一种标记植物固醇的试剂及其应用和标记植物固醇的方法

1.本发明属于植物固醇检测技术领域，尤其涉及一种标记植物固醇的试剂及其应用和标记植物固醇的方法。


背景技术：

2.甾醇属于大分子醇类，是自然界中广泛存在的一类甾族化合物。自然界中的甾醇根据其来源分为动物甾醇、菌甾醇和植物甾醇；植物甾醇又称植物固醇，存在于几乎所有植物细胞中，对人体健康具有重要作用，如在抗癌、防治前列腺疾病、消炎、调节代谢、调节体内激素水平等方面。
3.研究报道，植物固醇是细胞膜筏的重要组分，与膜的稳定性密切相关，主要通过固醇含量的相对变化来维持膜的稳定性及影响膜筏的生物学功能。目前，对于固醇的研究重点主要集中在固醇的合成通路上，对固醇的标记鲜有报道；其次，由于显微镜分辨率的限制，导致固醇的可视化研究尚存在许多障碍，从而无法实现对植物细胞中固醇的分布及功能机制的探究。迄今为止，缺少一种直接高效且可视化标记植物固醇的方法，尤其缺少一种新的荧光探针或染料来标记固醇的方法，以期达到既不影响“胆固醇的可及性”，又可显示胆固醇在质膜上分布情况的效果。因此，如何提供一种在活体中快速且高效标记植物固醇的方法是亟需解决的问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种标记植物固醇的试剂及其应用和标记植物固醇的方法，该试剂能够快速且高效的对活体植物细胞中的固醇进行荧光标记，能够更直观的观察固醇在植物中的分布状态。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种标记植物固醇的试剂，包括胆固醇炔烃类似物、叠氮荧光化物、一价铜；
7.所述胆固醇炔烃类似物包括e-cholesterolalkyne、alkynecholesterol或27-alkynecholesterol；所述叠氮荧光化物包括fluoresceinazide,6-isomer、5-tamrapicolylazide或5-azido-fluorescein；
8.所述胆固醇炔烃类似物的浓度为20～50μm；所述叠氮荧光化物的浓度为5～15μm。
9.优选的，所述一价铜通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o制备得到。
10.优选的，所述抗坏血酸的工作浓度为0.8～1.2mm；所述cuso4·
5h2o的工作浓度为0.8～1.2mm。
11.优选的，所述胆固醇炔烃类似物为e-cholesterolalkyne。
12.优选的，所述叠氮荧光化物为fluoresceinazide,6-isomer。
13.本发明还提供了一种上述试剂在检测植物固醇中的应用。
14.本发明还提供了一种标记植物固醇的方法，利用上述试剂标记植物固醇，包括如
下步骤：
15.将胆固醇炔烃类似物对植物进行孵育后，加入叠氮荧光化物，在一价铜的催化下发生环加成反应，即得标记植物固醇后的植物。
16.优选的，所述环加成反应的时间为1～2h。
17.优选的，所述孵育的时间为10～14h。
18.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
19.本发明提供了一种标记植物固醇的试剂，该试剂中的胆固醇炔烃类似物实现了特异性地与植物固醇结合，同时还不影响植物的自然生化反应，所采用的叠氮荧光化物抗激光淬灭能力强，能够在一定程度上减轻光照毒害，实现在活体状态下长时间观察的效果，因此，本发明的试剂荧光标记活体植物细胞中的固醇快速、高效、稳定、特异性强，从而能够直观的观察固醇在植物中的分布状态。
20.本发明所述的标记植物固醇的方法，本发明通过生物正交反应标记植物固醇，该方法操作较为简便，可重复性高，且在植物生理学过程的揭示和细胞生命活动的研究中具有实际应用价值，并且能够为探究固醇相关生理学过程和功能研究时提供一类新的思路和科学的实验手段。
附图说明
21.图1左图和右图均为超分辨显微技术观察实施例1制备得到标记植物固醇的拟南芥幼苗中的固醇分布图像；
22.图2超分辨显微技术观察固醇抽提剂mβcd处理(左图)及阴性对照fluoresceinazide,6-isomer处理(右图)拟南芥幼苗的图像；
23.图3为超分辨显微技术观察实施例1所述方法标记后固醇(绿色通道)与膜筏标记蛋白atflot-mcherry(红色通道)的共定位图像，箭头所指为存在共定位区域；
24.图4：超分辨显微技术观察实施例1所述方法标记后固醇(绿色通道)与膜筏标记蛋白athir1-mcherry(红色通道)的共定位图像，箭头所指为存在共定位区域。
具体实施方式
25.本发明提供了一种标记植物固醇的试剂，包括胆固醇炔烃类似物、叠氮荧光化物、一价铜；
26.所述胆固醇炔烃类似物包括e-cholesterolalkyne、alkynecholesterol或27-alkynecholesterol；所述叠氮荧光化物包括fluoresceinazide,6-isomer、5-tamrapicolylazide或5-azido-fluorescein；
27.所述胆固醇炔烃类似物的浓度为20～50μm；所述叠氮荧光化物的浓度为5～15μm。
28.在本发明中，所述胆固醇炔烃类似物的浓度优选为25～45μm，所述叠氮荧光化物的浓度优选为7～12μm，本发明采用的胆固醇炔烃类似物的浓度能保证对植物中的固醇进行特异性标记，又不会对植物产生不利影响。本发明采用的叠氮荧光化物的浓度能够保证进入植物中的叠氮荧光化物的浓度发生完全的环加成反应，且不会对植物产生不利影响。所述一价铜通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o制备得到。所述抗坏血酸的工作浓度优选为0.8～1.2mm，进一步优选为0.9～1.1mm；所述cuso4·
