用猛犸象等位基因进行基因编辑的组合物和方法

用猛犸象等位基因进行基因编辑的组合物和方法
相关申请的交叉引用
1.根据35u.s.c.
§
119(e)，本技术要求2020年12月10日提交的美国临时申请no.63/123,616的权益，通过引用将其内容以其整体并入本文。
技术领域
2.本文所述的技术涉及基因编辑的和/或重编程的哺乳动物细胞及其用途。


背景技术：

3.目前，用于帮助动物保护工作的大象组织培养、非人细胞的基因组编辑和生物工具的开发需求尚未得到满足。合成生物学和基因编辑可改善野生动物疾病的治疗，并纠正气候变化、污染、人类消费、狩猎、人为干扰、资源枯竭和森林砍伐造成的生态失衡。来自濒危和灭绝物种的组织和细胞系的生物库可冷冻保存它们，以供未来的研究。然而，目前缺乏来自这些物种的这些组织和细胞。


技术实现要素：

4.本文所述的组合物和方法部分基于如下的发现，即大象体细胞(例如，非洲草原象(loxodonta africana)细胞)可被重编程为干细胞样表型，并且也可被基因编辑以包含来自灭绝的猛犸象(例如，真猛犸象(mammuthus primigenius))的一个或多个基因变体等位基因。本文所述的组合物和方法提供了野生动物产品的合成替代品和用于了解濒危和灭绝物种的遗传多样性和细胞生物学的工具。
5.在一个方面，本文描述了一种活细胞，该活细胞包含选自于由表1所列猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。
6.在任一方面的一个实施方式中，细胞表达由至少一种核酸序列编码的多肽。
7.在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞为可重编程的细胞。
8.在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞为重编程的细胞。
9.在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞为干细胞。在另一个实施方式中，细胞表达干细胞表型的至少一种内源性基因。
10.在任一方面的另一个实施方式中，干细胞为诱导多能干细胞、胚胎干细胞或间充质干细胞。
[0011][0012]
在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞为成纤维细胞或间充质细胞。
[0013]
在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞或表皮细胞。
[0014]
在任一方面的另一个实施方式中，细胞先前在体外分化为选自于由如下所组成的组中的细胞：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞和表皮细胞。
[0015]
在任一方面的另一个实施方式中，细胞不表达至少一种猛犸象基因的内源性同源
物。
[0016]
在任一方面的另一个实施方式中，对细胞进行编辑以抑制至少一种猛犸象基因的内源性同源物的表达。
[0017]
在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞为非人细胞。
[0018]
在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞为大象细胞。
[0019]
在任一方面的另一个实施方式中，大象细胞为非洲草原象(非洲象)细胞或亚洲象(elephas maximus)细胞。
[0020]
在任一方面的另一个实施方式中，细胞为蹄兔细胞或海牛细胞。在任一方面的另一个实施方式中，所述蹄兔细胞选自于由如下所组成的组：南非树蹄兔(dendrohyrax arboreus)细胞、西非树蹄兔(dendrohyrax dorsalis)细胞、黄斑岩蹄兔(heterohyrax brucei)细胞和岩蹄兔(procavia capensis)细胞。在另一个实施方式中，所述海牛细胞选自于由如下所组成的组：亚马逊海牛(trichechus inunguis)细胞、西印度海牛(trichechus manatus)细胞、佛罗里达海牛(trichechus manatus latirostris)细胞、安地列斯海牛(trichechus manatus manatus)细胞、西非海牛(trichechus senegalensis)细胞。
[0021]
在任一方面的另一个实施方式中，将细胞冷冻保存。
[0022]
在任一方面的另一个实施方式中，细胞先前为冷冻保存的。
[0023]
在任一方面的另一个实施方式中，细胞表现出选自于由以下所组成的组中的表型：一种或多种猛犸象多肽的表达增加，钙信号传导的调节，电生理功能的调节，细胞膜脂质组成的调节，蛋白合成速率的调节，以及与适当的对照相比的细胞增殖速率的调节，并且对于干细胞，向其他细胞谱系的分化潜力。
[0024]
在另一个方面，本文描述了卵母细胞，其中内源性细胞核已被本文所述细胞的细胞核取代。
[0025]
在另一个方面，本文描述了非猛犸象细胞，该细胞包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。
[0026]
在另一个方面，本文描述了经基因编辑的大象细胞，该细胞包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列，其中，对大象细胞进行编辑以改变所述至少一种猛犸象基因的大象同源物或使大象同源物失活。
[0027]
在另一个方面，本文描述了大象细胞，该细胞包含表2或表3所列的至少一种引导rna。在一个实施方式中，大象细胞进一步表达由至少一种引导rna引导的rna引导核酸内切酶。
