一种用于大肠杆菌O157:H7检测的基于背景消除的比率荧光探针及制备方法

一种用于大肠杆菌o157:h7检测的基于背景消除的比率荧光探针及制备方法
技术领域
1.本发明属于食品安全技术领域，具体涉及一种用于大肠杆菌o157:h7检测的基于背景消除的比率荧光探针及制备方法。


背景技术：

2.细菌性传染病已成为全球公共卫生的主要问题。大肠杆菌o157:h7于1982年被首次确认为致病菌，为革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，是引起人的出血性腹泻和肠炎的主要致病因素。据统计，全世界每年约有280万人感染大肠杆菌o157:h7。感染后，引起的症状和疾病包括腹部痉挛、水样腹泻、溃疡性结肠炎、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜等，严重时甚至可导致死亡。此外，即使是低浓度的感染也会对公众健康造成高风险。因此，建立灵敏、快速的大肠杆菌o157:h7检测方法对促进食品质量安全具有重要意义。
3.目前，大部分检测机构对致病菌的检测仍然以传统的细菌培养和菌落计数为主。然而，这种传统检测技术由于操作繁琐且检测周期长，易导致治疗和诊断的延误，无法满足对大肠杆菌o157:h7的快速筛查的要求。因此，各种快速、高灵敏和特异性强的检测方法被研究者提出。如分子生物学检测方法以及免疫学方法等。其中，分子生物学检测方法主要包括聚合酶链式反应（pcr）、核酸等温扩增技术以及核酸酶辅助信号放大等。相较于传统的微生物培养法，其极大限度的缩短了鉴定时间，但这些方法需要复杂的核酸序列设计以确保高灵敏度和准确性。实际操作中，由于交叉污染和非特异性扩增，实验极易产生假阳性结果，这就需要重新设计探针和更换试剂，严重阻碍了其应用。免疫学检测具有简单、快速、高灵敏、高特异性等优点。其中酶联免疫吸附法、免疫磁分离技术和侧流免疫层析技术是免疫学检测的三种常用形式。但作为其特异性识别原件的抗体价格昂贵，受外界环境影响大，限制了其进一步的推广。因此，迫切需要开发新的技术，满足快速、定量、灵敏度、特异性和经济性的全方位性能要求。
4.为了满足当前的检测需求并解决上述限制，已经开发了各种新的识别策略，包括荧光方法、比色方法和电化学方法等。其中，荧光方法由于具有灵敏度高、检测耗时短、特异性强等优点，已被广泛应用于食源性致病菌检测。传统的荧光团包括6-羧基荧光素（fam）、罗丹明b和cy5，由于存在光漂白、对ph敏感、量子产率低、激发光谱窄以及修饰过程繁琐等缺陷，其应用范围受到一定限制。大多数高性能量子点相较于传统荧光染料具有易合成、荧光特性稳定、宽光谱激发响应等优良特性，但其含有的金属元素（如铅、镉和砷）具有生物毒性。因此，开发高效稳定、生物相容性良好、廉价的荧光标记物十分必要。此外，基于单峰的荧光检测易受到食品基质中非目标物质的干扰，会降低检测精度以及食品污染物的动态响应范围。为了降低这种外界因素影响，建立有效的污染预警机制，避免食品介质中的假阳性输出，响应性比率荧光分析平台显示出了巨大的应用前景。然而，比率荧光虽然在检测时具有良好的内参校正效果，但其通常以菌为载体，通过拉近荧光供体和受体的距离来实现信
号转换。这导致当样品基质中没有目标菌出现时，较小的反应体系仍能触发两个基团的能量转移，造成检测背景信号过高等不利影响。因此，亟需开发简便的降低荧光背景策略以进一步提高比率荧光平台检测食源性致病菌时的灵敏度和线性响应范围。此外，目前比率荧光检测策略大多以万古霉素为特异性识别原件，实现对革兰氏阳性菌的检测，利用阴性菌识别原件的比率检测方法还鲜有报道。


技术实现要素：

5.为了实现对大肠杆菌o157:h7的简单、快速、高精准、高灵敏检测，本发明提供一种用于大肠杆菌o157:h7检测的基于背景消除的比率荧光探针。
