5-羟基氧吲哚在制备急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用

1.本发明属于医药领域，具体涉及5-羟基氧吲哚在制备急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用。


背景技术：

2.急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ards)是常见的呼吸危重症，全球每年诊断出300多万ards患者，占重症监护病房(icu)住院人数的10％。ards的临床特征为双侧胸片不透明，伴有非心源性肺水肿引起的严重低氧血症。ards的临床治疗目前无特效药物，仅有小潮气量机械通气等辅助治疗手段，因此ards有着高达35％
–
45％的医院死亡率，即便迅速缓解死亡率也高达为31％。ards的病因复杂，其最常见的危险因素是肺炎。近年来新发突发呼吸道病毒如sars-cov、高致病性h5n1禽流感病毒、人感染h7n9禽流感病毒及sars-cov-2的不断出现，罹患ards的患者愈发增加，因此急需研发新的ards的有效干预药物。


技术实现要素：

3.本发明提供了5-羟基氧吲哚在制备急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用。
4.本发明还提供了5-羟基氧吲哚在制备减少肺部炎性细胞浸润药物中的应用。
5.本发明还提供了5-羟基氧吲哚在制备改善肺组织的氧化损伤和组织损伤药物中的应用。
6.本发明还提供了5-羟基氧吲哚在制备抑制炎症因子表达药物中的应用。
7.本发明还提供了一种验证5-羟基氧吲哚作用原理的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.(1)选取40只6周龄的c57bl/6j雄性小鼠，室温保持在23
±
1℃，湿度保持在50
±
60％；光暗循环12小时，可随意获取清洁食品和水进行训化；
9.(2)c57bl/6j小鼠分为pbs灌胃组、lps气管滴注组、5-羟基氧吲哚灌胃组、5-羟基氧吲哚灌胃及lps气管滴注组每组10只；pbs组及lps组每天灌胃200ul pbs，5-羟基氧吲哚灌胃组、5-羟基氧吲哚灌胃及lps气管滴注组每天灌胃给予200ul(5.0g/l)5-羟基氧吲哚溶液；每日给药时间固定，连续给予17天；lps气管滴注于第14天进行，lps气管滴注后72h，眼球取血，3000r/min离心，保留血清备用；
10.(3)取肺组织和肺泡灌洗液进行肺组织炎症及细胞浸润参数评价、组织学分析、肺组织中炎症因子mrna分析、肺组织中炎症因子mrna分析、肺组织中氧化损伤及炎症相关蛋白分析和数据统计分析。
11.进一步的，所述肺组织炎症及细胞浸润参数评价具体如下：
12.肺泡灌洗样品立即检测细胞计数(cell counts)，2000r/min离心两次，储存在-80℃下进行进一步蛋白质浓度(bca)的分析。
13.进一步的，所述组织学分析具体如下：
14.为将采集的肺组织样品用新鲜制备的4％多聚甲醛固定；苏木精伊红染色(h&e)：取肺组织石蜡切片在65℃的烤箱中烘烤至少1.5小时，以确保组织切片上的石蜡充分融化；然后，将切片置于二甲苯中两次，以去除融化的石蜡，并在梯度乙醇中脱水；切片依次用苏木精和伊红染色，然后用乙醇脱水；染色后，切片在二甲苯澄清两次，用中性树脂固定；染色切片在光学显微镜下进行观察，分别放大100倍及400倍。
15.进一步的，所述的肺组织中炎症因子mrna分析如下：
16.使用qpcr测定肺组织中炎症因子表达：白细胞介素6(il-6)，肿瘤坏死因子(tnf-α)。
17.进一步的，所述的肺组织中氧化损伤及炎症相关蛋白分析如下：
18.使用蛋白质印迹(western blot)测定肺组织中氧化损伤及炎症蛋白表达：血红素加氧酶1(ho-1)，硫氧还蛋白(txn)，髓过氧化物酶(mpo)。
19.进一步的，所述数据统计分析步骤如下：
20.数据用平均值
±
标准差(sem)表示，采用独立样本t检验评估两组间差异，所有的图表都是由graphpad prism 8.0创建。
21.本发明具有以下有益效果：
