一种白首乌提取物及其应用的制作方法

1.本发明属于植物提取物领域，具体涉及一种白首乌提取物及其调节肠道运动和治疗痔疮的应用。


背景技术：

2.便秘是危害人类健康的常见病，慢性功能性便秘多由年老、体弱及产后术后耗气伤血，津枯肠燥，致使大便滞涩难行而导致。便秘常表现为：便意少，便次也少；排便艰难、费力；排便不畅；大便干结、硬便，排便不净感；便秘伴有腹痛或腹部不适，部分患者还伴有失眠、烦躁、多梦、抑郁、焦虑等精神心理障碍。由于便秘是一种较为普遍的症状，症状轻重不一，大部分人常常不去特殊理会，认为便秘不是病，不用治疗，但实际上便秘的危害很大，便秘的“报警”征象包括便血、贫血、消瘦、发热、黑便、腹痛等。
3.痔疮是肛门直肠底部的静脉丛发生曲张从而形成静脉团的慢性疾病，包括内痔、外痔以及混合痔，是临床上最常见的肛肠疾病。痔疮跟胃肠有直接的关系，因为当患者存在胃肠燥热的时候，就容易诱发患者出现大便干燥坚硬或者便秘，这个时候会影响正常的排便，导致排便时间加长，这样就容易诱发患者出现肛垫病理性肥大、下移，进而诱发痔疮。如果胃肠功能不好，出现腹泻、消化不良，这个时候也容易损伤肛管直肠黏膜，进而诱发肛裂或者外痔。
4.目前治疗肠道疾病还是以药物为主，然而这些药物的使用往往会导致肠道神经应激性的改变，长期来看会导致对药物形成依赖，甚至会使得肠道失去正常的消化排便等功能。除了西药外，目前比较常见的还有中药理疗和生物反馈治疗，然而目前逐渐显露出来的弊端也比较明显，比如机体电解质失衡、炎症反应、微生态失衡等。
5.白首乌(牛皮消)来源有萝摩科牛皮消属cynanchum sp.多种植物的块根，不同地区来源不一样。白首乌现已被《江苏省中药饮片炮制规范》(2020年版)收载，湖南省地方标准已多次收录本品，分别为1977年版、1983年版、2009年版《湖南中药饮片炮制规范》，以及2010年版《湖南省中药材标准》，目前正在修订的《湖南省中药饮片炮制规范》亦收录本品。通过整理全国地方标准，收载情况如下：
6.[0007][0008]
湖南省主要为萝摩科植物耳叶牛皮消cynanchum auriculatum royle ex wight，在江永一带有栽培并有应用历史。
[0009]
白首乌块根是中药中常用的药材，具有调节人体免疫功能的功能。对于某些有脱发问题的朋友，白首乌可以缓解脱发，具有有益肝脏和肾脏，滋养精华和血液以及抗衰老的作用，白首乌还具有降血脂和抗氧化的作用。
[0010]
目前现有技术只研究了白首乌块根的作用，但并无研究白首乌茎叶的相关文献。


技术实现要素：

[0011]
本发明的目的在于提供一种白首乌(萝摩科植物耳叶牛皮消cynanchum auriculatum royle ex wight)提取物及其调节肠道运动和治疗痔疮的应用。
[0012]
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
[0013]
一种白首乌提取物，其制备方法包括以下步骤：将白首乌茎叶粉碎，加6-15倍量水浸泡、煎煮、过滤；滤渣加4-10倍量水煎煮、过滤；再次4-8倍量水煎煮煎煮滤渣，后过滤；合并三次滤液，减压浓缩，得到白首乌提取物。
[0014]
煎煮的加水量越大，提取成分越多，但考虑浓缩时间会延长，所以制造成本会增加，但加水量过少的话，提取不够充分。
[0015]
而本发明之所以进行三次煎煮，是因为就白首乌茎叶而言，需要多次分部煎煮，才能提取完成有效成分，否则提取成分会不完全，形成药材资源浪费。
[0016]
优选的，所述白首乌为萝摩科植物耳叶牛皮消属。优选的，所述白首乌产自湖南省江永、永州、道县、双牌、零陵。
[0017]
优选的，所述减压浓缩的工艺为：控制压力为-0.06m～-0.08mpa，温度60-65℃。
[0018]
1、浓缩是为了减少服用量；2、采用低温减压浓缩，能提高浓缩效率，减少有效成分损失。
[0019]
优选的，减压浓缩至每ml药液含1g生药，得到白首乌提取物。
[0020]
本发明还要求保护所述白首乌提取物在制备调节肠道运动和治疗痔疮的药物或食品中的应用。
[0021]
本发明还要求保护一种调节肠道运动和治疗痔疮的药物，所述药物以上述白首乌提取物为活性成分。
[0022]
本发明的有益效果为：
[0023]
1、本发明首次发现，白首乌茎叶和白首乌块根的有效成分完全不一样，其功效也完全不同。
[0024]
2、本发明通过分析白首乌茎叶的有效成分，同时分析其功效部位，发现其对调节肠道运动和治疗痔疮有非常好的效果，且其效果远优于白首乌块根的提取物的效果。