6.一种基于背景消除的比率荧光探针包括作为荧光供体的量子点复合物、作为荧光受体的碳点探针和消除背景干扰的磁性碳纳米管复合载体；所述量子点复合物为多粘菌素b修饰的氮硫共掺石墨烯量子点；所述多粘菌素b为多粘菌素b硫酸盐，cas号为1405-20-5；所述碳点探针为适配体修饰的黄色碳点；所述适配体的dna序列如seq id no:1所示，所述适配体的5’端用羧基修饰；所述磁性碳纳米管复合载体为羰基铁粉修饰的多壁碳纳米管；所述羰基铁粉的cas号为7439-89-6；所述多壁碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管，cas号为1333-86-4；当被测物中未存在大肠杆菌o157:h7时，检测体系中的碳点探针被磁性碳纳米管复合载体吸附，量子点复合物的荧光不被猝灭；当被测物中存在大肠杆菌o157:h7时，检测体系中的量子点复合物和碳点探针同时捕获目标菌，荧光供体和荧光受体的空间距离被拉近，从而发生荧光共振能量转移，使得量子点复合物的荧光猝灭，碳点探针的荧光增强。
7.一种基于背景消除的比率荧光探针的制备操作步骤如下：（1）制备量子点复合物（1.1）制备氮硫共掺石墨烯量子点固体（1.1.1）将1.0g柠檬酸和0.3g l-半胱氨酸均匀混合，油浴加热至200℃，当反应物颜色由淡黄色变为橙色时，停止加热，自然冷却至室温，获得橙色产物；（1.1.2）将橙色产物溶解到10ml超纯水中，获得氮硫共掺石墨烯量子点原液；（1.1.3）将氮硫共掺石墨烯量子点原液冷冻干燥12h，制得氮硫共掺石墨烯量子点固体；（1.2）制得量子点复合物（1.2.1）将1mg氮硫共掺石墨烯量子点固体溶解在10ml去离子水中，超声10min，得到分散溶液；（1.2.2）向分散溶液中加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和5mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），在室温条件下搅拌2h，得到活化的量子点溶液；（1.2.3）向活化的量子点溶液中加入3mg多粘菌素b，在室温条件下以200rpm的转速搅拌7h，得到量子点复合物；氮硫共掺石墨烯量子点的最大发射波长为418nm、zeta电位为6.77mv；当量子点复
合物的最大发射波长偏移至422nm，zeta电位变为17.37mv时，表示量子点复合物中多粘菌素b成功修饰到氮硫共掺石墨烯量子点上；（2）制备碳点探针（2.1）制备黄色碳点固体（2.1.1）将216mg邻苯二胺加入到30ml去离子水中，震荡混合均匀，得到混合液；（2.1.2）将混合液在160℃下加热4h，自然冷却至室温，在9289
×
g离心力下离心12min去除杂质，获得反应液；（2.1.3）将反应液加入到分子透过量为3000da的透析袋中，去离子水透析24h，得到透析液；（2.1.4）将透析液冷冻干燥12h，制得黄色碳点固体；（2.2）制得碳点探针（2.2.1）在300μl浓度1μm的适配体溶液中加入50μl浓度4mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶液和50μl浓度4mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）溶液，在室温条件下以180rpm的转速孵育30min，获得活化的适配体溶液；（2.2.2）将5mg黄色碳点固体溶解于5ml去离子水中，加入活化的适配体溶液，在室温条件下以180rpm的转速孵育2.5h，得到碳点探针；黄色碳点的最大发射波长为562nm、zeta电位为-4.01mv；当碳点探针的最大发射波长偏移至566nm，zeta电位变为-7.84mv时，表示适配体被修饰在黄色碳点的表面，成功构建了碳点探针；（3）制备磁性碳纳米管复合载体（3.1）称量1.5mg多壁碳纳米管于玻璃瓶中，加入1.5ml浓度0.1m、ph值5.5的吗啉乙磺酸一水合物酸性溶液，充分振荡，得到多壁碳纳米管溶解液；（3.2）向多壁碳纳米管溶解液中加入200μl浓度6.2mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶液和200μl浓度4.6mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）溶液，在室温下孵育2h，得到活化的多壁碳纳米管溶液；（3.3）在活化的多壁碳纳米管溶液中加入3mg羰基铁粉，超声处理1h，于85℃烘箱干燥20min，得到磁性碳纳米管复合载体；多壁碳纳米管无磁性、zeta电位为-23.01mv，羰基铁粉有磁性、zeta电位为4.25mv；当磁性碳纳米管复合载体置于磁力架上，在磁力的作用下能被吸附到离心管管壁，表明其具有磁性；磁性碳纳米管复合载体的zeta电位为-2.38mv，介于-23.01mv与4.25mv之间，证明磁性碳纳米管复合载体是多壁碳纳米管和羰基铁粉的结合物；综上表征，证明磁性碳纳米管复合载体的成功制备。