5h2o的工作浓度优选为0.8～1.2mm，进一
步优选为0.9～1.1mm。其中配制上述浓度的抗坏血酸溶液或cuso4·
5h2o溶液均可采用水配制即可。本发明中所述胆固醇炔烃类似物或叠氮荧光化物能够透过植物细胞膜，作为进一步优选的实施方式，所述胆固醇炔烃类似物为e-cholesterolalkyne，所述叠氮荧光化物为fluorescein azide,6-isomer。本发明对上述的胆固醇炔烃类似物、叠氮荧光化物、抗坏血酸和cuso4·
5h2o的来源没有特殊限定，采用本领域公知的市售产品即可。
29.在本发明中，采用上述试剂不受植物中其他成分的干扰，从而能够高特异性地观察固醇在植物中的分布状态，故本发明提供了一种上述试剂在检测植物固醇中的应用。
30.本发明还提供了一种标记植物固醇的方法，利用上述试剂标记植物固醇，包括如下步骤：
31.将胆固醇炔烃类似物对植物进行孵育后，加入叠氮荧光化物，在一价铜的催化下发生环加成反应，即得标记植物固醇后的植物。
32.在本发明中，本发明利用生物正交反应标记植物固醇，生物正交反应是指一价铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应(cuaac反应)，该反应遵循点击化学的选择性原则，产率高，应用范围广，也不受ph影响，能在常温条件下的水中进行，甚至在活细胞中进行，具有化学选择性高，产率高，反应速度快，易于形成强有力的化学键等特点。
33.在本发明中，将胆固醇炔烃类似物对植物进行孵育。所述胆固醇炔烃类似物优选的包括e-cholesterolalkyne、alkynecholesterol或27-alkyne cholesterol，进一步优选为e-cholesterolalkyne，本发明所述胆固醇炔烃类似物能够透过植物细胞膜。所述植物优选的包括双子叶植物，进一步优选的，所述植物包括拟南芥。所述植物优选的采用4～5天的植物幼苗。所述孵育的时间优选为10～14h，进一步优选为11～13h，该孵育时间能够保证胆固醇炔烃类似物透过植物细胞膜。本发明采用胆固醇炔烃类似物对植物进行孵育，保证了固醇炔烃类似物透过细胞膜对固醇引入炔烃标记。
34.在本发明中，将胆固醇炔烃类似物对植物进行孵育后，加入叠氮荧光化物，在一价铜的催化下发生环加成反应。所述叠氮荧光化物优选的包括fluoresceinazide,6-isomer、5-tamrapicolylazide或5-azido-fluorescein，进一步优选为fluoresceinazide,6-isomer，本发明所述叠氮荧光化物能够透过植物细胞膜。所述一价铜通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o制备得到。所述环加成反应的时间优选为1～2h。本发明采用上述环加成反应时间能够达到高效标记植物固醇的目的。
35.在本发明中，上述环加成反应完成后，对标记植物固醇后的植物进行漂洗，所述漂洗采用无菌水或tris-hcl缓冲盐溶液(trisbuffered,saline，简称tbs)进行，以洗去植物体外未发生反应的叠氮荧光化物，从而便于后续检测植物固醇的分布状态。
36.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
37.在以下实施例中，所述e-cholesterolalkyne(echol)购自美国click chemistrytools(cct)公司。所述fluoresceinazide,6-isomer(fam azide,6-isomer)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
38.实施例1
39.一种标记植物固醇的方法，步骤如下：
40.(1)组织培养，获得5天大小的野生型，具体过程如下：
41.将所述野生型拟南芥columbia种子消毒，并播种于1/2ms固体生长培养基上，置于4℃春化24h后，放入培养温度为22℃，光照时间：黑暗时间为16h：8h的培养箱中进行培养，待5日，得到拟南芥幼苗；
42.其中，1/2ms固体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至5.8，加入5g琼脂，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌30min，放置于室温储存备用。
43.(2)使用e-cholesterolalkyne(echol)对步骤(1)得到的拟南芥幼苗进行孵育，使e-cholesterolalkyne透过细胞膜，对固醇引入炔烃标记，具体步骤如下：
44.将拟南芥幼苗10颗置于含有40μmechol的1/2ms液体生长培养基中，在50rpm/min的脱色摇床上，室温，过夜孵育12h。
45.其中所述e-cholesterolalkyne(echol)储备液配制：将echol溶于dmso配制适量浓度为2mm的储备液，分装后，置于-20℃储存。所述echol工作液配制：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入40μl的echol储备液，配制成40μm的echol工作液。