[0028]
在另一个方面，本文描述了非人细胞，该细胞包含表2或表3所列的至少一种引导rna。在一个实施方式中，非人细胞进一步表达由至少一种引导rna引导的rna引导核酸内切酶。
[0029]
在另一个方面，本文描述了经基因编辑的大象细胞，该细胞具有选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一个基因的内源性同源物，对所述细胞进行编辑以模拟同源物的猛犸象变体。
[0030]
在任一方面的一个实施方式中，对细胞进行改造以删除或抑制大象同源物的功能。
[0031]
在任一方面的另一个实施方式中，干细胞标志物选自于由如下所组成的组：tra 1-60、tra 1-81、ssea4、pou5f1、nanog、rex1、htert、gdf3、mir-290和mir-302簇等。
[0032]
在另一个实施方式中，细胞包含编码一种或多种外源多肽的外源核酸，所述多肽选自于由表1所列的猛犸象多肽所组成的组。
[0033]
在另一个实施方式中，使对应于一种或多种外源多肽的大象同源基因失活。
[0034]
在另一个方面，本文描述了包含本文所述的活细胞的非人生物体。
[0035]
在另一个方面，本文描述了包含本文所述的细胞的非人胚胎。
[0036]
在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人胚胎。
[0037]
在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人卵母细胞。
[0038]
在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人4细胞期胚胎。
[0039]
在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人8细胞期胚胎。
[0040]
在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人囊胚。
[0041]
在另一个方面，本文描述了包含供体细胞核的去核的非人卵母细胞，所述供体细胞核包含选自于由表1中所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一个基因的核酸序列。
[0042]
在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1中所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种基因的核酸序列的非人生物体。
[0043]
在任一方面的一个实施方式中，所述胚胎为原肠胚形成前的胚胎。
[0044]
在任一方面的另一个实施方式中，所述胚胎为嵌合胚胎。
[0045]
在任一方面的另一个实施方式中，将胚胎、囊胚或卵母细胞冷冻保存。
[0046]
在任一方面的另一个实施方式中，胚胎、囊胚或卵母细胞先前是冷冻保存的。
[0047]
在任一方面的另一个实施方式中，外源核酸序列的非猛犸象同源物已被删除或失活。
[0048]
在另一个方面，本文描述了包含选自seq id no：1至seq id no：426的序列的引导rna。
[0049]
在另一个方面，本文描述了编码本文所述的引导rna中的任一者的核酸。
[0050]
在任一方面的一个实施方式中，编码引导rna的核酸与指导该引导rna表达的核酸序列可操作地连接。
[0051]
在另一个方面，本文描述了包含本文所述的核酸中的任一者的载体。
[0052]
在另一个方面，本文描述了包含本文所述的引导rna中的任一者的细胞。
[0053]
在另一个方面，本文描述了包含本文所述的核酸中的任一者的细胞。
[0054]
在另一个方面，本文描述了包含本文所述的载体中的任一者的细胞。
[0055]
在任一方面的一个实施方式中，所述细胞进一步包含rna引导核酸内切酶，该核酸内切酶的活性由引导rna引导。定义
[0056]
除非本文另有定义，否则结合本技术使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可变化。此处使用的术语仅用于描述特定实施方式，而不旨在限制仅由权利要求限定的本发明的范围。生物学和分子生物学中常见术语的定义可见于：merck sharp&dohme corp.出版的the merck manual of diagnosis and therapy，第20版，2018(isbn 0911910190，978-0911910421)；robert s.porter等编，the encyclopedia of molecular cell biology and molecular medicine，blackwell science ltd.出版，1999-2012(isbn 9783527600908)；和robert a.meyers编，molecular biology and biotechnology：a comprehensive desk reference，vch publishers,inc.