一种黄海芽孢杆菌及其在处理养殖废水中的应用

1.本发明涉及废水净化技术领域，特别是涉及一种黄海芽孢杆菌及其在处理养殖废水中的应用。


背景技术：

2.近年来，我国畜牧业发展速度不断加快，畜牧养殖业由原有的零散养殖逐步转变成大型的集约化、规模化养殖。畜禽饲养量逐年增加，数据显示，2005-2014年期间，生猪的养殖数量逐年递增，猪肉产量呈整体上升趋势，由2005年的4528万吨增长到2018年的5404万吨，增长了19.3％；牛肉的产量也逐渐增加，由2005年的549万头增加到2017年726万头，增长32.2％；2019年底肉猪出栏量为54419.2万头，牛的饲养量为9138.3万头。然而，在规模化养殖过程中，由于饲养量增加，会导致每天有大量粪尿及圈舍冲洗水产生，并且在这些废水中通常含有较高浓度的氮、磷、重金属和有机物等污染物。据《全国环境统计公报》数据显示，每年氨氮的排放量中约有1068.6万吨和72.6万吨来源于农业生产，约占全国总排放量的48％和32％，而高达95％的排放量是来源于畜禽养殖业排放的污染物。畜禽养殖污染物无疑己成为引起农业源污染的罪魁祸首。因此，寻找一种高效率、低成本、推广范围广的废水处理技术，对于养殖行业规模化发展具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种黄海芽孢杆菌及其在处理养殖废水中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明获得的黄海芽孢杆菌w202能够去除养殖废水中的总氮、硝态氮、总磷、活性磷酸盐等氮、磷污染物，有效净化畜禽养殖废水，为养殖废水的处理提供了新思路。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明提供一种黄海芽孢杆菌(bacillus marisflavi)w202，已于2016年08月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.12818。
6.本发明还提供一种菌剂，包含所述的黄海芽孢杆菌w202的菌株或其发酵菌液。
7.进一步地，所述发酵菌液中黄海芽孢杆菌w202的菌数od
600nm
值为0.6-1.3。
8.本发明还提供一种所述的黄海芽孢杆菌w202或所述的菌剂在处理养殖废水中的应用。
9.本发明还提供一种净化养殖废水的制剂，包含所述的黄海芽孢杆菌w202或所述的菌剂。
10.进一步地，所述养殖废水为畜禽养殖废水。
11.进一步地，所述畜禽养殖废水包括猪场养殖废水。
12.本发明公开了以下技术效果：
13.本发明从海洋水域中分离得到一株黄海芽孢杆菌w202菌株，通过实验证实该菌株
具有较好的异养硝化好氧反硝化能力，推测其可以作为净化养殖废水的新菌株。并结合对猪场养殖废水的处理实验，证实黄海芽孢杆菌w202能够去除养殖废水中的总氮、硝态氮、总磷、活性磷酸盐等氮、磷污染物，净化效果显著，为畜禽养殖废水的净化处理提供了新思路。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
15.图1为菌株w202的革兰氏染色图；
16.图2为菌株w202的电镜扫描图；
17.图3为菌株w202的生长曲线图；
18.图4为菌株w202在不同温度下的生长情况；
19.图5为菌株w202在不同ph条件下的生长情况。
具体实施方式
20.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
21.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
22.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
23.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
24.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
25.实施例1黄海芽孢杆菌w202的筛选、鉴定及保藏
26.1样品及试剂、仪器
27.1.1样品采集
28.从福建省福州市附近海域采集海泥和海水样品，静置7d，备用。
29.1.2培养基
30.lb液体培养基：称取胰酪蛋白胨10g，酵母膏5g，nacl 10g，加入蒸馏水或去离子水
定容至1l，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装100ml锥形瓶中，每瓶20ml，121℃高压灭菌15min，备用；
31.lb固体培养基：同lb液体培养基，额外加入琼脂15g即可；
32.硝化培养基(每升)：4.0g柠檬酸钠，0.5g(nh4)2so4，50ml维氏盐溶液；维氏盐溶液：6.5g k2hpo
4`
3h2o，2.5g mgso
4`
7h2o，2.5gnacl，0.05g feso
4`
7h2o，0.04g mnso
4`
h2o；最终培养基的ph为7.0。
33.反硝化培养基(每升)：0.721g kno3，10.55g na2hpo
4`
12h2o，1.5g kh2po4，0.1gmgso
4`
7h2o，4.0g柠檬酸钠，2ml微量元素溶液；微量元素溶液：50.0g edta-na2，5.5g cacl2，5.06g mncl
2`
4h2o，5.0g feso
4`
7h2o，2.2g znso4，1.61gcocl
2`
6h2o，1.57g cuso
4`
5h2o；调节好氧反硝化培养基的ph为7.0。
34.1.3耗材及仪器
35.10ml试管及试管塞，锥形瓶150ml，1ml移液枪及枪头，培养皿，振荡器，spx智能型生化培养箱(宁波江南仪器厂)、se402f电子称(奥豪仪器上海有限工司)、sw-cj-1f洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)、ldzx-5kbs立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，jsm-6380lv扫描电镜(日本电子公司)。
