱和盐胁迫耐受性的方法，包括以下步骤：
23.将葡萄smd3-b基因转入目的植物中；
24.或者上调植物基因组中葡萄smd3-b基因或其同源基因的表达；
25.所述葡萄smd3-b基因为如下i)或ii)所示的核酸分子：
26.i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；
27.ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。
28.本发明的第五方面，提供一种培育耐旱和耐盐性提高的转基因植株的方法，包括以下步骤：
29.将葡萄smd3-b基因转入野生型目的植物中，获得耐旱和耐盐性优于野生型的植株；
30.所述葡萄smd3-b基因为如下i)或ii)所示的核酸分子：
31.i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；
32.ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。
33.进一步的，葡萄smd3-b基因通过phb-gfp表达载体转入到目的植物中。
34.进一步的，所述目的植物为葡萄或烟草。
35.本发明的有益效果：
36.针对目前植物剪接体蛋白耐旱和耐盐功能研究薄弱的现状，本发明从葡萄中克隆了一个sm蛋白基因，即smd3-b。通过转基因实验证实smd3-b参与耐旱和耐盐性，扩展了我们对植物抗性产生的认知，为获得高抗性植株提供理论依据，具有很大的应用价值。
附图说明
37.图1为本发明的葡萄smd3-b基因在模拟干旱胁迫(甘露醇)和盐胁迫(氯化钠)后的表达情况。
38.图2为转葡萄smd3-b基因对烟草在干旱和盐胁迫下生长情况；图中，#1和#2分别表示超表达smd3-b后的两个转基因烟草株系。
具体实施方式
39.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
40.如前所述，胁迫反应是植物研究中的一个重要方向。某些剪接体蛋白基因在非生物、生物胁迫和不同的生长发育阶段均会发生差异表达现象。干旱和盐胁迫对葡萄生长发育影响巨大，是葡萄产业健康发展的主要限制因素之一。但是，关于干旱和盐胁迫如何影响植物中剪接体蛋白基因的表达模式知之甚少，以及剪接体蛋白基因是否在植物干旱和盐胁迫响应中发挥作用仍然缺乏转基因证据支持。
41.有鉴于此，本发明对来源于葡萄的smd3-b基因开展了克隆及功能的研究。本发明首先从葡萄中克隆了葡萄smd3-b基因；然后检测了葡萄smd3-b基因在不同干旱和盐处理时间点的表达情况，发现葡萄smd3-b基因可以响应干旱和盐胁迫发生差异表达；进一步的，本发明将葡萄smd3-b基因导入到烟草中，发现smd3-b基因超表达的烟草植株在模拟干旱和盐胁迫条件下的生长情况明显好于野生型。
42.上述结果表明：葡萄smd3-b基因能够在植物体内发挥耐旱和耐盐功能，是葡萄中一个新的与抵御干旱和盐胁迫相关的基因。
43.葡萄smd3-b基因的序列如seq id no.1所示，具体如下：
44.atgagcagaagcttgggaatacctgtgaagcttctacacgaagccgcgggtcatgtggtgactgtggaactgaaaagcggtgagctttacagaggaaacatgatcgagtgcgaagataattggaactgtcagcttgaaagcatcaccttcaccggcaaggatgggaaggtttcacagcttgagcatgtttttatccgaggcagcaaagtcaggtttatggtcattccagacatgctgaagaatgctccaatgttcaagcgtcttgatgctagaatcaagggcaagggctcagcacttggagttggccggggtagggccgttgcaatgcgtgctagagctcaggcagctggtcgtggagctccacctggtaggggtgttgtgccaccagtacggagatga
45.葡萄smd3-b基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体如下：
46.msrslgipvk llheaaghvv tvelksgely rgnmiecedn wncqlesitf tgkdgkvsql ehvfirgskv rfmvipdmlk napmfkrlda rikgkgsalg vgrgravamr araqaagrga ppgrgvvppv rr。
47.本发明的葡萄smd3-b相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。
48.当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明核苷酸序列中。
49.在本发明中，可用实时荧光定量pcr的方法分析葡萄smd3-b的表达模式，即分析葡萄smd3-b的rna转录物在细胞组织中的存在与否以及数量。
50.基于上述发现的smd3-b基因，本发明的保护范围还包括与smd3-b基因同源的dna片段。
51.这些与smd3-b基因同源的dna片段包括本发明核苷酸序列(seq id no.1)对应的
等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因，都属于本发明保护的内容。
52.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的smd3-b基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明smd3-b基因的核苷酸序列70％或者更高同一性的核苷酸，只要功能与seq id no.1所示的核苷酸序列的功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