46.(3)使用fluorescein-azide，并在铜(i)的催化下发生环加成反应，具体过程为：
47.s1、漂洗未进入拟南芥幼苗细胞的echol：使用无菌水对经echol过夜孵育后的拟南芥幼苗洗涤两次，除去植株表面未进入植物细胞的echol，得到echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗；
48.s2、将echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗置入famazide,6-isomer的工作液中，同时加入4μl1mm抗坏血酸和4μl1mmcuso4·
5h2o溶液，将溶液充分混匀，室温避光进行环加成反应(cuaac反应)1.5h，得到标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
49.其中，所述fluoresceinazide,6-isomer的储备液配置：将fluorescein azide,6-isomer溶于dmso配制适量浓度为1mm的储备液，分装后，置于-20℃，避光储存。所述fluoresceinazide,6-isomer的工作液配置：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入20μl的fluoresceinazide,6-isomer储备液，配制成10μm的fluoresceinazide,6-isomer工作液。
50.活性一价铜催化剂储备液的配制：即通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o中的二价铜得到。将抗坏血酸溶于水配制为浓度为1mm的工作液；将cuso4·
5h2o溶于水配制为1mm的工作液。
51.(4)使用无菌水对步骤(3)得到的标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行漂洗3次，以除去未反应的叠氮荧光化物，得到漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
52.(5)对步骤(4)中得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行观察并成像。
53.本实施例的1/2ms液体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至5.8，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌20～40min，放置于室温储存备用。
54.实施例2
55.一种标记植物固醇的方法，步骤如下：
56.(1)组织培养，获得4天大小的野生型，具体过程如下：
57.将所述野生型拟南芥columbia种子消毒，并播种于1/2ms固体生长培养基上，置于4℃春化24h后，放入培养温度为22℃，光照时间：黑暗时间为16h：8h的培养箱中进行培养，待4日，得到拟南芥幼苗；
58.其中，1/2ms固体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至5.9，加入5g琼脂，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌40min，放置于室温储存备用。
59.(2)使用e-cholesterolalkyne(echol)对步骤(1)得到的拟南芥幼苗进行孵育，使e-cholesterolalkyne透过细胞膜，对固醇引入炔烃标记，具体步骤如下：
60.将拟南芥幼苗10颗置于含有30μmechol的1/2ms液体生长培养基中，在50rpm/min的脱色摇床上，室温，过夜孵育10h。
61.其中所述e-cholesterolalkyne(echol)储备液配制：将echol溶于dmso配制适量浓度为2mm的储备液，分装后，置于-20℃储存。所述echol工作液配制：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入30μl的echol储备液，配制成30μm的echol工作液。
62.(3)使用fluorescein-azide，并在铜(i)的催化下发生环加成反应，具体过程为：
63.s1、漂洗未进入拟南芥幼苗细胞的echol：使用无菌水对经echol过夜孵育后的拟南芥幼苗洗涤两次，除去植株表面未进入植物细胞的echol，得到echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗；
64.s2、将echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗置入famazide,6-isomer的工作液中，同时加入4μl0.8mm抗坏血酸和4μl0.8mmcuso4·
5h2o工作液，将溶液充分混匀，室温避光进行环加成反应(cuaac反应)1h，得到标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