8.一种基于背景消除的比率荧光探针在大肠杆菌o157:h7检测中的应用，其具体操作步骤如下：取400μl待检液于1.5ml已灭菌的离心管中，向其中加入60μl的碳点探针及100μg的磁性碳纳米管复合载体，在37℃条件下孵育70min，得到复合溶液；将复合溶液置于磁力架，静止1min，取上清液，得到磁分离溶液；向磁分离溶液中加入40μl的量子点复合物，在37℃条件下孵育20min，得到待测液；取200μl待测液于石英比色皿中，设定荧光分光光度计的激发波长为355nm，测定待测液于422nm与566nm处的荧光强度值。
9.本发明方法的检测分析原理在于：
以量子点复合物为能量供体，碳点探针为能量受体，当两者同时捕获大肠杆菌o157:h7时，供、受体分子的空间距离被拉近，随后fret“开启”，能量从供体荧光团转移到受体荧光团，并导致荧光双信号可逆变化；另外，体系中未与目标菌结合的多余碳点探针中的适配体由于π-π堆积作用被吸附在磁性碳纳米管复合载体上，通过磁选被高效分离，从而消除背景噪声干扰，实现对大肠杆菌o157:h7的简单、灵敏、快速检测。
10.本发明的有益技术效果体现在以下方面：（1）本发明采用的比率荧光策略与单发射荧光法相比，具有内置的自校准功能，避免了各种靶标无关因素的干扰，减少了假阳性结果的输出，从而实现了更高的准确检测灵敏度和更宽的动态线性范围。荧光共振能量转移（fret）机制是比率荧光的有效策略，它通常由两个荧光团组成二联体，在10nm以内的距离形成能量供体-受体对，允许能量从供体荧光团转移到受体荧光团，并导致双发射强度的偏移，从而通过启用或禁用fret过程来实现对食品污染物的比率响应。然而，当样品基质中没有目标菌存在时，因较小的反应体系而触发的两个基团间的能量转移，亦可能造成检测背景信号过高等不利影响。为了解决现有技术的此种弊端，本发明利用磁性碳纳米管复合载体搭建磁分离平台。其中，多壁碳纳米管由于具有较大的比表面积和表面π键，可作为纳米载体，基于非共价作用吸附大量的生物分子（如碳点探针）。通过掺杂羰基铁粉赋予其磁性后，可进一步实现多余荧光受体探针（碳点探针）的高效分离，而固定在大肠杆菌o157:h7上的荧光受体探针（碳点探针）则留在体系中，达到了高精准的灵敏检测目的。
11.（2）本发明合成的磁性碳纳米管复合载体可替代免疫磁珠，成为食品基质抗干扰的有效手段。此外，与传统磁珠相比，多壁碳纳米管中呈六角形网格状分布的碳原子间形成了高度离域化的π键。这种微观上的独特性使多壁碳纳米管可以根据π-π堆积作用吸附大量的单链dna核酸适配体，而无需提前对适配体与多壁碳纳米管进行繁琐、昂贵的化学偶联，从而实现灵活的吸附-解吸附切换，作为可调控的信号开关，提高检测传感器信噪比。
12.（3）本发明方法中使用的氮硫共掺石墨烯量子点及黄色碳点与传统荧光材料相比，具有良好的生物相容性、可调光致发光、高化学稳定性、易于表面功能化等优势。此外，氮硫共掺石墨烯量子点的石墨烯结构中氮、硫的掺入使其具有良好的光致发光行为和较高的荧光量子产率，且l-半胱氨酸分子和石墨烯核之间的交联有效地防止了石墨烯量子点的聚集，使其成为卓越的荧光分析工具。而黄色碳点表面丰富的氨基基团不仅可以提高其荧光，还为羧基化适配体探针提供了共价结合位点。
13.（4）本发明以多粘菌素b及适配体作为分子识别元件，在大肠杆菌表面分别表现出广谱性和高特异性的结合。其中，多粘菌素b是从多粘芽胞杆菌中分离出来的阳离子环状多肽，作为一种治疗革兰氏阴性菌的抗生素，多粘菌素b可在低浓度下靶向革兰氏阴性菌外膜的脂多糖。而适配体是单链dna或rna寡核苷酸，可以识别和结合特定的目标，具有廉价、易于合成和修饰、良好的可重复性等优势。
14.（5）本发明构建了一个新的基于fret效应的比率型荧光生物传感器。由于氮硫共掺石墨烯量子点的荧光发射光谱与黄色碳点的激发光谱重叠，该传感器以多粘菌素b修饰的氮硫共掺石墨烯量子点为能量供体，适配体修饰的黄色碳点为能量受体，巧妙的以菌为载体拉近两者的距离，实现对大肠杆菌o157:h7的精确可靠的检测。
15.（6）本发明利用多粘菌素b及适配体替代抗体作为识别元件，检测成本约降低75%。