53.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明seq id no.1所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用blast算法测定(altschul et al.1990.journal of molecular biology 215:403-410；karlin and altschul.1993.proceedings of the national academy of sciences 90:5873-5877)。
54.上述70％或70％以上同一性，可为70％、75％、80％、85％、90％或95％以上的同一性。
55.由于烟草生长速度快、生活周期短、转化方法简便易操作、遗传转化效率高，因此，本发明选择烟草作为转基因的对象。但本发明中smd3-b基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它提高耐旱和耐盐能力的转基因植物。
56.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
57.本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
58.实施例1：葡萄smd3-b的克隆
59.1.植物材料：
60.本发明所用的材料为
‘
克瑞森无核’葡萄组培苗，培养基质为含蔗糖(30g/l)和植物琼脂(6g/l)的ms培养基。
61.2.rna的提取及逆转录：
62.采集葡萄叶片用于提取rna。使用rnaprep pure多糖多酚植物总rna提取试剂盒(dp441)按照说明书步骤提取总rna，使用takara primescript
tm rt reagent kit(perfect real time)试剂盒将1μg rna逆转录成cdna。
63.3.smd3-b的克隆验证：
64.根据ncbi的登录号为xm_002270496.4，设计引物：
65.smd3-b-f：5
′‑
atgagcagaagcttgggaatacc-3
′
(seq id no.3)；
66.smd3-b-f：5
′‑
tcatctccgtactggtggcac-3
′
(seq id no.4)。
67.使用primestar max premix高保真酶按照说明书步骤进行pcr反应，pcr产物连接到-t1 simple cloning vector(北京全式金生物技术有限公司)载体，转化大肠杆菌dh5α，利用菌落pcr筛选阳性单菌落，送至生工生物工程股份有限公司测序。克隆得到的葡萄smd3-b的核苷酸序列如seq id no.1所示，与xm_002270496.4存在一个碱基差异。
68.实施例2：葡萄smd3-b基因在不同干旱和盐处理时间点中的表达
69.1.植物材料：
70.将继代培养1个月、长势一致的
‘
克瑞森无核’葡萄组培苗，将组培苗分别浸泡在
300mm甘露醇溶液和200mm氯化钠溶液中，然后分别于不同时间点取样，液氮速冻保存。
71.2.rna的提取及逆转录：
72.同实施例1。
73.3.smd3-b基因在不同处理时间点中的表达量变化：
74.设计特异性引物以进行实时荧光定量pcr分析smd3-b在不同处理时间点中的表达量变化规律，设计引物如下：
75.qsmd3-b-f：5
′‑
gcaaggatgggaaggtttca-3
′
(seq id no.5)；
76.qsmd3-b-r：5
′‑
aacattggagcattcttcagcat-3
′
(seq id no.6)。
77.内参基因为actin，引物为：
78.actin-f：5
′‑
tccgttgtccagaagtcctctt-3
′
(seq id no.7)；
79.actin-r：5
′‑
gtcagcaataccagggaacatg-3
′
(seq id no.8)。
80.4.待测样品中smd3-b的实时荧光定量分析：
81.以cdna为模板，分别用smd3-b及actin的特异性引物进行荧光定量分析，反应在实时荧光定量pcr仪(cfx connect real time pcr detection system，bio-rad)进行，采用20μl体系(10μl sybr premix ex taq，上下游引物各0.6μm，cdna模板1μl，水7.8μl)，程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃10s，40个循环。
82.5.采用2
‑△△
ct
法进行smd3-b的相对定量分析：
83.结果表明：随着干旱和盐胁迫处理时间的延长，smd3-b的表达水平呈现先增加后下降趋势，说明smd3-b可以响应干旱和盐胁迫发生差异表达(图1)。
84.实施例3：葡萄smd3-b基因转烟草的耐旱和耐盐功能检测
85.使用phb-gfp载体(记载在文献“microrna171c-targeted scl6-ii,scl6-iii,and scl6-iv genes regulate shoot branching in arabidopsis，doi.org/10.1093/mp/ssq042”中)，构建smd3-b的超表达载体，引物如下：
86.phbsmd3-b-f：5
′‑
accagtctctctctcaagcttatgagcagaagcttgggaatacc-3
′
(seq id no.9)；
87.phbsmd3-b-r：5
′‑
gcccttgctcaccatggatcctctccgtactggtggcacaac-3
′
(seq id no.10)。
88.使用primestar max premix高保真酶进行pcr反应(20μl反应体系中，10μlprimestar master mix，上下游引物(10μm)各1μl，模板1μl，用水补齐至20μl)，程序如下：98℃10s，55℃5s，72℃10s 34个循环；72℃延伸5mins。