出版，1995年(isbn 1-56081-569-8)；werner luttmann的immunology，elsevier出版，2006年；kenneth murphy、allan mowat、casey weaver编，janeway’s immunobiology，w.w.norton&company，2016年(isbn 0815345054，978-0815345053)；jones&bartlett publishers出版的genetics:analysis of genes and genomes，第9版，2014年(isbn：978-1284122930)；pearson出版的biology，第11版，2016年(isbn：0134093410)；lewin's genes xi，jones&bartlett publishers出版，2014年(isbn-1449659055)；michael richard green和joseph sambrook，molecular cloning:a laboratory manual，第4版，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，usa(2012)(isbn 1936113414)；davis等，basic methods in molecular biology，elsevier science publishing,inc.，new york，usa(2012)(isbn 044460149x)；jon lorsch编，laboratory methods in enzymology：dna，elsevier，2013(isbn 0124199542)；frederick m.ausubel编，current protocols in molecular biology(cpmb)，john wiley and sons，2014(isbn 047150338x，9780471503385)；john e.coligan编，current protocols in protein science(cpps)，john wiley and sons,inc.，2005年；和john e.coligan，ada m kruisbeek，david h margulies，ethan mshevach，warren strobe编，current protocols in immunology(cpi),john wiley and sons,inc.,2003(isbn 0471142735,9780471142737)；以引用方式将其内容以其整体并入本文。
[0057]
如本文所用，术语“干细胞”是指能够自我更新并分化为至少一种分化程度更高或发育能力较差的表型的细胞。术语“干细胞”涵盖干细胞系、诱导干细胞、非人胚胎干细胞、多能干细胞(pluripotent stemcells)、多潜能干细胞(multipotent stem cells)、羊膜干细胞、胎盘干细胞或成人干细胞。“诱导干细胞”是源自如下的非多能干细胞的细胞，通过引入一种或多种重编程因子或基因而将所述非多能干细胞诱导为分化程度较低或发育能力更强的表型。作为本文所用的术语，诱导干细胞不需要是多能的，但具有在适当的条件下分化为多于一种的高度分化表型的能力
‑‑
应该理解的是，在引入重编程因子之前，这种能力并不存在。诱导干细胞将表达至少一种干细胞标志物，所述标志物在引入重编程因子之前未被亲本细胞表达。在这种情况下，干细胞标志物不包括为重编程而引入的因子。诱导多能干细胞或ips细胞具有在适当条件下分化为源自内胚层、中胚层和外胚层各自的细胞表型的诱导能力。
[0058]
本文使用的术语“标志物”用于描述细胞的特征和/或表型。标志物可用于筛选包含感兴趣的特征的细胞，并且可随具体的细胞而变化。标志物是特定细胞类型的细胞的特
征(无论是形态、结构、功能或生化(酶学)特征)，或由该细胞类型表达的分子。在一个方面，此类标志物为蛋白。这些蛋白可具有本领域可用的抗体或其他结合分子的表位。然而，标志物可由在细胞中或细胞上发现的任何分子组成，包括但不限于蛋白(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态特征或性状的例子包括但不限于形状、大小和核质比。功能特征或性状的实例包括但不限于粘附于特定底物的能力、掺入或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力以及沿着特定谱系分化的能力。可通过本领域技术人员可用的任何方法检测标志物。标志物也可为形态特征的缺乏或蛋白、脂质等的缺乏。标志物可为多肽存在和/或不存在的一组独特特征和其他形态或结构特征的组合。在一个实施方式中，标志物为细胞表面标志物。
[0059]
如本文所用，短语“表达至少一种干细胞标志物”表示细胞表达如本文所定义的术语的标志物，该标志物是本文所定义的干细胞的特征。标志物可为特定的形态，但更常见的是一种或多种多肽的表达，无论是在细胞表面上还是在细胞内。干细胞标志物的表达的增加通常伴随着分化表型的一种或多种标志物表达的丧失。应该理解的是，“表达至少一种干细胞标志物”的细胞的“至少一种干细胞标志物”不是由外源引入细胞中的构建体表达的标志物，而是作为细胞对引入重编程因子的应答的一部分表达。干细胞标志物的实例包括但不限于胚胎干细胞的tra 1-60、tra 1-81、ssea4、pou5f1、nanog、rex1、htert、gdf3、mir-290和mir-302簇等，以及分化标志物如sox2、myod、pax6、nestin、neurogenin1/2、cd34、il-7、il-3、neurod等，并且取决于哪种分化谱系是优选的。
[0060]
术语“外源的”是指通过人为引入的存在于细胞中的物质。当在本文中使用时，术语“外源的”可指通过涉及人为的过程引入生物系统(如通常在其中不会发现所述肽或核酸的细胞或生物体)中的多肽或核酸(例如，编码多肽的核酸)。或者，“外源的”可指通过涉及人为的过程引入生物系统(如细胞或生物体)中的核酸或多肽，在该生物系统中，所述核酸或多肽相对较低的量被发现，并且人们希望增加细胞或生物体中所述核酸或多肽的量，例如，以产生异位表达或水平。