65.其中，所述fluoresceinazide,6-isomer的储备液配置：将fluorescein azide,6-isomer溶于dmso配制适量浓度为1mm的储备液，分装后，置于-20℃，避光储存。所述fluoresceinazide,6-isomer的工作液配置：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入10μl的fluoresceinazide,6-isomer储备液，配制成5μm的fluoresceinazide,6-isomer工作液。
66.活性一价铜催化剂储备液的配制：即通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o中的二价铜得到。将抗坏血酸溶于水配制为浓度为0.8mm的工作液；将cuso4·
5h2o溶于水配制为0.8mm的工作液。
67.(6)使用tbs对步骤(3)得到的标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行漂洗4次，以除去未反应的叠氮荧光化物，得到漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
68.(7)对步骤(4)中得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行观察并成像。
69.本实施例的1/2ms液体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至5.9，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌20～40min，放置于室温储存备用。
70.实施例3
71.一种标记植物固醇的方法，步骤如下：
72.(1)组织培养，获得4天大小的野生型，具体过程如下：
73.将所述野生型拟南芥columbia种子消毒，并播种于1/2ms固体生长培养基上，置于4℃春化24h后，放入培养温度为22℃，光照时间：黑暗时间为16h：8h的培养箱中进行培养，待4日，得到拟南芥幼苗；
74.其中，1/2ms固体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至6.0，加入5g琼脂，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌40min，放置于室温储存备用。
75.(2)使用e-cholesterolalkyne(echol)对步骤(1)得到的拟南芥幼苗进行孵育，使e-cholesterolalkyne透过细胞膜，对固醇引入炔烃标记，具体步骤如下：
76.将拟南芥幼苗10颗置于含有50μmechol的1/2ms液体生长培养基中，在50rpm/min的脱色摇床上，室温，过夜孵育14h。
77.其中所述e-cholesterolalkyne(echol)储备液配制：将echol溶于dmso配制适量浓度为2mm的储备液，分装后，置于-20℃储存。所述echol工作液配制：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入50μl的echol储备液，配制成50μm的echol工作液。
78.(3)使用fluorescein-azide，并在铜(i)的催化下发生环加成反应，具体过程为：
79.s1、漂洗未进入拟南芥幼苗细胞的echol：使用无菌水对经echol过夜孵育后的拟南芥幼苗洗涤两次，除去植株表面未进入植物细胞的echol，得到echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗；
80.s2、将echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗置入famazide,6-isomer的工作液中，同时加入4μl1.2mm抗坏血酸和4μl1.2mmcuso4·
5h2o工作液，将溶液充分混匀，避光，室温进行环加成反应(cuaac反应)2h，得到标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
81.其中，所述fluoresceinazide,6-isomer的储备液配置：将fluorescein azide,6-isomer溶于dmso配制适量浓度为1mm的储备液，分装后，置于-20℃，避光储存。所述fluoresceinazide,6-isomer的工作液配置：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入30μl的fluoresceinazide,6-isomer储备液，配制成15μm的fluoresceinazide,6-isomer工作液。
82.活性一价铜催化剂储备液的配制：即通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o中的二价铜得到。将抗坏血酸溶于水配制为浓度为1.2mm的工作液；将cuso4·
5h2o溶于水配制为1.2mm的工作液。
83.(4)使用tbs对步骤(3)得到的标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行漂洗4次，以除去未反应的叠氮荧光化物，得到漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
84.(5)对步骤(4)中得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行观察并成像。