22.本发明经过多轮的功能的筛选，并在动物体内群验证其健康效果。本发明的5-羟基氧吲哚经动物试验验证，本发明采用lps气管滴注诱导ards模型联合5-羟基氧吲哚处理，进行测定肺泡灌洗液细胞计数、蛋白质浓度及肺组织炎症基因、组织病理学和氧化损伤蛋白表达。研究发现5-羟基氧吲哚减少了肺部细胞浸润，改善了肺组织的氧化损伤和组织损伤、炎症因子表达。为5-羟基氧吲哚缓解ards的应用前景提供了理论依据。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠的肺部细胞浸润的影响；
25.图2为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠的组织病理学的影响；
26.图3为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠肺组织炎症基因表达的影响；
27.图4为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠的肺组织炎症及氧化应激蛋白表达的影响。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每
α)。
46.进一步的，所述的肺组织中氧化损伤及炎症相关蛋白分析如下：
47.使用蛋白质印迹(western blot)测定肺组织中氧化损伤及炎症蛋白表达：血红素加氧酶1(ho1)，硫氧还蛋白(txn)，髓过氧化物酶(mpo)。
48.进一步的，所述统计分析步骤如下：
49.数据用平均值
±
标准差(sem)表示，采用独立样本t检验评估两组间差异，所有的图表都是由graphpadprism 8.0创建。
50.实验数据分析：
51.图1为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠的肺部细胞浸润的影响(a)为小鼠肺泡灌洗液中的细胞计数，5-羟基氧吲哚+lps组的肺泡灌洗液中细胞浸润减少；(b)小鼠肺泡灌洗液的蛋白含量，5-羟基氧吲哚+lps组的肺泡灌洗液中蛋白含量降低；数据表示为平均值
±
标准差，n＝5，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001.小鼠肺部细胞浸润如图1所示，相较于pbs组，5-羟基氧吲哚组的细胞总数和蛋白含量均无差异；与lps组相比5-羟基氧吲哚+lps组小鼠的细胞总数和蛋白含量均减少。相比之下，5-羟基氧吲哚+lps处理显著降低了由lps引起的肺部细胞浸润。
52.图2为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠肺组织损伤的影响。图为小鼠肺组织苏木精和伊红(h&e)染色的代表性图片，上图，100
×
，比例尺＝100μm；下图，400
×
，比例尺＝100μm。由图可知相较于pbs组，5-羟基氧吲哚组处理后小鼠肺组织没有发现显著的变化；lps引起了肺部的病理损伤，相较于lps组中肺部的病理损伤，在5-羟基氧吲哚+lps组中显示其得到缓解。因此5-羟基氧吲哚的补充能减轻lps引起的小鼠肺组织病理损伤。
53.图3为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠肺组织病理学的影响。测定的炎症基因的mrna水平分别是：白介素-6(il-6),肿瘤坏死因子(tnf-α)的表达。数据表示为平均值
±
标准差，n＝5，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。从图中可以看到5-羟基氧吲哚+lps组小鼠肺组织中il-1β、il-6和tnf-α的mrna表达水平显著低于lps处理小鼠。因此5-羟基氧吲哚的补充能减轻lps引起的小鼠肺组织炎症(p＜0.05)。
54.图4为5-羟基氧吲哚对lps诱导ards小鼠的肺组织炎症及氧化应激蛋白表达的影响。测定小鼠肺组织中的ho1、txn、mpo的蛋白表达，n＝3。小鼠肺部炎症和氧化损伤如图4所示，在pbs和lps组中ho1、txn、mpo的蛋白表达无显著趋势；相较于lps组小鼠，5-羟基氧吲哚+lps组小鼠的ho1、txn、mpo的蛋白表达降低。蛋白质印迹结果表明5-羟基氧吲哚+lps组5-羟基氧吲哚的补充能够缓解lps处理引起的肺部炎症和氧化损伤。