[0061]
术语“序列同一性”是指两个核苷酸序列之间的相关性。为了本公开的目的，使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度，在emboss包的needle程序(emboss：the european molecular biology open software suite，rice等，2000，同上)(优选3.0.0或更高版本)中实现该算法。使用的可选参数为10的空位开放罚分、0.5的空位扩展罚分和ednafull(ncbi nuc4.4的emboss版本)替换矩阵。将标记有“最长同一性”的needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并计算如下：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对中的空位总数)。比对长度优选为至少10个核苷酸，优选为至少25个核苷酸，更优选为至少50个核苷酸，并且最优选为至少100个核苷酸。
[0062]
如本文所用，术语“重编程基因”或“重编程因子”是指能够在体细胞中诱导重编程过程以重新表达分化程度较低、更高干细胞样表型的试剂或核酸分子。重编程因子可为在引入细胞时促进重编程表型的核酸、多肽或小分子。重编程因子的非限制性实例包括：oct4(八聚体结合转录因子-4)、sox2(性别决定区y)-盒2、klf4(kruppel样因子-4)和c-myc。这些是所谓的“经典”或“标准”组的重编程因子，用于衍生(例如)诱导多能干细胞。当在将细胞重编程为低分化或干细胞表型的过程中引入时，可被视为重编程因子的额外的因子包括
lin28+nanog、esrrb、pax5 shrna、c/ebpα、p53 sirna、utf1、dnmt shrna、wnt3a、sv40 lt(t)、htert、小分子化学试剂(包括但不限于bix-01294、bayk8644、rg108、aza、地塞米松、vpa、tsa、saha、pd0325901+chir99021(2i)和a-83-01)。在一些实施方式中，重编程基因或因子为oct4、klf4、sox2和c-myc。
[0063]
如本文所用，术语“去分化”、或“反分化”、或“重编程”是指产生重新表达比其来源的细胞分化程度更低的表型，和/或表达在该过程之前不被表达的至少一种干细胞标记的细胞的过程。例如，终末分化的细胞可被去分化为多潜能细胞。也就是说，去分化使细胞沿着全能细胞至完全分化的细胞的分化谱移回去。通常，细胞分化表型的逆转需要人工操纵细胞，例如通过引入或表达外源多肽因子。通常不会在体内或体外于天然条件下观察到重编程。
[0064]
如本文所用，“重编程细胞”是指与一种或多种重编程因子接触并表达比其来源的细胞分化程度更低的表型的细胞。重编程细胞也可具有自我更新的能力，并将表达不是作为重编程因子递送到细胞的至少一种干细胞标志物。此外，根据本文提供的或本领域描述的分化方案，重编程细胞将具有分化为更分化的体细胞类型的能力。
[0065]
如本文所用，术语“体细胞”是指除生殖细胞、存在于植入前胚胎中或从植入前胚胎获得的细胞或由这种细胞在体外增殖产生的细胞之外的任何细胞。换句话说，体细胞是指形成生物体的躯体的任何细胞，不包括生殖细胞。除了精子和卵细胞以及制造它们的细胞(配子母细胞)外，哺乳动物体内的每一种细胞类型都是体细胞：内脏、皮肤、骨骼、血液和结缔组织基本上都由体细胞构成。在一些实施方式中，体细胞为“非胚胎体细胞”，其是指不存在于胚胎中或不从胚胎获得的体细胞，并且不是由这种细胞在体外增殖产生的。在一些实施方式中，体细胞是“成年体细胞”，其意指存在于除胚胎或胎儿以外的生物体中或从除胚胎或胎儿以外的生物体获得的细胞，或由这种细胞在体外增殖产生的细胞。
[0066]
在细胞个体发生的背景下，术语“分化(differentiate)或(differentiating)”是相对术语，表明“分化细胞”是指比起其前体细胞沿发育途径进展得更远的细胞。因此，在一些实施方式中，作为本文所定义的术语，干细胞可分化为谱系限制性前体细胞(如人心脏祖细胞或中原始条纹(mid-primitive streak)心源性中胚层祖细胞)，其又可分化为进一步沿着该途径前行的其他类型的前体细胞(如组织特异性前体，如心肌细胞前体)，然后分化至终末期分化细胞，所述终末期分化细胞在某种组织类型中发挥特征性作用，并且可保留也可不保留进一步增殖的能力。将干细胞体外分化为其他细胞类型的方法是本领域已知的。分化源自干细胞的骨骼肌细胞、平滑肌和/或脂肪细胞的方法描述于，例如u.s.专利no.10,240,123 b2；和cheng等，am j physiol cell physiol(2014)。分化肾细胞的方法描述于，例如tajiri等，scientific reports，8：14919(2018)；taguchi等，cell stem cell，14：53-67(2014)；以及us申请2010/0021438 a1。分化心血管细胞的方法描述于，例如us申请no.2017/0058263 a1、2008/0089874 a1、2006/0040389 a1；us专利no.10,155,927b2、9,994,812b2和9,663,764b2。分化内皮细胞(例如血管内皮)的方法描述于例如u.s专利no.10,344,262 b2和olgasi等，stem cell reports，11：1391-1406(2018)。分化激素产生细胞的方法描述于例如us专利no.7,879,603b2和abu-bonsrah等，stem cell reports，10：134-150(2018)。分化骨细胞的方法描述于例如，csobonyeiova等，j adv res 8：321-327(2017)，us专利no.7,498,170b2、6,391,297b1和us申请no.2010/0015164 a1。分化小胶质