附图说明
[0025]
图1为白首乌根与白首乌茎叶230nm色谱图；
[0026]
图2为白首乌根与白首乌茎叶265nm色谱图；
[0027]
图3为白首乌根与白首乌茎叶280nm色谱图；
[0028]
图4为白首乌根与白首乌茎叶290nm色谱图；
[0029]
图5为白首乌根在7.749
ꢀ‑
8.029min峰光谱图(200～400nm)；
[0030]
图6为白首乌茎叶在7.120-7.440min峰光谱图(200～400nm)
[0031]
图7为白首乌根在40.996-41.649min峰光谱图(200～400nm)；
[0032]
图8为白首乌茎叶在41.626-42.140min峰光谱图(200～400nm)；
具体实施方式
[0033]
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0034]
实施例1
[0035]
白首乌根与白首乌茎叶提取液比较
[0036]
1、实验方法
[0037]
1.1仪器及试药
[0038]
agilent 1260液相色谱仪、openlab cds 2.6色谱工作站、dad检测器，venusil mp c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，超声波清洗器(km7200de，昆山美美超声仪器有限公司)，甲醇(色谱纯，tedia)，乙腈(色谱纯，tedia)，磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，超纯水采用纯水机(direct-q
○r5uv-r，美国密理博)制备，白首乌根、白首乌茎叶由湖南省江永县姚永旺食品有限责任公司提供，为同株植物分别收集的根和茎叶(批号：20210901)，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为cynanchum auriculatum royle ex wight.的干燥块根和茎叶，具体见鉴定报告。
[0039]
其茎叶具体特征为：
[0040]
【性状】
[0041]
茎微被柔毛，细长椭圆柱形或圆柱形，表面棕黄色至青绿色，有纵棱，有的向一侧
扭曲，节明显，体轻，质脆，易折断，断面中空。单叶对生，常皱缩或破碎，完整者呈宽卵形至卵状长圆形，基部深心形，两侧呈耳状内弯，被微毛；叶柄较细，长3～9cm，扁圆形。气微，味淡。
[0042]
【显微】
[0043]
(1)横切面：
[0044]
茎横切面：表皮细胞由一列类方形细胞组成，皮层宽7-10列细胞，柱鞘纤维断续排列成环，维管束双韧型，内外韧皮部细胞较小，形成层成环，次生木质部有大型导管两侧排列，初生木质部导管较小，有木纤维。髓部发达，有大型裂隙，薄壁细胞中含有草酸钙簇晶，并有乳汁管散在。
[0045]
叶横切面：上下表皮细胞均由一列细胞组成，表皮细胞可见多细胞非腺毛。
[0046]
叶肉组织由栅栏组织和海绵组织组成。主脉表皮细胞内方均有厚角组织分布，维管束双韧型，内外韧皮部细胞较小，木质部位于中间，导管多角形，纵向单列，形成层明显。薄壁细胞中含有草酸钙簇晶，并有乳汁管散在。
[0047]
(2)粉末特征
[0048]
粉末特征：纤维多列或成束，壁极厚，胞腔线型，直径25-50um。草酸钙簇晶多见，棱角短钝，直径17-40um，有时含晶细胞排列成行。下表皮细胞多角形，垂周壁略平直，气孔较多，为不定式或平轴式；多细胞非腺毛弯曲或平直；石细胞方形、长方形或多角形，散在或数个集聚，孔沟明显，直径17～60um；有具缘纹孔导管、网纹导管和螺纹导管。
[0049]
【检查】水分照水分测定法(《中国药典》2020版四部0832第二法)测定，不得过9.0％。
[0050]
1.2供试品溶液的制备
[0051]
白首乌根供试品溶液的制备：取白首乌根300g(批号：20210901)，粉碎成粗粉，加水8倍量浸泡30分钟，加热煎煮2小时，药液滤过；药渣加水6倍量加热煎煮1.5小时，药液滤过；药渣加水6倍量加热煎煮1小时，药液滤过；合并三次滤液，减压浓缩(-0.06m～-0.08mpa，60-65℃)至300ml(每ml药液含1g生药)；取上述1g/ml药液1ml，置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为白首乌根供试品溶液。
[0052]