85.本实施例的1/2ms液体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至6.0，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌20～40min，放置于室温储存备用。
86.实施例4
87.一种标记植物固醇的方法，步骤如下：
88.(1)组织培养，获得4天大小的野生型，具体过程如下：
89.将所述野生型拟南芥columbia种子消毒，并播种于1/2ms固体生长培养基上，置于4℃春化24h后，放入培养温度为22℃，光照时间：黑暗时间为16h：8h的培养箱中进行培养，待4日，得到拟南芥幼苗；
90.其中，1/2ms固体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至6.0，加入5g琼脂，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌40min，放置于室温储存备用。
91.(2)使用e-cholesterolalkyne(echol)对步骤(1)得到的拟南芥幼苗进行孵育，使e-cholesterolalkyne透过细胞膜，对固醇引入炔烃标记，具体步骤如下：
92.将拟南芥幼苗10颗置于含有20μmechol的1/2ms液体生长培养基中，在50rpm/min
的脱色摇床上，室温，过夜孵育13h。
93.其中所述e-cholesterolalkyne(echol)储备液配制：将echol溶于dmso配制适量浓度为2mm的储备液，分装后，置于-20℃储存。所述echol工作液配制：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入20μl的echol储备液，配制成20μm的echol工作液。
94.(3)使用fluorescein-azide，并在铜(i)的催化下发生环加成反应，具体过程为：
95.s1、漂洗未进入拟南芥幼苗细胞的echol：使用无菌水对经echol过夜孵育后的拟南芥幼苗洗涤两次，除去植株表面未进入植物细胞的echol，得到echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗；
96.s2、将echol孵育并漂洗后的拟南芥幼苗置入famazide,6-isomer的工作液中，同时加入4μl1.2mm抗坏血酸和4μl1.2mmcuso4·
5h2o工作液，将溶液充分混匀，避光，室温进行环加成反应(cuaac反应)2h，得到标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
97.其中，所述fluoresceinazide,6-isomer的储备液配置：将fluorescein azide,6-isomer溶于dmso配制适量浓度为1mm的储备液，分装后，置于-20℃，避光储存。所述fluoresceinazide,6-isomer的工作液配置：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入30μl的fluoresceinazide,6-isomer储备液，配制成15μm的fluoresceinazide,6-isomer工作液。
98.活性一价铜催化剂储备液的配制：即通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o中的二价铜得到。将抗坏血酸溶于水配制为浓度为1.2mm的工作液；将cuso4·
5h2o溶于水配制为1.2mm的工作液。
99.(4)使用tbs对步骤(3)得到的标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行漂洗4次，以除去未反应的叠氮荧光化物，得到漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗。
100.(5)对步骤(4)中得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗进行观察并成像。
101.本实施例的1/2ms液体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至6.0，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌20～40min，放置于室温储存备用。
102.实施例5
103.一种标记植物固醇的试剂，包括e-cholesterolalkyne、fluorescein azide,6-isomer、一价铜。
104.所述e-cholesterolalkyne(echol)储备液配制：将echol溶于dmso配制适量浓度为2mm的储备液，分装后，置于-20℃储存。
105.所述echol工作液配制：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入40μl的echol储备液，配制成40μm的echol工作液。
106.所述fluoresceinazide,6-isomer的储备液配置：将fluorescein azide,6-isomer溶于dmso配制适量浓度为1mm的储备液，分装后，置于-20℃，避光储存。