55.综上所述，本发明表明5-羟基氧吲哚对lps诱发ards小鼠具有缓解作用。我们发现在lps诱发ards小鼠肺组织中5-羟基氧吲哚丰度降低，同时补充5-羟基氧吲哚可以降低lps引起的肺部细胞浸润、肺部炎症增加、肺组织氧化损伤和肺组织病理损伤。这种有益的作用可能是通过改善代谢、抑制炎症反应来实现的。总的来说，我们的发明提示5-羟基氧吲哚在预防和治疗ards方面的潜力，为开发更有效，更安全的治疗ards药物提供新的可能。
56.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.5-羟基氧吲哚在制备急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用。2.5-羟基氧吲哚在制备减少肺部炎性细胞浸润药物中的应用。3.5-羟基氧吲哚在制备改善肺组织的氧化损伤和组织损伤药物中的应用。4.5-羟基氧吲哚在制备抑制炎症因子表达药物中的应用。5.一种验证5-羟基氧吲哚作用原理的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取40只6周龄的c57bl/6j雄性小鼠，室温保持在23
±
1℃，湿度保持在50
±
60％；光暗循环12小时，可随意获取清洁食品和水进行训化；(2)c57bl/6j小鼠分为pbs灌胃组、lps气管滴注组、5-羟基氧吲哚灌胃组、5-羟基氧吲哚灌胃及lps气管滴注组每组10只；pbs组及lps组每天灌胃200ul pbs，5-羟基氧吲哚灌胃组、5-羟基氧吲哚灌胃及lps气管滴注组每天灌胃给予200μl、5.0g/l的5-羟基氧吲哚溶液；每日给药时间固定，连续给予17天；lps气管滴注于第14天进行，lps气管滴注后72h，眼球取血，3000r/min离心，保留血清备用；(3)取肺组织和肺泡灌洗液进行肺组织炎症及细胞浸润参数评价、组织学分析、肺组织中炎症因子mrna分析、肺组织中炎症因子mrna分析、肺组织中氧化损伤及炎症相关蛋白分析和数据统计分析。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肺组织炎症及细胞浸润参数评价具体如下：肺泡灌洗样品立即检测细胞计数，2000r/min离心两次，储存在-80℃下进行进一步蛋白质浓度的分析。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组织学分析具体如下：为将采集的肺组织样品用新鲜制备的4％多聚甲醛固定；苏木精伊红染色：取肺组织石蜡切片在65℃的烤箱中烘烤至少1.5小时，以确保组织切片上的石蜡充分融化；然后，将切片置于二甲苯中两次，以去除融化的石蜡，并在梯度乙醇中脱水；切片依次用苏木精和伊红染色，然后用乙醇脱水；染色后，切片在二甲苯澄清两次，用中性树脂固定；染色切片在光学显微镜下进行观察，分别放大100倍及400倍。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肺组织中炎症因子mrna分析如下：使用qpcr测定肺组织中炎症因子表达：白细胞介素6，肿瘤坏死因子。9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肺组织中氧化损伤及炎症相关蛋白分析如下：使用蛋白质印迹测定肺组织中氧化损伤及炎症蛋白表达：血红素加氧酶1，硫氧还蛋白，髓过氧化物酶。10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述数据统计分析步骤如下：数据用平均值
±
标准差表示，采用独立样本t检验评估两组间差异，所有的图表都是由graphpad prism 8.0创建。

技术总结
本发明属于医药领域，具体涉及5-羟基氧吲哚在制备急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用。本发明针对急性呼吸窘迫综合征无特效药仅支持性治疗的问题，以气管滴注脂多糖诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠为模型，提供一种能显著改善肺部炎性细胞浸润，降低肺部炎症反应，改善肺组织损伤及氧化损伤的肠道微生物代谢产物——5-羟基氧吲哚效应原理，并提供了5-羟基氧吲哚在制备急性呼吸窘迫综合征治疗药物中的应用。的应用。


技术研发人员：邹镇 陈承志 邱景富 唐世鑫
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/8/16