白首乌茎叶供试品溶液的制备：取白首乌茎叶300g(批号：20210901)，粉碎成粗粉，加水8倍量浸泡30分钟，加热煎煮2小时，药液滤过；药渣加水6倍量加热煎煮1.5小时，药液滤过；药渣加水6倍量加热煎煮1小时，药液滤过；合并三次滤液，减压浓缩(-0.06m～-0.08mpa，60-65℃)至300ml(每ml药液含1g生药)；取上述1g/ml药液1ml，置于50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为白首乌茎叶供试品溶液。
[0053]
1.3色谱条件
[0054]
以乙腈为流动相a，0.1％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为200～400nm，提取230nm、265nm、280nm、290nm色谱图
[1][2]
。
[0055]
表1洗脱条件
[0056][0057]
1.4测定法
[0058]
分别精密吸取空白溶液(水)、白首乌根供试品溶液与白首乌茎叶供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0059]
2、实验结果
[0060]
2.1精密度试验
[0061]
取“1.2”项下供试品溶液(白首乌根供试品溶液与白首乌茎叶供试品溶液)，按“1.3”项下色谱条件分别连续进样测定6次，计算各共有峰的保留时间和峰面积rsd(％)。结果显示，白首乌根各共有峰保留时间的rsd为0.86％～2.17％，各共有峰峰面积的rsd为0.76～2.29％(n＝6)；白首乌茎叶各共有峰保留时间的rsd为0.91％～2.45％，各共有峰峰面积的rsd为0.84～2.55％(n＝6)，表明方法精密度良好。
[0062]
2.2重复性试验
[0063]
取白首乌根粗粉与白首乌茎叶粗粉，按“1.2”项下供试品溶液制备方法分别制备白首乌根供试品溶液6份与白首乌茎叶供试品溶液6份，再按“1.3”项下色谱条件分别进样测定，计算各共有峰的保留时间和峰面积rsd(％)。结果显示，白首乌根各共有峰保留时间的rsd为0.97％～2.82％，各共有峰峰面积的rsd为1.02～2.46％(n＝6)；白首乌茎叶各共有峰保留时间的rsd为0.95％～2.68％，各共有峰峰面积的rsd为0.96～2.83％(n＝6)，表明方法重复性良好。
[0064]
2.3稳定性试验
[0065]
取“1.2”项下供试品溶液(白首乌根供试品溶液与白首乌茎叶供试品溶液)，分别于室温下放置0、4、8、12、24、48h时按“1.3”项下色谱条件分别进样测定，计算各共有峰的保留时间和峰面积rsd(％)。结果显示，白首乌根各共有峰保留时间的rsd为0.64％～2.31％，各共有峰峰面积的rsd为1.21～2.58％(n＝6)；白首乌茎叶各共有峰保留时间的rsd为0.81％～2.71％，各共有峰峰面积的rsd为1.08～2.92％(n＝6)，表明供试品溶液于室温下放置48h稳定性良好。
[0066]
提取白首乌根、白首乌茎叶在230nm、265nm、280nm、290nm波长下的色谱图及数据，并列出了各峰的保留时间和峰面积，具体见表1～4、图1～8。
[0067]
表2白首乌根与白首乌茎叶230nm波长下各色谱峰及峰面积
[0068][0069][0070]
表3白首乌根与白首乌茎叶265nm波长下各色谱峰及峰面积
[0071][0072]
表4白首乌根与白首乌茎叶280nm波长下各色谱峰及峰面积
[0073][0074][0075]
表5白首乌根与白首乌茎叶290nm波长下各色谱峰及峰面积
[0076][0077]
结果提示，对比发现，白首乌根和白首乌茎叶的色谱图中有2对色谱峰的保留时间接近，如在265nm波长下分别为白首乌根峰1与白首乌茎叶峰1、白首乌根峰4与白首乌茎叶
峰6，对以上保留时间接近的2对色谱峰提取紫外吸收光谱(200～400nm)，经分析光谱图可知，白首乌根峰1与白首乌茎叶峰1、白首乌根峰4与白首乌茎叶峰6均不是同一成分，其他色谱峰也均为不同的成分。
[0078]
试验结果表明：在该色谱条件下，白首乌根和白首乌茎叶色谱图所呈现的物质成分中，无共有成分，差异显著。
[0079]
【参考文献】
[0080]
[1]颜剑,林玲,刘圆圆,等.hplc检测隔山消化学成分的研究[j].北方药学,2015,12(09):14.
[0081]
[2]徐霞,贾晓东,姚欣梅,等.耳叶牛皮消指纹图谱的研究[j].中国野生植物源,2009,28(03):45-48.