同时，氮硫共掺石墨烯量子点、黄色碳点及磁性碳纳米管复合载体的合成原料价格低廉，进一步降低了检测成本，有利于市场推广。
附图说明
16.图1为本发明中基于背景消除的比率荧光探针的制备方法及检测分析原理图；图2为本发明中氮硫共掺石墨烯量子点与多粘菌素b共价偶联前后的荧光光谱图；图3为本发明中氮硫共掺石墨烯量子点和量子点复合物的zeta电位；图4为本发明中黄色碳点与适配体共价偶联前后的荧光光谱图；图5为本发明中黄色碳点和碳点探针的zeta电位；图6为本发明中磁性碳纳米管复合载体的水溶液置于磁力架前后的照片；图7为本发明中多壁碳纳米管、羰基铁粉及磁性碳纳米管复合载体的zeta电位；图8为本发明实施例2中比率荧光生物传感器检测大肠杆菌o157:h7的荧光光谱图；图9为本发明实施例2中比率荧光生物传感器检测大肠杆菌o157:h7的线性关系图；图10为本发明实施例3中检测方法的特异性图。
具体实施方式
17.下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但不是对本发明的限制。
18.除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
19.以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
20.以下实施例中，多粘菌素b、柠檬酸、l-半胱氨酸购买于上海生工生物工程股份有限公司；多壁碳纳米管购于南京先丰纳米材料科技有限公司；羰基铁粉购于上海麦克林生化科技有限公司；邻苯二胺、吗啉乙磺酸 一水合物购于阿拉丁试剂有限公司；n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐购于美国sigma-aldrich公司；ph值7.4、浓度0.1m的pbs溶液购买于上海生工生物工程股份有限公司；适配体的序列参考文献“an aptamer-exonuclease iii (exo iii)
–
assisted amplification-based lateralflow assay for sensitive detection ofescherichia colio157:h7 in milk”，购买于上海生工生物工程股份有限公司。
21.本发明基于背景消除的比率荧光探针的制备方法及其检测原理如图1所示。
22.一种基于背景消除的比率荧光探针包括作为荧光供体的量子点复合物、作为荧光受体的碳点探针和消除背景干扰的磁性碳纳米管复合载体；所述量子点复合物为多粘菌素b修饰的氮硫共掺石墨烯量子点；所述多粘菌素b为多粘菌素b硫酸盐，cas号为1405-20-5；所述碳点探针为适配体修饰的黄色碳点；所述适配体的dna序列如seq id no:1所示，所述适配体的5’端用羧基修饰；
所述磁性碳纳米管复合载体为羰基铁粉修饰的多壁碳纳米管；所述羰基铁粉的cas号为7439-89-6；所述多壁碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管，cas号为1333-86-4；当被测物中未存在大肠杆菌o157:h7时，检测体系中的碳点探针被磁性碳纳米管复合载体吸附，量子点复合物的荧光不被猝灭；当被测物中存在大肠杆菌o157:h7时，检测体系中的量子点复合物和碳点探针同时捕获目标菌，荧光供体和荧光受体的空间距离被拉近，从而发生荧光共振能量转移，使得量子点复合物的荧光猝灭，碳点探针的荧光增强。
23.实施例1一种用于大肠杆菌o157:h7检测的基于背景消除的比率荧光探针的制备操作步骤如下：（1）制备量子点复合物（1.1）制备氮硫共掺石墨烯量子点固体（1.1.1）将1.0g柠檬酸和0.3g l-半胱氨酸均匀混合，油浴加热至200℃，当反应物颜色由淡黄色变为橙色时，停止加热，自然冷却至室温，获得橙色产物；（1.1.2）将橙色产物溶解到10ml超纯水中，获得氮硫共掺石墨烯量子点原液；（1.1.3）将氮硫共掺石墨烯量子点原液冷冻干燥12h，制得氮硫共掺石墨烯量子点固体；（1.2）制得量子点复合物（1.2.1）将1mg氮硫共掺石墨烯量子点固体溶解在10ml去离子水中，超声10min，得到分散溶液；（1.2.2）向分散溶液中加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）和5mg n-羟基琥珀酰亚胺（nhs），在室温条件下搅拌2h，得到活化的量子点溶液；（1.2.3）向活化的量子点溶液中加入3mg多粘菌素b，在室温条件下以200rpm的转速搅拌7h，得到量子点复合物。