36.2实验方法
37.2.1黄海芽孢杆菌的分离与鉴定
38.采用土壤稀释法对海洋土壤中的细菌进行分离。取1g海洋淤泥用9ml无菌海水进行稀释，配制成10-2-10-5
的海泥悬液，取1.0ml涂布于lb固体平板上，37℃培养3d。挑选单菌落到新的lb固体平板上进行划线培养，对获得的单克隆菌株第二次划线培养，获得纯种菌株w202。采用革兰氏染色法以及扫描电镜电镜对菌体形态进行观察，结果如图1和图2，菌株w202为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，长为1-2μm，宽为0.3-0.5μm。
39.采用菌体直接扩增16s rdna的方法，pcr扩增引物选用16s rdna细菌通用引物，具体为27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’(seq id no.2)，1492r：5
’‑
ggttaccttgttacgactt-3’(seq id no.3)。25μl pcr反应体系：dna模板1μl，dntp(10mm)3μl，引物(10mm)各1μl，10xpcrbuffer7μl，mgso4(50mm)2μl，taq酶(5uμl-1
)0.5μl，超纯水9.5μl。pcr反应条件：95℃预变性5min，进入热循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃最终延伸10min。扩增后，取5μl的扩增样品在1％的琼脂糖凝胶上60v电压下进行电泳检测。回收目标dna片段，然后送往测序公司进行测序。测序结果如下(seq id no.1)：
40.gacttcaccccaatcatctgtcccaccttaggcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaacggttttatgggattggctaaacctcgcggtcttgcagccctttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcatcttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaaagccctatctctagggttgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagtgtcagtta
cagaccagaaagtcgccttcgccactggtgttcctccaaatatctacgcatttcaccgctacacttggaattccactttcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccacctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggcgccgccctattcgaacggcacttgttcttccctaacaacagagttttacgatccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtgatagccgaagccacctttcaaccttcccccatgcgggggtaggtgttatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctgatctcagggagcaagctcccatcgatccgctcgactgca。
41.将以上拼接的序列在ncbi数据库中进行blast比对，结合形态学鉴定结果明确菌株w202为黄海芽孢杆菌(bacillus marisflavi)。
42.2.2菌株w202的保藏
43.菌株w202的分类命名为黄海芽孢杆菌(bacillus marisflavi)，已于2016年08月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.12818。
44.3菌株的培养及性能验证
45.3.1菌株w202的生长曲线测定
46.将菌株按1％接种量接种于lb液体培养基活化24h，获得w208菌体母液。取100μl菌体母液接种于39个装有10ml lb液体培养基的试管中，37℃静置发酵培养，以未接菌的培养基为对照，分别在发酵0、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72、84、96h后，取样测定菌体od(600nm)值(3个重复管)，绘制菌体的生长曲线。结果如图3，显示菌株w202在2h时开始进入对数生长期，到24h时达到生长高峰(此时菌体od(600nm)值为1.24
±
0.01)，24h后开始进入稳定期，并逐渐进入衰亡期。
47.3.2菌株w202的适合生长温度测定
48.取100μl菌体母液接种于装有10ml lb液体培养基的试管中，于10、20、30、40、50℃静置发酵培养24h和48h后，测定发酵液od(600nm)值(3个重复管)。在确定菌株适合生长温度范围为30-40℃后，于31、33、35、37静置发酵培养24h后，测定发酵液od(600nm)值(3个重复管)，寻求最适生长温度。结果如图4，显示菌株w202在10℃或50℃下基本不生长，在20℃下生长缓慢，其适合生长温度为30-40℃，最适生长温度为33℃(菌体od(600nm)值为1.21
±
0.01)。
49.3.3菌株w202的适合生长ph测定
50.取100μl菌体母液接种于装有10mlph为3、4、5、6、7、8的lb液体培养基的试管中，静置发酵培养24h和48h后，测定发酵液od(600nm)值(3个重复管)。结果如图5，显示菌株w202在ph为3或4时生长缓慢，其适合生长ph为5-8，最适生长ph为7。
51.3.4菌株w202的反硝化性能测定