[0082]
实施例2
[0083]
白首乌系列提取物对正常小鼠肠道运动的影响
[0084]
1实验材料
[0085]
1.1药品
[0086]
1.1.1受试品：白首乌(耳叶牛皮消，cynanchum auriculatumroyle ex wight)系列提取物，提取方法同实施例1，批号：20201113；规格：100ml；剂型：流浸膏；含量：1g生药/ml；性状：棕褐色液体；有效期至：2021.06.13；由湖南中嘉生物医药有限公司生产。
[0087]
1.1.2阳性对照药：多潘立酮，批号：190701；规格：10mg/片；有效期至：2021.06；临床使用剂量：30mg/日，由湖南千金湘江药业股份有限公司生产。
[0088]
四磨汤，批号：2008304 283；规格：10ml/支；有效期至：2022.07；临床使用剂量：60ml/日，由湖南汉森制药股份有限公司生产。
[0089]
1.2实验动物：spf级icr小鼠90只，雌雄各半，体重18～22g，雌雄各半，实验动物质量合格证：no.430726211100025264，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2019-0004，在屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：syxk(湘)2020-0015。
[0090]
1.3主要试剂：羧甲基纤维素钠(cmc-na)(批号：20200604)，为上海山浦化工有限公司产品；阿拉伯树胶粉(批号：20201012)，为天津市福辰化学试剂厂产品；活性炭(批号：20190928)，为北京京东奥博科技发展有限公司产品；半固体黑色糊状物，用2gcmc-na和1g阿拉伯树胶溶于水，加1g活性炭粉末搅拌均匀，最后加注射用水至100ml，即成。1.4主要仪器：auy型分析天平(本中心编号：085/153，日本岛津公司生产)。
[0091]
2试验方法
[1-4]
[0092]
2.1试验分组
[0093]
选取检疫合格icr小鼠90只，按体重、性别随机分为空白对照组、多潘立酮组、四磨汤组、白首乌根提取物低、高剂量组，白首乌叶提取物低、高剂量组、白首乌根+叶提取物低、高剂量组，每组10只。每日给药前将白首乌系列提取物、四磨汤和多潘立酮用纯水配制成相应浓度药液，各组小鼠按20ml/kg灌胃给予相应剂量的受试物，每日一次，连续给药3天，空白对照组灌胃给予等体积纯水。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药后检测肠推进率。给药后30min各组小鼠按20ml/kg灌胃给予蓝色糊状物。30min后将各组小鼠颈椎脱臼处死，取出小鼠自幽门至回盲部的小肠，测其全长和蓝色糊状物前沿至幽门的距离，计算其与全长
的百分比，即推进百分率。
[0094]
2.2剂量设计
[0095]
白首乌系列提取物临床拟用剂量为每日20g(生药量)，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为20g/日
×
0.0026/0.02kg＝2.6g生药/kg，本次实验以白首乌系列提取物的大鼠临床等效剂量的1倍、4倍设置为低、高剂量组，即2.6g生药/kg和10.4g生药/kg；多潘立酮临床使用剂量为每日30mg，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为30mg/日
×
0.0026/0.02kg＝3.9mg/kg，本次试验以多潘立酮的小鼠等效剂量的1倍作为多潘立酮组的给药剂量，即3.9mg/kg；四磨汤临床使用剂量为每日60ml，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为60ml/日
×
0.0026/0.02kg＝7.8ml/kg，本次试验以四磨汤的小鼠等效剂量的1倍作为四磨汤组的给药剂量，即7.8ml/kg。具体剂量设计详见表6。
[0096]
表6白首乌系列提取物对正常小鼠肠道运动的影响
[0097][0098]
2.3检测指标：取出自幽门至回盲部的小肠，不加牵引地平铺于玻璃板上，测其全长和碳末前沿至幽门的距离，计算其与全长的百分比，即推进百分率。
[0099]
2.4统计学方法
[0100]
采用spss16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为p≤0.05。计量资料采用均数
±
标准差用leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-way anova)和post hoc lsd进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用kruskal-wallis检验。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p≤0.05)，则用dunnett’s test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。
[0101]
3实验结果
[0102]
如表7所示，与空白对照组比较，白首乌系列提取物中、高剂量组、多潘立酮组及四磨汤口服液组小鼠的小肠推进百分率均无明显差异。
[0103]
表7白首乌系列提取物对正常小鼠肠推进作用及胃排空的影响
[0104]
组别剂量(生药/kg)肠推进率(％)