细胞的方法描述于例如wo 2017/152081 a1。分化上皮细胞和皮肤细胞的方法描述于例如，kim等，stem cell research and therapy(2018)；us专利no.7,794,742 b2、6,902,881 b2。分化血细胞和白细胞的方法描述于例如，us专利no.6,010,696 a和6,743,634 b2。分化干细胞来源的β细胞的方法描述于例如wo 2016/100930 a1中。通过引用的方式将上述参考文献中的每一个以其整体并入本文。
[0067]
如本文所用，术语“冷冻保存”是指将活细胞冻存在水性溶液中，其中配制所述水性溶液以在冷冻过程中保护细胞。
[0068]
本文中使用的术语“减少”、“降低”、“减小”或“抑制”都是指统计学上显著量的减少。在一些实施方式中，“降低”、“减少”、“减小”或“抑制”是指与参考水平(例如，不存在给定的治疗)相比减少至少10％，并且可包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多。如本文所用，与参考水平相比，“减少”或“抑制”并不包括完全的抑制或减少。与参考水平相比，“完全抑制”是100％的抑制。
[0069]
术语“增加的”、“增加”、“增强”或“活化”在本文中都是指统计学上显著量的增加。在一些实施方式中，术语“增加的”、“增加”、“增强”或“活化”可以是指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或高达并包括100％的增加或介于10％-100％之间的任何增加，或与参考水平相比，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或约5倍或至少约10倍的增加，或介于2倍至10倍之间或更多倍的任何增加。
[0070]
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计学显著性，并且通常意指两个标准差(2sd)或更大的差异。
[0071]
如本文所用，术语“包括”或“包含”被用于指组合物、方法及其各自的组分，所述组分对该方法或组合物是必需的，但可包含未指明的元素，无论是否必需。
[0072]
如本文所用，术语“基本上由
…
组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在不会实质上影响本发明的实施方式的基本和新颖或功能特征的额外的要素。
[0073]
术语“由
…
组成”是指如本文所述的组合物、方法及其各自的组分不包括在实施方式的描述中未列举的任何要素。
[0074]
除非上下文另有明确指示，否则单数术语“一、该(a、an和the)”包括复数指称。类似地，除非上下文另有明确指示，“或”一词意在包括“和”。尽管在本公开的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。缩写“e.g.”源自拉丁语exempli gratia，并在文本中用于表示非限制性实例。因此，缩写词“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
附图说明
[0075]
图1展示了用于鉴别猛犸特定特征的猛犸相关物种。改编自palkopoulou等，2018，pnas，115(11)e2566-e2574。
[0076]
图2显示了trp基因活跃的温度范围。改编自lynch等，2015年，cell reports，12，217-228。
[0077]
图3显示了具有克隆的猛犸等位基因的多顺反子载体。
[0078]
图4显示了用于从大象成纤维细胞生成大象ipsc的重编程总览和因子列表。重编程因子包括oct4、sox2、klf4和cmyc。
[0079]
图5显示了用于重编程的pmph86载体。
[0080]
图6显示了重编程载体。
[0081]
图7显示了大象成纤维细胞的初始重编程为具有干细胞特征的诱导表型。
[0082]
图8显示了在无饲养层条件下用matrigel
tm
扩增的非洲草原象重编程细胞。
[0083]
图9显示了大象细胞群的主成分分析(pca)的分析。
[0084]
图10示出了各种细胞标志物的热图。热图显示了在大象重编程细胞中为高而在成纤维细胞样细胞中为低的干细胞标志物的比较。
[0085]
图11显示了在大象重编程细胞中为高而在分化的亲代群体中为低的分化标志物的差异表达分析。
[0086]
图12显示了在大象重编程细胞中为低而在分化的亲代群体中为高的分化标志物的差异表达分析。
具体实施方式
[0087]
猛犸象(真猛犸象)是象科中耐寒的成员，在上一个冰河时期，猛犸象曾分布在北半球广阔的猛犸草原上，并大约10000年前在其大部分范围内灭绝。无论是通过史前艺术还是从西伯利亚和阿拉斯加发现的冷冻遗骸来看，猛犸象可以说是最具特征的史前动物。这些保存完好的标本为灭绝动物的适应性进化提供了难得的功能表征机会。居住在极端环境中(如北纬度的寒冷地区)需要一系列适应性的进化变化。猛犸象标本的遗传和形态学分析揭示了对寒冷的多种生理适应，包括浓密的长毛、脂肪组织增加、耳朵和尾巴减小以及血红蛋白结构多态性。对其他耐寒哺乳动物的研究已经鉴别了在相同的基因和途径上的许多趋同适应，以及对共享的环境压力源的独特适应。