52.取对数生长期的菌株菌液，在离心机中7000rpm离心4min。之后用灭菌的1
×
pbs将菌体漂洗并重悬，然后接种至30ml灭菌的反硝化培养基中，并在150rpm、33℃条件下培养72h，测定培养液中的no
3-‑
n，nh
4+-n，no
2-‑
n，总氮(tn)及od(600nm)值。每个实验组设置3个
平行。结果如表1。
53.表1菌株w202的反硝化性能
54.氮源(mg/l)菌株w202处理去除率(％)no
3-‑
n0.1797.7nh
4+-n0.04-no
2-‑
n00tn0.2197.1od(600nm)1.04-55.从表1可以看出，菌株w202在以硝酸盐氮(no
3-‑
n)为唯一氮源的培养基中培养72h，仍能稳定生长(od(600nm)为1.04)，对硝酸盐氮的去除率高达97.7％，且在反硝化过程中有少量氨氮出现，导致tn值略高于no
3-‑
n，整体来看，该菌株能有效降解硝酸盐氮，具有反硝化能力。
56.3.5菌株w202的硝化性能测定
57.不同之处为：接种至30ml灭菌的硝化培养基中，其余同3.4。结果如表2。
58.表2菌株w202的硝化性能
59.氮源(mg/l)菌株w202处理去除率(％)no
3-‑
n0.06-nh
4+-n0.3593no
2-‑
n0.02-tn0.4391.4od(600nm)0.98-60.从表2可以看出，菌株w202在以氨氮(nh
4+-n)为唯一氮源的培养基中培养72h，仍能稳定生长(od(600nm)为0.98)，对氨氮的去除率高达93％，且在硝化过程有中间产物亚硝酸盐氮和硝酸盐出现，但是中间产物没有大量累积，是因为该菌株不仅具有硝化能力同时还具有反硝化能力，可以直接利用中间产物亚硝酸盐氮和硝酸盐进行反硝化反应，整体来看，该菌株具有较好的异养硝化好氧反硝化能力，有净化养殖废水的潜力。
61.实施例2黄海芽孢杆菌w202对畜禽养殖废水的处理效果
62.以实施例1中3.1-3.3最优培养条件制备的黄海芽孢杆菌w202发酵液经浓缩、冷冻干燥和粉碎后，获得菌数至od(600nm)值为1.25的固体菌剂，以该菌剂处理养殖废水为实验组，以相同菌数的枯草芽孢杆菌菌剂处理养殖废水为对照组，以未经任何菌剂处理的为空白组。
63.试验所用废水取自福建省新星种猪育种有限公司养猪场的养殖废水，具体氮、磷污染物浓度见表3的空白组，依据《污水综合排放标准》(gb 8978-1996)，供试废水中总氮、硝态氮、总磷、活性磷酸盐等无机盐含量超标，该类废水直接排放会导致水体严重富营养化，污染生态环境。分别采用黄海芽孢杆菌菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂处理选取的养殖废水，净化试验在27℃条件下于250ml锥形瓶中进行，每个锥形瓶中加入100ml废水和相应的微生物菌剂10g，于150r/min振荡12h，4000r/min离心15min，取上清，测定总氮、硝态氮、总磷、活性磷酸盐等氮、磷污染物浓度。
64.氮、磷污染物指标测定方法参照《水和废水监测分析方法》，总氮采用碱性过硫酸
钾法测定，硝态氮采用紫外分光光度法测定，总磷采用钼酸铵分光光度法测定，活性磷酸盐采用磷钼蓝法测定。实验结果如表3所示：
65.表3微生物菌剂对养殖废水的净化效果
[0066][0067]
从表3可以看出，本发明制备的黄海芽孢杆菌菌剂能够明显去除猪场养殖废水中的总氮、硝态氮、总磷、活性磷酸盐等氮、磷污染物，净化效果显著，也比常规采用的枯草芽孢杆菌菌剂处理养殖废水的效果优异，可见，本发明为畜禽养殖废水的净化处理提供了具有潜在应用价值的新菌株。
[0068]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种黄海芽孢杆菌(bacillusmarisflavi)w202，其特征在于，已于2016年08月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.12818。2.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的黄海芽孢杆菌w202的菌株或其发酵菌液。3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述发酵菌液中黄海芽孢杆菌w202的菌数od
600nm
值为0.6-1.3。4.一种如权利要求1所述的黄海芽孢杆菌w202或权利要求2-3任一项所述的菌剂在处理养殖废水中的应用。5.一种净化养殖废水的制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的黄海芽孢杆菌w202或权利要求2-3任一项所述的菌剂。6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述养殖废水为畜禽养殖废水。7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述畜禽养殖废水包括猪场养殖废水。

技术总结
本发明公开了一种黄海芽孢杆菌及其在处理养殖废水中的应用，属于废水净化技术领域。所述黄海芽孢杆菌W202已于2016年08月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.12818。本发明从海洋水域中分离得到一株黄海芽孢杆菌W202菌株，通过实验证实该菌株具有较好的异养硝化好氧反硝化能力，推测其可以作为净化养殖废水的新菌株；并结合对猪场养殖废水的处理实验，证实黄海芽孢杆菌W202能够去除养殖废水中的总氮、硝态氮、总磷、活性磷酸盐等氮、磷污染物，净化效果显著，为畜禽养殖废水的净化处理提供了新思路。思路。思路。


技术研发人员：徐庆贤 阮传清 黄菊青 黄婧 吴晓梅 吴飞龙 叶美锋
受保护的技术使用者：福建省农业科学院农业生物资源研究所
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/16