89.通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，并用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(b518131，生工生物)按照标准操作步骤进行纯化。
90.对phb-gfp载体质粒进行酶切处理，酶切反应体系如下：
91.92.将上述反应液置于37℃保温30分钟，之后经琼脂糖凝胶电泳之后切胶回收。
93.将酶切后的phb-gfp和smd3-b进行连接，根据clonexpress ii one step cloning kit试剂盒标准操作步骤进行，重组质粒转入大肠杆菌dh5α。利用菌落pcr筛选阳性克隆，送至生工测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。即获得含有smd3-b的超表达载体质粒。
94.利用叶盘法将smd3-b超表达载体质粒转入本式烟草。方法如下：lb摇菌后收集菌体置于50ml含75μmol/l乙酰丁香酮的无菌水中形成悬浮液，调整悬浮液od
600
数值为0.6，将无菌烟草叶片剪成小块放入该调整后的悬浮液中，侵染8min后接种于共生培养基(ms+6g/l琼脂+30g/l蔗糖+2mg/l 6-ba+0.5mg/l naa)，暗培养2-3天后，转接入筛选培养基(ms+6g/l琼脂+30g/l蔗糖+2mg/l 6-ba+0.5mg/l naa+15mg/l hyg)，每半个月换一次培养基，直至分化出抗性芽；待抗性芽长至1-2cm时更新筛选培养基，待植物生长稳定后将其转入生根培养基(1/2ms+6g/l琼脂+30g/l蔗糖+1mg/l iba+15mg/l hyg)生根。将生根苗转入土壤，收获种子。通过草铵膦筛选阳性转基因株系直至纯合，纯合系种子用于抗旱性鉴定。
95.取纯合系的转基因烟草的种子进行试验，以野生型烟草的种子作为对照。对种子表面消毒，70％乙醇冲洗30秒，2％naclo溶液消毒10min，无菌水漂洗后播散于1/2ms培养基中。26℃，16h光照/8h黑暗培养，发芽后，挑取大小一致的烟草幼苗分别移入含有100mm甘露醇的1/2ms固体培养基、含有100mm氯化钠的1/2ms固体培养基上，生长8天后观察生长情况。
96.结果如图2所示，结果表明：在模拟干旱和盐胁迫条件下，smd3-b超表达烟草(#1、#2)的生长情况明显高于野生型(wt)，即smd3-b可正调控耐旱和耐盐性。
97.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。

技术特征：
1.葡萄smd3-b基因在如下(1)-(2)任一项中的应用：(1)提高植物的耐旱和耐盐能力；(2)培育耐旱和耐盐能力提高的植物品种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述葡萄smd3-b基因为如下i)或ii)所示的核酸分子：i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。3.葡萄smd3-b基因编码的蛋白在如下(1)-(2)任一项中的应用：(1)提高植物的耐旱和耐盐能力；(2)制备提高植物的耐旱和耐盐能力的产品。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述葡萄smd3-b基因编码的蛋白为如下(a1)或(a2)所示的蛋白质：(a1)由序列表中seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)在(a1)中所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。5.含有葡萄smd3-b基因的表达盒、重组表达载体或重组菌在如下(1)-(2)任一项中的应用：(1)提高植物的耐旱和耐盐能力；(2)培育耐旱和耐盐能力提高的植物品种。6.一种提高植物对干旱和盐胁迫耐受性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将葡萄smd3-b基因转入目的植物中；或者上调植物基因组中葡萄smd3-b基因或其同源基因的表达；所述葡萄smd3-b基因为如下i)或ii)所示的核酸分子：i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。7.一种培育耐旱和耐盐性提高的转基因植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：将葡萄smd3-b基因转入野生型目的植物中，获得耐旱和耐盐性优于野生型的植株；所述葡萄smd3-b基因为如下i)或ii)所示的核酸分子：i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；ii)除i)以外的编码seq id no.2所示氨基酸序列的核酸分子。8.根据权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，葡萄smd3-b基因通过phb-gfp表达载体转入到目的植物中。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述目的植物为葡萄或烟草。

技术总结
本发明公开了SmD3-b在调控植物干旱和盐胁迫抗性中的应用，属于植物基因工程领域。本发明将来源于葡萄的Sm蛋白基因，即SmD3-b，构建超表达载体后导入烟草进行了植物抗性试验，发现该基因可提高烟草的抗旱性和抗盐性，扩展了我们对植物抗性产生的认知，为获得高抗性植株提供理论依据，具有很大的应用价值。具有很大的应用价值。具有很大的应用价值。


技术研发人员：高振 杜远鹏 苏一凡 李静 姚玉新
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/8/16