24.参见图2，氮硫共掺石墨烯量子点的最大发射波长为418nm，量子点复合物的最大发射波长为422nm，发射波长的红移证明了多粘菌素b和氮硫共掺石墨烯量子点的成功偶联；此外，参见图3，氮硫共掺石墨烯量子点的zeta电位为6.77mv，量子点复合物的zeta电位为17.37mv，zeta电位测试结果表明，多粘菌素b被成功地修饰在氮硫共掺石墨烯量子点的表面；以上结果表明，成功构建了量子点复合物。
25.（2）制备碳点探针（2.1）制备黄色碳点固体（2.1.1）将216mg邻苯二胺加入到30ml去离子水中，震荡混合均匀，得到混合液；（2.1.2）将混合液在160℃下加热4h，自然冷却至室温，在9289
×
g离心力下离心12min去除杂质，获得反应液；（2.1.3）将反应液加入到分子透过量为3000da的透析袋中，去离子水透析24h，得到透析液；（2.1.4）将透析液冷冻干燥12h，制得黄色碳点固体。
26.（2.2）制得碳点探针
（2.2.1）在300μl浓度1μm的适配体溶液中加入50μl浓度4mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶液和50μl浓度4mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）溶液，在室温条件下以180rpm的转速孵育30min，获得活化的适配体溶液；（2.2.2）将5mg黄色碳点固体溶解于5ml去离子水中，加入活化的适配体溶液，在室温条件下以180rpm的转速孵育2.5h，得到碳点探针。
27.参见图4，黄色碳点的最大发射波长为562nm，碳点探针的最大发射波长为566nm，发射波长的红移证明了适配体和黄色碳点的成功偶联；此外，参见图5，黄色碳点的zeta电位为-4.01mv，碳点探针的zeta电位为-7.84mv，zeta电位测试结果表明，适配体被成功地修饰在黄色碳点的表面；以上结果表明，成功构建了碳点探针。
28.（3）制备磁性碳纳米管复合载体（3.1）称量1.5mg多壁碳纳米管于玻璃瓶中，加入1.5ml浓度0.1m、ph值5.5的吗啉乙磺酸一水合物酸性溶液，充分振荡，得到多壁碳纳米管溶解液；（3.2）向多壁碳纳米管溶解液中加入200μl浓度6.2mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶液和200μl浓度4.6mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）溶液，在室温下孵育2h，得到活化的多壁碳纳米管溶液；（3.3）在活化的多壁碳纳米管溶液中加入3mg羰基铁粉，超声处理1h，于85℃烘箱干燥20min，得到磁性碳纳米管复合载体。
29.参见图6，磁性碳纳米管复合载体在离心管中为均匀稳定的分散体系，将其置于磁力架上，在磁力的作用下磁性碳纳米管复合载体被吸附到离心管管壁，证明了羰基铁粉的成功掺杂；此外，参见图7，多壁碳纳米管的zeta电位为-23.01mv，羰基铁粉的zeta电位为4.25mv，磁性碳纳米管复合载体的zeta电位为-2.38mv，zeta电位测试结果表明，磁性碳纳米管复合载体是多壁碳纳米管和羰基铁粉的结合物；综上表征，证明磁性碳纳米管复合载体已成功制备。
30.实施例2检测方程的建立，具体操作步骤如下：（1）将大肠杆菌o157:h7于lb肉汤中培养12h至对数生长后期，取1ml移入已灭菌的离心管中，5000
×
g离心5min，弃去上清液，重悬于等体积浓度为0.1m、ph值7.4的无菌pbs缓冲液中得到菌悬液；梯度稀释菌悬液，获得大肠杆菌o157:h7终浓度分别为101、102、103、104、105、106、107cfu/ml的含菌待检液；（2）分别取400μl上述含菌待检液于1.5ml已灭菌的离心管中，向其中加入60μl的碳点探针及100μg的磁性碳纳米管复合载体，在37℃条件下孵育70min，得到七个复合溶液；所述碳点探针由实施例1所制备；所述磁性碳纳米管复合载体由实施例1所制备；（3）将七个复合溶液分别置于磁力架上，静止1min，取上清液，得到七个磁分离溶液；（4）向七个磁分离溶液中分别加入40μl的量子点复合物，在37℃条件下孵育20min，得到对应的七个待测液；所述量子点复合物由实施例1所制备；（5）分别取200μl七个待测液于石英比色皿中，设定荧光分光光度计的激发波长为