[0088]
本文所述的组合物和方法部分基于如下的发现，即细胞(例如，非洲草原象细胞)可被修饰以包含和表达来自猛犸象(例如，真猛犸象)的等位基因或同源物。具体而言，无论是通过转染、转导还是修饰现有的大象同源物，都可对活细胞进行基因编辑，以模拟大象基因的猛犸变体或等位基因。在一些实施方式中，猛犸基因的内源性同源物被删除或失活。可对大象的其他非人类亲属的活细胞进行类似的修饰，从而引入猛犸象基因。猛犸变体或等位基因可改变基因编辑细胞的表型。本文还描述了卵母细胞、胚胎(包括嵌合胚胎)和包含此类基因编辑细胞的非人生物体。本文所述的组合物和方法提供了野生动物产品的合成替代品，以及了解濒危和灭绝的野生动物物种的遗传多样性和细胞生物学的新工具。猛犸象基因
[0089]
在一个方面，本文描述了包含编码猛犸象基因的至少一种外源核酸序列、或包含对内源基因的修饰以表达猛犸象同源物或内源基因的变体的活细胞。特别令人感兴趣的是被测序的每一种猛犸象基因组都共享、而被测序的任何大象基因组(亚洲或非洲)都不共享的基因。通过以这种方式筛选基因，已测序的一组猛犸象基因组中的个体变异以及亚洲象和/或非洲象基因组中的变异的影响被最小化，以关注那些完全猛犸的变体序列。鉴于此，如本文所用，“猛犸象基因”、“猛犸象基因变体”或“猛犸象同源物”是编码多肽的基因，该多
肽的序列由所有已测序的猛犸象基因组编码，并且与所有已测序的非洲象和亚洲象基因组编码的同源多肽不同。在这种情况下，“不同于”是指相对于由非洲象或亚洲大象编码的同源多肽，至少有一个氨基酸的差异。如果在经测序的每个猛犸象基因组中都存在至少20个核苷酸的非编码基序、而在经测序的任何亚洲象或非洲象基因组中都不存在，则非编码或调控核酸序列可被视为“猛犸象序列”。通过人类干预而修饰以编码猛犸象基因或基因变体序列的亚洲象或非洲象基因或序列是如本文所用术语的猛犸象基因、或基因、或基因变体。在本文所提及的猛犸象基因或基因变体被发现仅在猛犸象基因组中编码的情况下，并且在猛犸象灭绝的情况下，猛犸象基因或者基因变体序列对活细胞而言必然是外源的；也就是说，猛犸象基因或基因变体序列是“外源的”，无论该序列是通过引入外源序列还是通过基因编辑内源序列来编码猛犸象基因或基因变体序列而存在于细胞中。
[0090]
在一个实施方式中，猛犸象变体基因选自于由表1所列的猛犸象(例如，真猛犸象)基因所组成的组。
[0091]
可使用的猛犸象基因的非限制性实例列于下表(表1)中。本文所述的猛犸象基因参与一系列生物学过程，包括但不限于冷敏感性的调节、热敏性的调节、细胞内ph的调节、轴突生成和发育的调节、trna、代谢过程、细胞粘附、组织发育和形成、基于微管的细胞运动、生物过程的负调控、基因表达、细胞大分子代谢过程等。
[0092]
表1：猛犸象基因
reports，12，217-228(2015)，通过引用以其整体并入本文。
[0094]
本文所述的猛犸象基因可用于本文所述的待在活细胞中表达的任何组合。在任何方面的一些实施方式中，由活细胞包含的至少一种猛犸象核酸序列编码krt8。在任何方面的一些实施方式中，细胞编码和表达猛犸象krt8，并且进一步编码和表达选自表1的至少一种外源猛犸象核酸序列。
[0095]
在任一方面的另一个实施方式中，所述细胞包含编码一种或多种外源多肽的外源核酸，所述外源多肽选自于由表1所列的猛犸象多肽所组成的组。细胞制备
[0096]
本文所述的猛犸象基因可由任何可接受外源遗传物质的活细胞表达。例如，该细胞可为原核细胞或真核细胞。在一些实施方式中，所述细胞为真核细胞。该细胞可为重编程的细胞、非人卵母细胞、非人胚胎的细胞或非人囊胚的细胞。在任何方面的一些实施方式中，所述细胞为成纤维细胞。在一些实施方式中，所述细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞和表皮细胞。在一些实施方式中，细胞先前分化为选自于由如下所组成的组中的细胞：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞和表皮细胞。
[0097]
科学文献为本领域普通技术人员分离和制备用于本文所述组合物和方法所需的细胞提供了指导。下文将进一步讨论细胞的来源。
[0098]
细胞来源：本文所述的细胞可来自任何活的非人类来源或生物体。通常，生物体为动物或脊椎动物，如野生动物、动物园动物、濒危动物、啮齿动物、家畜或鸟类。作为非限制性实例，动物可包括大象、河马、蹄兔、海牛、熊、熊猫、猫科动物(例如老虎、狮子、猎豹、短尾猫)、犬科动物(例如狐狸、狼)、鸟类(例如鸵鸟、鸸鹋、企鹅、鸽子)和鱼类(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方式中，本文所述的细胞来自哺乳动物。细胞可源自其中的生物体的非限制性实例包括：大象(例如，非洲草原象、亚洲象(elephas maximus)、非洲森林象(l.cyclotis))；蹄兔(例如，南非树蹄兔、西非树蹄兔、黄斑岩蹄兔和岩蹄兔)；和海牛(亚马逊海牛、西印度海牛、佛罗里达海牛、安地列斯海牛、西非海牛)。
[0099]
大象细胞：在某些实施方式中，用于本文所述方法和组合物中的细胞为大象细胞。在一些实施方式中，所述细胞为大象成纤维细胞。在一些实施方式中，所述细胞为大象干细胞。在一些实施方式中，本文所述的细胞是重编程为具有干细胞样形态和/或表达本文所述的至少一种干细胞标志物的干细胞或干细胞样表型的大象体细胞。
[0100]