空白对照组
‑‑
62.0
±
15.5多潘立酮组3.9mg/kg70.2
±
13.2四磨汤组7.8ml/kg64.8
±
11.7白首乌根低剂量组2.655.4
±
17.2白首乌根高剂量组10.458.8
±
10.0白首乌叶低剂量组2.663.5
±
12.5白首乌叶高剂量组10.467.2
±
13.2白首乌根+叶低剂量组2.674.5
±
9.3白首乌根+叶高剂量组10.465.4
±
9.2
[0105]
4实验小结
[0106]
上述结果表明，白首乌系列提取物对正常小鼠肠道运动无明显影响。
[0107]
实施例3
[0108]
白首乌系列提取物对阿托品致小鼠肠抑制的影响
[0109]
1实验材料
[0110]
1.1药品
[0111]
1.1.1受试品：白首乌(耳叶牛皮消，cynanchum auriculatumroyle ex wight)系列提取物，提取方法同实施例1，批号：20201113；规格：100ml；剂型：流浸膏；含量：1g生药/ml；性状：棕褐色液体；有效期至：2021.06.13；由湖南中嘉生物医药有限公司生产。
[0112]
1.1.2阳性对照药：多潘立酮，批号：190701；规格：10mg/片；有效期至：2021.06；临床使用剂量：30mg/日，由湖南千金湘江药业股份有限公司生产。
[0113]
四磨汤，批号：2008304 283；规格：10ml/支；有效期至：2022.07；临床使用剂量：60ml/日，由湖南汉森制药股份有限公司生产。
[0114]
1.2实验动物：spf级icr小鼠100只，雌雄各半，体重18～22g，雌雄各半，实验动物质量合格证：no.430726211100028184，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2019-0004，在屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：syxk(湘)2020-0015。
[0115]
1.3主要试剂：硫酸阿托品注射液(批号：191152)，为天津药业集团新郑股份有限公司产品；羧甲基纤维素钠(cmc-na)(批号：20200604)，为上海山浦化工有限公司产品；阿拉伯树胶粉(批号：20201012)，为天津市福辰化学试剂厂产品；活性炭(批号：20190928)，为北京京东奥博科技发展有限公司产品；半固体黑色糊状物，用2gcmc-na和1g阿拉伯树胶溶于水，加1g活性炭粉末搅拌均匀，最后加注射用水至100ml，即成。
[0116]
1.4主要仪器：auy型分析天平(本中心编号：085，日本岛津公司生产)。
[0117]
2试验方法
[1-4]
[0118]
2.1实验分组
[0119]
选取检疫合格icr小鼠100只，按体重、性别随机分为正常对照组、模型对照组、多潘立酮组、四磨汤组、白首乌根提取物低、高剂量组，白首乌叶提取物低、高剂量组、白首乌根+叶提取物低、高剂量组，每组10只。每日给药前将白首乌系列提取物、四磨汤和多潘立酮用纯水配制成相应浓度药液，各组小鼠按20ml/kg灌胃给予相应剂量的受试物，每日一次，连续给药3天，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积纯水。末次给药后立即腹腔注射
0.1mg/kg阿托品。于给药后30min各组小鼠按20ml/kg灌胃给予蓝色糊状物。30min后将各组小鼠颈椎脱臼处死，取出小鼠自幽门至回盲部的小肠，测其全长和蓝色糊状物前沿至幽门的距离，计算其与全长的百分比，即推进百分率。
[0120]
2.2剂量设计
[0121]
白首乌系列提取物临床拟用剂量为每日20g(生药量)，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为20g/日
×
0.0026/0.02kg＝2.6g生药/kg，本次实验以白首乌系列提取物的大鼠临床等效剂量的1倍、4倍设置为低、高剂量组，即2.6g/kg和10.4g生药/kg；多潘立酮临床使用剂量为每日30mg，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为30mg/日
×
0.0026/0.02kg＝3.9mg/kg，本次试验以多潘立酮的小鼠等效剂量的1倍作为多潘立酮组的给药剂量，即3.9mg/kg；四磨汤临床使用剂量为每日60ml，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为60ml/日
×
0.0026/0.02kg＝7.8ml/kg，本次试验以四磨汤的小鼠等效剂量的1倍作为四磨汤组的给药剂量，即7.8ml/kg。具体剂量设计同表6。
[0122]
2.3检测指标：取出自幽门至回盲部的小肠，不加牵引地平铺于玻璃板上，测其全长和碳末前沿至幽门的距离，计算其与全长的百分比，即推进百分率。
[0123]
2.4.统计学方法
[0124]
采用spss16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为p≤0.05。计量资料采用均数
±
标准差(x
±
s)。用leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-way anova)和post hoc lsd进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用kruskal-wallis检验。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p≤0.05)，则用dunnett’s test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。