355nm，测定待测液于422nm与566nm处的荧光强度值，结果见附图8；以f
566
/f
422
为纵坐标y，以大肠杆菌o157:h7菌液浓度（cfu/ml）的对数值为横坐标x绘制标准曲线，结果见图9，求出检测方程：y=0.1531x-0.0603，相关系数为0.9979，检出限为2.6cfu/ml；所述f
566
为待测液在566nm处的荧光强度值，f
422
为待测液在422nm处的荧光强度值。
31.实施例3比率荧光生物传感器的特异性考察（1）样品预处理将大肠杆菌o157:h7和8种常见食源性致病菌(菌株信息见表1)于lb肉汤中培养12h至对数生长后期，取1ml移入已灭菌的离心管中，5000
×
g离心5min，弃去上清液，重悬于等体积浓度为0.1m、ph值7.4的无菌pbs缓冲液中得到菌悬液，梯度稀释菌悬液使试验菌株浓度约为104cfu/ml；此外，另取浓度为0.1m、ph值7.4的无菌pbs缓冲液为空白对照溶液，空白对照溶液中的大肠杆菌o157:h7浓度为0cfu/ml；（2）检测（2.1）取400μl待检液于1.5ml已灭菌的离心管中，向其中加入60μl的碳点探针及100μg的磁性碳纳米管复合载体，在37℃条件下孵育70min，得到复合溶液；所述碳点探针由实施例1所制备；所述磁性碳纳米管复合载体由实施例1所制备；（2.2）将复合溶液置于磁力架，静止1min，取上清液，得到磁分离溶液；（2.3）向磁分离溶液中加入40μl的量子点复合物，在37℃条件下孵育20min，得到待测液；所述量子点复合物由实施例1所制备；（2.4）取200μl待测液于石英比色皿中，设定荧光分光光度计的激发波长为355nm，测定待测液于422nm与566nm处的荧光强度值；（3）检测结果分析如图10所示，由于识别元件对大肠杆菌o157:h7的特异性识别，当体系中存在大肠杆菌o157:h7时，待测溶液的f
566
/f
422
值远高于空白对照溶液；当体系中不存在大肠杆菌o157:h7时，福氏志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、恶臭假单胞菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌待测液的f
566
/f
422
值远低于大肠杆菌o157:h7，并较空白对照溶液无明显变化；因此，本发明所述比率型荧光生物传感器具有良好的特异性；
实施例4为了验证实施例2所建立的检测方程用于复杂基质样品中大肠杆菌o157:h7检测的可行性，选取牛奶样品作为测试对象，通过人工定量染菌使其含有已知浓度的大肠杆菌o157:h7，与本发明检测体系所构建的比率荧光生物传感器定量检测结果进行比较，以获知本发明所建立的比率荧光探针在实际样品中的检测效果。
32.本实施例4涉及的牛奶样品采购自合肥当地超市，其配料为生牛乳、产品类型为全脂灭菌乳、产品标准号为gb 25190，每100ml牛奶中含3.6g蛋白质、4.4g脂肪、5.0g碳水化合物、58mg钠及120mg钙。
33.本发明在检测加标污染牛奶样品中大肠杆菌o157:h7的应用，具体的检测操作步骤如下：（1）人工污染牛奶待检液的制备在1ml的牛奶样品中添加浓度为2.72
×
102cfu/ml的大肠杆菌o157:h7标准品，在5000
×
g条件下离心5min，弃去上清液，经浓度为0.1m、ph值7.4的无菌pbs缓冲液重复洗涤三次后再重悬沉淀于1ml pbs缓冲液中获得待检液；（2）检测（2.1）取400μl待检液于1.5ml已灭菌的离心管中，向其中加入60μl的碳点探针及100μg的磁性碳纳米管复合载体，在37℃条件下孵育70min，得到复合溶液；所述碳点探针由实施例1所制备；所述磁性碳纳米管复合载体由实施例1所制备；（2.2）将复合溶液置于磁力架，静止1min，取上清液，得到磁分离溶液；（2.3）向磁分离溶液中加入40μl的量子点复合物，在37℃条件下孵育20min，得到待测液；所述量子点复合物由实施例1所制备；（2.4）取200μl待测液于石英比色皿中，设定荧光分光光度计的激发波长为355nm，测定待测液于422nm与566nm处的荧光强度值；（3）检测结果分析（3.1）按检测方程计算检测结果，检测方程为：y=0.1531x-0.0603，方程中，x表示