大象细胞在表现出对dna损伤的高水平抗性的哺乳动物细胞之中是独一无二的。也许正是由于这个原因，大象的具有低于包括人类在内的其他哺乳动物的癌症比率。参见例如，abegglen等，potential mechanisms for cancer resistance in elephants and comparative cellular response to dna damage in humans.jama.，(2015)314(17)：1850-1860，通过引用以其整体并入本文。abegglen确定大象细胞抵抗dna损伤的一种机制是大象细胞具有多个拷贝的tp53，tp53是编码肿瘤抑制因子p53的基因。肿瘤抑制蛋白p53在调节哺乳动物细胞的细胞周期、细胞凋亡和基因组稳定性方面发挥着重要作用。p53还参与dna修复蛋白的激活，并可阻止细胞生长。体细胞重编程以表现出干细胞特征或多能性(所谓的诱导多能干细胞，或ips细胞)对于各种真核生物和哺乳动物的细胞来说是公认的。然而，迄今为止，将大象细胞重编程为多能性的努力一直没有成功。不希望受理论的束缚，
认为大象细胞中的高水平的p53表达可能会抑制重编程为多能干细胞表型所需的遗传或表观遗传学修饰。p53表达或活性基因拷贝数的操纵被认为是使大象细胞更容易重编程为干细胞表型的方法。这种操纵可包括例如通过rna干扰(rnai)或相关方法进行的瞬时表达敲除，或例如通过使大象基因组中的一个或多个p53拷贝(大象基因组中存在20个p53基因拷贝)失活进行的稳定的基因组修饰。此类失活可包括例如，通过例如crispr或其他方法进行基因编辑，以删除p53基因的一个或多个活性拷贝或中断p53基因的一个或多个活性拷贝。因此，在一些实施方式中，本文所述的活细胞为经基因编辑的大象细胞，其可包括被编辑以使tp53的一个或多个拷贝删除或失活的细胞。
[0101]
虽然对于在大象细胞中引入外源基因序列或操纵内源性基因序列而言不是绝对必要的，但也考虑单独或与操纵其他dna损伤传感器或dna修复酶相结合来减少p53表达或基因拷贝数，可促进大象细胞的进一步遗传或表观遗传学操纵。
[0102]
本文描述了将大象体细胞重编程为具有干细胞形态并表达至少一种干细胞标志物的干细胞表型。在一些实施方式中，重编程的大象细胞形成胚状体或聚集成簇。
[0103]
asasasas
[0104]
细胞类型：本文所述的细胞可来自通过本领域已知方法从生物体中分离的任何组织。例如，可在幼崽足月分娩后从给定生物体(如大象)中分离胎盘组织，并随后通过本领域已知的方法进行细胞分离和/或培养。可用于本文所述的组合物和方法的额外的示例性细胞类型包括但不限于成纤维细胞、皮肤细胞、血细胞(例如白细胞、单核细胞、树突状细胞)、干细胞、造血细胞、肝细胞、血管细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、神经细胞、眼细胞或视网膜细胞、上皮细胞或内皮细胞、肺细胞、心肌细胞、肠细胞、膈细胞、肾脏(即肾)细胞、骨髓细胞或生物体的任何一种或多种所选择的组织或细胞，考虑对其进行遗传修饰或基因编辑以表达猛犸象基因。
[0105]
也可从冷冻保存的活组织或细胞样品中获得细胞。因此，本文所述的细胞可先前被冷冻保存，或者可为先前被冷冻保存的细胞的后代。细胞和组织经常被冷冻保存，以暂时延长其在生物医学应用中的存活力和有用性。冷冻保存的过程部分涉及将细胞放入含有电解质和化学化合物的水性溶液中，这些电解质和化学化合物在冷冻过程中保护细胞(冷冻保护剂)。这种冷冻保护剂通常为小分子量分子，如甘油、丙二醇、乙二醇或二甲基亚砜(dmso)，其在细胞冷冻时防止或限制细胞内冰晶的形成。用于冷冻保存和解冻或在培养物中重新建立先前冷冻的细胞的方案是本领域已知的，例如，us专利no.9,877,475b2；karlsson j.o.，toner m.long-term storage of tissues by cryopreservation:critical issues.biomaterials，1996，17：243-256和d.e.principles of cryopreservation.methods mol biol.，2007，368：39-57，通过引用以其整体并入本文。
[0106]
干细胞：在某些实施方式中，本文所述的组合物和方法使用或产生干细胞。干细胞是通过细胞有丝分裂保持自我更新能力的细胞，并可分化为更特化的细胞类型。哺乳动物干细胞的三大类型包括：见于囊胚中的胚胎干(es)细胞、从体细胞重编程的诱导多能干细胞(ipsc)和见于成年组织中的成年干细胞。干细胞的其他来源可包括例如羊膜来源的或胎盘来源的干细胞。多能干细胞可分化为来源于三个胚层中的任一个的细胞。
[0107]
基本上可从任何体细胞组织中获得用于本文所述的组合物和方法中的细胞，但在大象或其他物种濒危的情况下，应采取努力以避免可能对动物造成长期伤害的任何程序。
在期望例如大象的细胞的情况下，用于操纵(包括但不限于引入猛犸象基因和测试此类基因的表型效应)的细胞的一个来源为产后胎盘，其通常在新生儿分娩后分娩出。胎盘组织提供了丰富的活细胞来源，这些活细胞可在没有伤害动物风险的情况下获得，并且可例如在圈养动物出生后获得。在一些实施方式中，从一种动物的产后胎盘获得本文所述的细胞。在胎盘、并且例如脐带组织和脐带血往往富含干细胞的情况下，这些组织代表了包括大象细胞在内的细胞来源，这些细胞已经具有干细胞特征。虽然这些大象组织中的干细胞不是多能性的，但特别考虑的是，在这些组织天然包含干细胞的情况下，胎盘或脐带或脐带血干细胞可用于衍生分化程度较低的干细胞，包括通过重编程衍生的多能干细胞(关于重编程为干细胞或多能干细胞表型的更多信息，参见下文)。在一些实施方式中，本文提供的组合物和方法不包括源自获取自活的人类胚胎的细胞的分化的人类细胞的产生或使用。
[0108]