[0125]
3实验结果
[0126]
如表8所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肠推进率显著减小(p≤0.01)；与模型对照组比较，白首乌根、叶及根+叶低、高剂量组小鼠小肠推进率均显著增加(p≤0.01)，提示白首乌的根和茎叶的提取物能显著改善肠抑制，促进肠道运动，缓解排便困难。与白首乌根高剂量组比较，白首乌叶高剂量组小鼠肠推进率均显著增大(p≤0.05)，提示白首乌叶提取物对肠抑制的调整作用较白首乌根提取物更佳。
[0127]
表8白首乌系列提取物对阿托品致小鼠肠抑制的影响(n＝10)
[0128]
[0129][0130]
注：与正常对照组比较
++
p≤0.01，与模型对照组比较*p≤0.05，**p≤0.01；与白首乌根高剂量组比较δp≤0.05。
[0131]
4实验小结
[0132]
上述实验结果表明，白首乌系列提取物(根、叶、根+叶)对阿托品致小鼠肠抑制具有明显改善作用，且白首乌叶提取物对肠抑制的调整作用较白首乌根提取物更佳。
[0133]
实施例4
[0134]
白首乌系列提取物对新斯的明致小鼠肠亢进的影响
[0135]
1实验材料
[0136]
1.1药品
[0137]
1.1.1受试品：白首乌(耳叶牛皮消，cynanchum auriculatumroyle ex wight)系列提取物，提取方法同实施例1，批号：20201113；规格：100ml；剂型：流浸膏；含量：1g生药/ml；性状：棕褐色液体；有效期至：2021.06.13；由湖南中嘉生物医药有限公司生产。
[0138]
1.1.2阳性对照药：多潘立酮，批号：190701；规格：10mg/片；有效期至：2021.06；临床使用剂量：30mg/日，由湖南千金湘江药业股份有限公司生产。
[0139]
四磨汤，批号：2008304 283；规格：10ml/支；有效期至：2022.07；临床使用剂量：60ml/日，由湖南汉森制药股份有限公司生产。
[0140]
1.2实验动物：spf级icr小鼠100只，雌雄各半，体重18～22g，雌雄各半，实验动物质量合格证：no.430726211100028184，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2019-0004，在屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：syxk(湘)2020-0015。
[0141]
1.3主要试剂：甲硫酸新斯的明注射液(批号：190903)，为山海信谊制药有限公司产品；羧甲基纤维素钠(cmc-na)(批号：20200604)，为上海山浦化工有限公司产品；阿拉伯树胶粉(批号：20201012)，为天津市福辰化学试剂厂产品；活性炭(批号：20190928)，为北京京东奥博科技发展有限公司产品；半固体黑色糊状物，用2gcmc-na和1g阿拉伯树胶溶于水，加1g活性炭粉末搅拌均匀，最后加注射用水至100ml，即成。
[0142]
1.4主要仪器：auy型分析天平(本中心编号：085，日本岛津公司生产)。
[0143]
2试验方法
[1-4]
[0144]
2.1实验分组
[0145]
选取检疫合格icr小鼠100只，按体重、性别随机分为正常对照组、模型对照组、多潘立酮组、四磨汤组、白首乌根提取物低、高剂量组，白首乌叶提取物低、高剂量组、白首乌根+叶提取物低、高剂量组，每组10只。每日给药前将白首乌系列提取物、四磨汤和多潘立酮用纯水配制成相应浓度药液，各组小鼠按20ml/kg灌胃给予相应剂量的受试物，每日一次，
连续给药3天，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积纯水。末次给药前禁食不禁水12h，末次给药后肌肉注射甲硫酸新斯的明0.15mg/kg。给药后30min各组小鼠按20ml/kg灌胃给予蓝色糊状物。30min后将各组小鼠颈椎脱臼处死，取出小鼠自幽门至回盲部的小肠，测其全长和蓝色糊状物前沿至幽门的距离，计算其与全长的百分比，即推进百分率。
[0146]
2.2剂量设计
[0147]
白首乌系列提取物临床拟用剂量为每日20g(生药量)，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为20g/日
×
0.0026/0.02kg＝2.6g生药/kg，本次实验以白首乌系列提取物的大鼠临床等效剂量的1倍、4倍设置为低、高剂量组，即2.6g生药/kg和10.4g生药/kg；多潘立酮临床使用剂量为每日30mg，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为30mg/日
×
0.0026/0.02kg＝3.9mg/kg，本次试验以多潘立酮的小鼠等效剂量的1倍作为多潘立酮组的给药剂量，即3.9mg/kg；四磨汤临床使用剂量为每日60ml，按体表面积法折算成小鼠等效剂量为60ml/日
×
0.0026/0.02kg＝7.8ml/kg，本次试验以四磨汤的小鼠等效剂量的1倍作为四磨汤组的给药剂量，即7.8ml/kg。具体剂量设计详见表6。
[0148]