107.所述fluoresceinazide,6-isomer的工作液配置：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入20μl的fluoresceinazide,6-isomer储备液，配制成10μm的fluoresceinazide,6-isomer工作液。
108.活性一价铜催化剂储备液的配制：即通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o中的二价铜得到。将抗坏血酸溶于水配制为浓度为1mm的工作液；将cuso4·
5h2o溶于水配制为1mm的工作液。
109.1/2ms液体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至5.8～6.0，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌20～40min，放置于室温储存备用。
110.试验例1
111.为了证明本发明的标记植物固醇方法的准确性，采用固醇抽提剂mβcd处理，得到固醇抽提剂mβcd处理后的拟南芥幼苗，观察固醇被抽提或减少后使用本发明标记植物固醇方法的效果。
112.制备固醇抽提剂mβcd处理后的拟南芥幼苗具体方法与实施例1的区别在于：步骤(2)中，使用mβcd与echol共孵育：将拟南芥幼苗10颗置于含有10mmmβcd和40μmechol的1/2ms液体生长培养基中，在50rpm/min的脱色摇床上，室温，过夜孵育12h。其中，mβcd储备液配制：0.246g的mβcd粉末溶于1ml的ddh2o中，配制浓度为200mm的储存液，置于-20℃储存；mβcd工作液配制：使用前，吸取10μl的mβcd储存液加入到1ml1/2ms液体培养基中，得到10mmmβcd的工作液。其余步骤与实施例1相同。
113.采用fluoresceinazide,6-isomer处理的拟南芥幼苗作为阴性对照，具体方法为：
114.(1)将所述野生型拟南芥columbia种子消毒，并播种于1/2ms固体生长培养基上，置于4℃春化24h后，放入培养温度为22℃，光照时间：黑暗时间为16h：8h的培养箱中进行培养，待5日，得到拟南芥幼苗；
115.其中，1/2ms固体生长培养基配制步骤为：将1.108g的ms盐溶解于350ml双蒸水或三蒸水中，彻底溶解后，用1m的koh将ph值调至5.8，加入5g琼脂，再加入双蒸水或三蒸水至500ml，混匀后高压高温灭菌30min，放置于室温储存备用。
116.(2)使用1/2ms液体生长培养基对步骤(1)得到的拟南芥幼苗，在50rpm/min的脱色摇床上，室温，过夜孵育12h。
117.(3)将步骤(2)孵育后的拟南芥幼苗置入famazide,6-isomer的工作液中，室温孵育1.5h，得到famazide,6-isomer孵育后的拟南芥幼苗。
118.其中，所述fluoresceinazide,6-isomer的储备液配置：将fluorescein azide,6-isomer溶于dmso配制适量浓度为1mm的储备液，分装后，置于-20℃，避光储存。所述fluoresceinazide,6-isomer的工作液配置：吸取2ml1/2ms液体生长培养基，加入20μl的fluoresceinazide,6-isomer储备液，配制成10μm的fluoresceinazide,6-isomer工作液。
119.(4)使用无菌水对步骤(3)得到的famazide,6-isomer孵育后的拟南芥幼苗进行漂洗3次，得到漂洗后的拟南芥幼苗。
120.(5)对步骤(4)中得到的漂洗后的拟南芥幼苗进行观察并成像。
121.将实施例1制备得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗、mβcd处理后的拟南芥幼苗、以及阴性对照组得到的漂洗后的拟南芥幼苗，通过结构光照明显微镜(sim)进行观察并成像，具体步骤如下：
122.(1)制备观察样本：在载玻片上滴加无菌水，并分别将实施例1制备得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗、mβcd处理后的拟南芥幼苗、以及阴性对照组得到的漂洗后的拟南芥幼苗下置于载玻片上，盖上盖玻片；
123.(2)样品观察：采用deltavisiontmomxsr超分辨率显微镜进行成像，观察时，滴加镜油，设置参数，其中激发波长设置为488nm，收集波长设置为510～560nm；曝光时间为
80ms，激光强度选择5％，readout为fast272mhz，选用tirfm-sim模式进行观察，对荧光标记后的拟南芥进行成像，连续采集20帧图像并保留观察结果和备份；
124.(3)图像导出：将拍摄获得图像进行omxsireconstruction处理，即对图像点进行叠加；接着进行deconvolution处理，即对图像进行反卷积，获得较为清晰的图像，结果见图1～图2所示。
125.由图1的结果表明，本发明的标记方法可以实现对植物活体细胞中的固醇标记。
126.由图2的结果表明，使用固醇抽提剂mβcd处理后，细胞中几乎没有被标记，表明本发明标记植物固醇的方法的准确性。而阴性对照组结果发现未能实现对细胞中固醇的标记，与本发明的方法相比，表明本发明标记植物固醇方法的可行性。
127.试验例2