大肠杆菌o157:h7菌液浓度的对数值，y为f
566
/f
422
；其中，f
422
为待测液在422nm处的荧光强度值，f
566
为待测液在566nm处的荧光强度值；所述检测方程由实施例2所得；（3.2）计算得到f
566
/f
422
值为0.3095，代入到检测方程中得到，人工污染牛奶中的大肠杆菌o157:h7浓度为2.60
×
102cfu/ml；表明本研究建立的方法具有良好的通用性，可满足实际样品的检测需求。
34.实施例5本实施例5涉及的牛奶样品采购自合肥当地超市，其配料为生牛乳、产品类型为全脂灭菌乳、产品标准号为gb 25190，每100ml牛奶中含3.6g蛋白质、4.4g脂肪、5.0g碳水化合物、58mg钠及120mg钙。
35.本发明在检测未加标污染牛奶样品中大肠杆菌o157:h7的应用，具体检测操作步骤如下：（1）待检液的制备取1ml市售牛奶样品，在5000
×
g条件下离心5min，弃去上清液，经1ml浓度为0.1m、ph值7.4的无菌pbs缓冲液重复洗涤三次后再重悬沉淀于等体积pbs缓冲液中获得待检液；（2）检测（2.1）取400μl待检液于1.5ml已灭菌的离心管中，向其中加入60μl的碳点探针及100μg的磁性碳纳米管复合载体，在37℃条件下孵育70min，得到复合溶液；所述碳点探针由实施例1所制备；所述磁性碳纳米管复合载体由实施例1所制备；（2.2）将复合溶液置于磁力架，静止1min，取上清液，得到磁分离溶液；（2.3）向磁分离溶液中加入40μl的量子点复合物，在37℃条件下孵育20min，得到待测液；所述量子点复合物由实施例1所制备；（2.4）取200μl待测液于石英比色皿中，设定荧光分光光度计的激发波长为355nm，测定待测液于422nm与566nm处的荧光强度值；（3）检测结果分析待测液的f
566
/f
422
值较空白对照溶液几乎没有变化，表明市售牛奶样品中未检出大肠杆菌o157:h7；其中，f
422
为待测液在422nm处的荧光强度值，f
566
为待测液在566nm处的荧光强度值；所述空白对照溶液的f
566
/f
422
值由实施例3所测得。
36.本领域技术人员容易理解，以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于大肠杆菌o157:h7检测的基于背景消除的比率荧光探针，其特征在于：所述基于背景消除的比率荧光探针包括作为荧光供体的量子点复合物、作为荧光受体的碳点探针和消除背景干扰的磁性碳纳米管复合载体；所述量子点复合物为多粘菌素b修饰的氮硫共掺石墨烯量子点；所述多粘菌素b为多粘菌素b硫酸盐，cas号为1405-20-5；所述碳点探针为适配体修饰的黄色碳点；所述适配体的dna序列如seq id no:1所示，所述适配体的5’端用羧基修饰；所述磁性碳纳米管复合载体为羰基铁粉修饰的多壁碳纳米管；所述羰基铁粉的cas号为7439-89-6；所述多壁碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管，cas号为1333-86-4；当被测物中未存在大肠杆菌o157:h7时，检测体系中的碳点探针被磁性碳纳米管复合载体吸附，量子点复合物的荧光不被猝灭；当被测物中存在大肠杆菌o157:h7时，检测体系中的量子点复合物和碳点探针同时捕获目标菌，荧光供体和荧光受体的空间距离被拉近，从而发生荧光共振能量转移，使得量子点复合物的荧光猝灭，碳点探针的荧光增强。2.