2.3检测指标：取出自幽门至回盲部的小肠，不加牵引地平铺于玻璃板上，测其全长和碳末前沿至幽门的距离，计算其与全长的百分比，即推进百分率。
[0149]
2.4统计学方法
[0150]
采用spss16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为p≤0.05。计量资料采用均数
±
标准差用leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-way anova)和post hoc lsd进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用kruskal-wallis检验。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p≤0.05)，则用dunnett’s test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。
[0151]
3实验结果
[0152]
如表9所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肠推进率显著增大(p≤0.01)；与模型对照组比较，白首乌叶低、高剂量组肠推进率可见显著减小(p≤0.05)，白首乌根低、高剂量组及根+叶低、高剂量组小鼠小肠推进率均显著减小(p≤0.05或p≤0.01)，提示白首乌的叶、根和根+叶提取物均能显著降低肠道运动，缓解腹泻等引起的肠道亢进。与白首乌根高剂量组比较，白首乌茎叶高剂量组小鼠肠推进率均显著减小(p≤0.05)，提示白首乌茎叶提取物对肠亢进的调整作用较白首乌根提取物更佳。
[0153]
表9白首乌系列提取物对新斯的明致小鼠肠亢进的影响(n＝10)
[0154]
组别剂量(生药/kg)肠推进率(％)正常对照组
‑‑
68.7
±
11.4模型对照组
‑‑
88.6
±
6.8
++
多潘立酮组3.9mg/kg81.8
±
9.9四磨汤组7.8ml/kg76.7
±
17.1*根低剂量组2.675.0
±
18.0*根高剂量组10.470.2
±
14.0**叶低剂量组2.668.1
±
8.2*
叶高剂量组10.460.9
±
6.1**
δ
根+叶低剂量组2.678.8
±
13.9*根+叶高剂量组10.468.2
±
9.5**
[0155]
注：与正常对照组比较
++
p≤0.01，与模型对照组比较*p≤0.05，**p≤0.01；与白首乌根高剂量组比较δp≤0.05。
[0156]
4实验小结
[0157]
上述实验结果表明，白首乌系列提取物对新斯的明致小鼠肠亢进具有明显改善作用，且白首乌叶提取物对肠亢进的调整作用较白首乌根提取物更佳。
[0158]
实施例5
[0159]
白首乌系列提取物对巴豆油致大鼠痔疮模型的影响
[0160]
1实验材料
[0161]
1.1药品
[0162]
1.1.1受试品：白首乌(耳叶牛皮消，cynanchum auriculatumroyle ex wight)系列提取物，提取方法同实施例1，批号：20201113；规格：100ml；剂型：流浸膏；性状：棕褐色液体；有效期至：2021.06.13；由湖南中嘉生物医药有限公司生产。
[0163]
1.1.2阳性对照药：痔疮胶囊，批号：200701；规格：0.3g/粒；有效期至：2021.06；由吉林百琦药业有限公司生产。
[0164]
1.2实验动物：spf级sd大鼠100只，雌雄各半，体重180～220g，雌雄各半，实验动物质量合格证：no.430727211100204434，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：scxk(湘)2019-0004，在屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：syxk(湘)2020-0015。
[0165]
1.3主要试剂：巴豆油(批号：191152)，为sigma公司产品。
[0166]
1.4主要仪器：auy型分析天平(本中心编号：085，日本岛津公司生产)。
[0167]
2试验方法
[0168]
2.1实验分组
[0169]
选取检疫合格sd大鼠100只，按体重、性别随机分为正常对照组、模型对照组、多潘立酮组、四磨汤组、白首乌根提取物低、高剂量组，白首乌叶提取物低、高剂量组、白首乌根+叶提取物低、高剂量组，每组10只。每日给药前将白首乌系列提取物、痔疮胶囊用纯水配制成相应浓度药液，各组大鼠按20ml/kg灌胃给予相应剂量的受试物，每日一次，连续给药3天，正常对照组和模型对照组灌胃给予等体积纯水。末次给药前进行造模(在动物肛门处用浸吸0.16ml巴豆油混合液的棉球湿10s)，造模后立即给药一次，6h后处死动物，剪取直肠(肛门皮毛边缘其13-15mm)，肛门，称量湿重。
[0170]
2.2剂量设计
[0171]
白首乌系列提取物临床拟用剂量均为每日20g(生药量)，按体表面积法折算成大鼠等效剂量为20g/日
×
0.018/0.2kg＝1.8g生药/kg，本次实验将等效剂量的1倍、4倍设置为白首乌根、叶、根+叶提取物的低、高剂量组，即1.8g生药/kg和7.2g生药/kg；痔疮胶囊临床使用量为每日0.3粒*3次*5粒子/次＝4.5g/日，按体表面积法折算成大鼠等效剂量为4.5g/日
×
0.018/0.2kg＝0.4g/kg，本次试验以痔疮胶囊的临床等效剂量的1倍作为痔疮胶囊组的给药剂量，即0.4g/kg。具体剂量设计详见表10。