128.为了进一步说明本发明标记植物固醇方法的准确性，使用分别用红色荧光标记膜筏蛋白的atflot1-mcherry和athir1-mcherry的转基因拟南芥材料，所述红色荧光标记膜筏蛋白的atflot1-mcherry和athir1-mcherry的转基因拟南芥材料按照lvx等公开的方法制备(lvx,jingy,xiaoj,etal.membranemicrodomainsandthecytoskeletonconstrainathir1dynamicsand facilitatetheformationofanathir1-associatedimmunecomplex[j].theplant journal,2017,90(1):3.)。
[0129]
将实施例1制备得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗、红色荧光标记的atflot1-mcherry转基因拟南芥材料和红色荧光标记的athir1-mcherry转基因拟南芥材料分别进行双通道观察并成像的具体步骤为：
[0130]
(1)制备观察样本：在载玻片上滴加无菌水，并将实施例1制备得到的漂洗并标记植物固醇后的拟南芥幼苗、红色荧光标记的atflot1-mcherry转基因拟南芥材料和红色荧光标记的athir1-mcherry转基因拟南芥材料分别置于载玻片上，盖上盖玻片；
[0131]
(2)样品观察：采用deltavisiontmomxsr超分辨率显微镜进行双通道成像，观察时，滴加镜油，设置参数，其中绿光通道激发波长设置为488nm，收集波长设置为510～560nm；曝光时间为30ms，激光强度选择5％，readout为fast272mhz；红光通道激发波长设置为568nm，收集波长设置为590～640nm；曝光时间为30ms，激光强度选择20％，readout为fast272mhz；选用tirfm-sim模式进行双通道观察并成像，连续采集20帧图像并保留观察结果和备份；
[0132]
(3)图像导出：将拍摄的图像进行omxsireconstruction处理，即对图像点进行叠加；接着进行deconvolution处理，即对图像进行反卷积，获得较为清晰的图像。结果见图3～图4所示。
[0133]
图3～图4结果表明，本发明标记植物固醇方法得到的标记植物固醇的拟南芥幼苗与atflot1-mcherry、athir1-mcherry均存在有共定位，即与存有大量固醇成分的膜筏区域存在共定位，表明echol标记成分为固醇。
[0134]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种标记植物固醇的试剂，其特征在于，包括胆固醇炔烃类似物、叠氮荧光化物、一价铜；所述胆固醇炔烃类似物包括e-cholesterolalkyne、alkynecholesterol或27-alkynecholesterol；所述叠氮荧光化物包括fluoresceinazide,6-isomer、5-tamrapicolylazide或5-azido-fluorescein；所述胆固醇炔烃类似物的浓度为20～50μm；所述叠氮荧光化物的浓度为5～15μm。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述一价铜通过抗坏血酸还原cuso4·
5h2o制备得到。3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述抗坏血酸的工作浓度为0.8～1.2mm；所述cuso4·
5h2o的工作浓度为0.8～1.2mm。4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述胆固醇炔烃类似物为e-cholesterolalkyne。5.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述叠氮荧光化物为fluoresceinazide,6-isomer。6.根据权利要求1～5任意一项所述试剂在检测植物固醇中的应用。7.一种标记植物固醇的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任意一项所述试剂标记植物固醇，包括如下步骤：将胆固醇炔烃类似物对植物进行孵育后，加入叠氮荧光化物，在一价铜的催化下发生环加成反应，即得标记植物固醇后的植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述环加成反应的时间为1～2h。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为10～14h。

技术总结
本发明提供了一种标记植物固醇的试剂及其应用和标记植物固醇的方法，属于植物固醇检测技术领域，该试剂中的胆固醇炔烃类似物实现了特异性地与植物固醇结合，同时还不影响植物的自然生化反应，所采用的叠氮荧光化物抗激光淬灭能力强，能够在一定程度上减轻光照毒害，实现在活体状态下长时间观察的效果，因此，本发明的试剂荧光标记活体植物细胞中的固醇快速、高效、稳定、特异性强，从而能够直观的观察固醇在植物中的分布状态。本发明所述的标记植物固醇的方法，通过生物正交反应标记植物固醇，该方法操作较为简便，可重复性高。可重复性高。可重复性高。


技术研发人员：崔亚宁 徐昌文 林金星
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/8/16