权利要求1所述一种基于背景消除的比率荧光探针的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：（1）制备量子点复合物（1.1）制备氮硫共掺石墨烯量子点固体（1.1.1）将1.0g柠檬酸和0.3g l-半胱氨酸均匀混合，油浴加热至200℃，当反应物颜色由淡黄色变为橙色时，停止加热，自然冷却至室温，获得橙色产物；（1.1.2）将橙色产物溶解到10ml超纯水中，获得氮硫共掺石墨烯量子点原液；（1.1.3）将氮硫共掺石墨烯量子点原液冷冻干燥12h，制得氮硫共掺石墨烯量子点固体；（1.2）制得量子点复合物（1.2.1）将1mg氮硫共掺石墨烯量子点固体溶解在10ml去离子水中，超声10min，得到分散溶液；（1.2.2）向分散溶液中加入6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mg n-羟基琥珀酰亚胺，在室温条件下搅拌2h，得到活化的量子点溶液；（1.2.3）向活化的量子点溶液中加入3mg多粘菌素b，在室温条件下以200rpm的转速搅拌7h，得到量子点复合物；氮硫共掺石墨烯量子点的最大发射波长为418nm、zeta电位为6.77mv；当量子点复合物的最大发射波长偏移至422nm，zeta电位变为17.37mv时，表示量子点复合物中多粘菌素b成功修饰到氮硫共掺石墨烯量子点上；（2）制备碳点探针（2.1）制备黄色碳点固体（2.1.1）将216mg邻苯二胺加入到30ml去离子水中，震荡混合均匀，得到混合液；（2.1.2）将混合液在160℃下加热4h，自然冷却至室温，在9289
×
g离心力下离心12min去除杂质，获得反应液；
（2.1.3）将反应液加入到分子透过量为3000da的透析袋中，去离子水透析24h，得到透析液；（2.1.4）将透析液冷冻干燥12h，制得黄色碳点固体；（2.2）制得碳点探针（2.2.1）在300μl浓度1μm的适配体溶液中加入50μl浓度4mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和50μl浓度4mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温条件下以180rpm的转速孵育30min，获得活化的适配体溶液；（2.2.2）将5mg黄色碳点固体溶解于5ml去离子水中，加入活化的适配体溶液，在室温条件下以180rpm的转速孵育2.5h，得到碳点探针；黄色碳点的最大发射波长为562nm、zeta电位为-4.01mv；当碳点探针的最大发射波长偏移至566nm，zeta电位变为-7.84mv时，表示适配体被修饰在黄色碳点的表面，成功构建了碳点探针；（3）制备磁性碳纳米管复合载体（3.1）称量1.5mg多壁碳纳米管于玻璃瓶中，加入1.5ml浓度0.1m、ph值5.5的吗啉乙磺酸一水合物酸性溶液，充分振荡，得到多壁碳纳米管溶解液；（3.2）向多壁碳纳米管溶解液中加入200μl浓度6.2mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和200μl浓度4.6mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下孵育2h，得到活化的多壁碳纳米管溶液；（3.3）在活化的多壁碳纳米管溶液中加入3mg羰基铁粉，超声处理1h，于85℃烘箱干燥20min，得到磁性碳纳米管复合载体；多壁碳纳米管无磁性、zeta电位为-23.01mv，羰基铁粉有磁性、zeta电位为4.25mv；磁性碳纳米管复合载体有磁性、zeta电位为-2.38mv，介于-23.01mv与4.25mv之间。

技术总结
本发明公开了一种用于大肠杆菌O157:H7检测的基于背景消除的比率荧光探针及制备方法，属于食品安全技术领域。所述基于背景消除的比率荧光探针包括作为荧光供体的量子点复合物、作为荧光受体的碳点探针和消除背景干扰的磁性碳纳米管复合载体。当大肠杆菌O157:H7存在时，荧光供体、荧光受体同时捕获目标菌，两者的空间距离被拉近，随后FRET“开启”，能量从供体荧光团转移到受体荧光团，并导致荧光双信号可逆变化，从而实现对大肠杆菌O157:H7的检测；此外，体系中未与目标菌结合的多余荧光受体由于π-π堆积作用被吸附在磁性碳纳米管复合载体表面，通过磁选被高效分离，以消除背景干扰。本发明操作简便、检测成本低，搭配磁分离技术，使检测灵敏度提高至2.6cfu/mL。检测灵敏度提高至2.6cfu/mL。检测灵敏度提高至2.6cfu/mL。


技术研发人员：曹璐璐 叶应旺 任玉伟 凌娜 李辉
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/16