[0172]
表10试验分组和剂量设计
[0173][0174][0175]
2.3统计学方法
[0176]
采用spss16.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为p≤0.05。计量资料采用均数
±
标准差用leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(one-way anova)和post hoc lsd进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用kruskal-wallis检验。如果kruskal-wallis检验有统计学意义(p≤0.05)，则用dunnett’s test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。
[0177]
3实验结果
[0178]
如表11所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肛门湿重显著增大(p≤0.01)；与模型对照组比较，白首乌叶、根低、高剂量组及根+叶低、高剂量组大鼠肛门湿重均显著减小(p≤0.05或p≤0.01)，提示白首乌的叶和根提取物均能显著降低肛门肿胀大鼠肛门湿重，可缓解痔疮引起的肛门水肿等急性炎症反应，且与白首乌根高剂量组比较，白首乌叶高剂量组大鼠肛门湿重显著减小(p≤0.05)，提示白首乌叶提取物抑制肛周肿胀的作用较白首乌根提取物更佳。
[0179]
表11白首乌对大鼠肛门肿胀模型的影响(n＝10)
[0180]
[0181][0182]
注：与正常对照组比较
++
p≤0.01；与模型对照组比较
*
p≤0.05，
**
p≤0.01；与白首乌根高剂量组比较
δ
p≤0.05。。
[0183]
4实验小结
[0184]
上述实验结果表明，白首乌系列提取物能缓解对巴豆油所致肛周肿胀，提示其对痔疮具有改善作用，且白首乌叶提取物抑制肛周肿胀的作用较白首乌根提取物更佳。
[0185]
结论：
[0186]
本研究观察了白首乌系列提取物(根、叶、根+叶)对正常、肠抑制及肠亢进小鼠胃肠道运动的影响，同时通过巴豆油诱导大鼠肛周肿胀，模拟痔疮发作时的肛周肿胀状态，以评价白首乌系列提取物对痔疮的治疗作用。结果显示：(1)白首乌系列提取物(根、叶、根+叶)对正常小鼠肠道推进率无明显影响。(2)白首乌根、叶及根+叶低、高剂量均能显著增加肠抑制小鼠肠道推进率，且白首乌叶提取物的药效明显更佳。(3)白首乌叶、根、根+叶低、高剂量均能显著减小肠亢进小鼠肠推进率，且白首乌叶提取物减小肠亢进小鼠肠推进率的作用更明显。(4)白首乌叶、根低、高剂量及根+叶低、高剂量均能显著减小大鼠肛门湿重，抑制巴豆油所致肛周肿胀，且白首乌叶提取物的药效明显更佳。
[0187]
综上所述，(1)白首乌系列提取物对正常小肠的肠道运动无明显影响，但能调整肠抑制和肠亢小肠的肠道运动，提示白首乌系列提取物对肠道运动具有双向调节作用，且白首乌叶提取物对肠抑制和肠亢进的调整作用更佳；(2)白首乌系列提取物能显著抑制巴豆油所致肛周肿胀，提示其对痔疮可能具有一定治疗作用，且白首乌叶提取物抑制肛周肿胀的作用较白首乌根提取物更佳。

技术特征：
1.一种白首乌提取物在制备调节肠道运动的药物中的应用，其特征在于，所述白首乌提取物的制备方法包括以下步骤：将白首乌茎叶粉碎，加6-15倍量水浸泡、煎煮、过滤；滤渣加4-10倍量水煎煮、过滤；再次4-8倍量水煎煮煎煮滤渣，煮后过滤；合并三次滤液，减压浓缩，得到白首乌提取物；所述白首乌为萝摩科植物耳叶牛皮消属。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白首乌产自湖南省江永、永州、道县、双牌、零陵。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述减压浓缩的工艺为：控制压力为-0.06m～-0.08mpa，温度60-65℃。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，减压浓缩至每m1药液含1g生药，得到白首乌提取物。5.一种调节肠道运动的药物，其特征在于，所述药物以白首乌提取物为活性成分；所述白首乌提取物的制备方法包括以下步骤：将白首乌茎叶粉碎，加6-15倍量水浸泡、煎煮、过滤；滤渣加4-10倍量水煎煮、过滤；再次4-8倍量水煎煮煎煮滤渣，煮后过滤；合并三次滤液，减压浓缩，得到白首乌提取物；所述白首乌为萝摩科植物耳叶牛皮消属。

技术总结
本发明属于植物提取物领域，具体涉及一种白首乌(萝摩科植物耳叶牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)提取物在调节肠道运动中的应用。所述白首乌提取物其制备方法包括以下步骤：将白首乌茎叶粉碎，加6-15倍量水浸泡、煎煮、过滤；滤渣加4-10倍量水煎煮、过滤；再次4-8倍量水煎煮煎煮滤渣，后过滤；合并三次滤液，减压浓缩，得到白首乌提取物。本发明通过分析白首乌茎叶的有效成分，同时分析其功效部位，发现其对调节肠道运动和治疗痔疮有非常好的效果，且其效果远优于白首乌块根的提取物的效果。物的效果。


技术研发人员：王毅清 谭桂山 张乐佳 宋太发 宋军 周书奥
受保护的技术使用者：湖南中嘉生物医药有限公司
技术研发日：2022.05.17
技术公布日：2023/8/16