胚胎干细胞：源自胚胎来源的细胞可包括从干细胞库或其他公认的保藏机构获得的胚胎干细胞或干细胞系。用于生产干细胞系的其他方式包括如下方法，所述方法包括使用来自在囊胚形成之前(在大约8细胞期)的早期胚胎的卵裂球细胞。例如，此类技术使用在辅助生殖诊所常规实践的植入前基因诊断技术中移除的单细胞。单一卵裂球细胞可与已建立的es细胞系共培养，然后从中分离，以形成完全胜任的es细胞系。例如，类似的方法可针对动物饲养过程中例如通过体外受精产生的早期动物胚胎进行。
[0109]
胚胎干细胞及其回收方法描述于例如trounson a.o.reprod.fertil.dev.(2001)13：523；roach m l methods mol.biol.(2002)185：1和smith a.g.annu rev cell dev biol(2001)17：435。术语“胚胎干细胞”用于指胚胎囊胚的内部细胞团块的多能干细胞(参见例如us专利no.5,843,780、6,200,806)。类似地，可从源自体细胞核转移的囊胚的内部细胞团块中获得此类细胞(参见例如us专利no.5,945,577、5,994,619、6,235,970)。
[0110]
本领域技术人员很容易识别未分化的胚胎干(es)细胞，并且通常在二维的显微视图中表现为具有包含高核质比和显著的核仁的形态的细胞集落。胚胎干细胞的内源性多肽标志物包括例如oct3、nanog、sox2、ssea1、ssea4和tra-1-60中的任何一种或任何组合。在一些实施方式中，用于本文所述的方法和组合物中的细胞不是来源于胚胎干细胞或胚胎来源的任何其他细胞。
[0111]
在本文所述的任一方面的一些实施方式中，本文所述的细胞表达至少一种干细胞标志物。
[0112]
在任何方面的一些实施方式中，干细胞标志物选自于由tra-1-60、pou5f1、nanog所组成的组。
[0113]
诱导多能干细胞(ipsc)：在本文所述的某些实施方式中，分化的体细胞的重编程使分化细胞呈现出具有自我更新和向所有三个胚层谱系的细胞分化的能力的未分化状态。这些是诱导多能干细胞(ipsc或ips细胞)。
[0114]
尽管在生理环境下分化通常是不可逆的，但近年来已经开发了数种方法来将体细胞重编程为诱导多能干细胞。示例性方法是本领域技术人员已知的，并在下文中简要描述。
[0115]
将体细胞重编程为ips细胞的方法描述于例如us专利no.8,129,187b2、8,058,065b2；us专利申请2012/0021519a1；singh等，front.cell dev.biol.(2015年2月)；以及park等，nature，451：141-146(2008)；通过引用以其整体并入本文。具体而言，ipsc通过引入重编程转录因子的组合而从体细胞中产生。重编程因子可作为例如蛋白、核酸(mrna分
子、dna构建体或编码它们的载体)或其任何组合引入。小分子也可增强或补充引入的转录因子。虽然已经确定了额外的因子会影响例如重编程的效率，但足以组合以将体细胞重编程为诱导多能状态的四种重编程因子的标准集包括oct4(八聚体结合转录因子-4)、sox2(性别决定区y)-盒2、klf4(kruppel样因子-4)和c-myc。已发现额外的蛋白或核酸因子(或编码它们的构建体)或小分子化学试剂取代来自四种重编程因子的基础或标准集中的一种或其余的重编程因子、或提高重编程的效率，所述额外的蛋白或核酸因子包括但不限于lin28+nanog、esrrb、pax5 shrna、c/ebpα、p53 sirna、utf1、dnmt shrna、wnt3a、sv40 lt(t)、htert，所述小分子化学试剂包括但不限于bix-01294、bayk8644、rg108、aza、地塞米松、vpa、tsa、saha、pd0325901+chir99021(2i)和a-83-01。
[0116]
重编程是改变或逆转分化细胞(如体细胞)的分化状态的过程。换句话说，重编程是驱使细胞的分化回至更加未分化或更原始类型的细胞的过程。应该注意的是，将许多原代细胞置于培养物中可导致完全分化的特征的一些损失。然而，简单地培养包括在术语分化细胞中的这些细胞并不能使这些细胞成为未分化细胞或多能细胞。分化细胞向多能性的转变需要重编程刺激，而不是在将分化细胞置于培养物中时引起分化特征部分丧失的刺激。相对于原代细胞亲本，重编程细胞还具有在不损失生长潜力的情况下延长传代能力的特征，原代细胞通常在培养中仅具有有限数量分裂的能力。
[0117]
待重编程的细胞可在重编程之前部分或终末分化。因此，待重编程的细胞可成为终末分化的体细胞、以及成年干细胞或成体干细胞。
[0118]
在一些实施方式中，重编程包括分化细胞(例如体细胞)的分化状态完全逆转为多能状态或多潜能状态。重编程可引起细胞表达特定的基因，该基因的表达进一步有助于重编程。
[0119]
可通过如下所示的添加各种小分子来提高来源于起始细胞群体的重编程效率(即重编程细胞的数量)：shi，y.等，(2008)cell-stem cell，2：525-528；huangfu，d.等，(2008)nature biotechnology，26(7)：795-797和marson，a.等，(2008年)cell-stem cell，3：132-135。增强重编程效率的试剂的一些非限制性实例包括可溶性wnt、wnt条件培养基、bix-01294(g9a组蛋白甲基转移酶)、pd0325901(mek抑制剂)、dna甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰酶(hdac)抑制剂、丙戊酸、5'-氮杂胞苷、地塞米松、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、维生素c和曲古抑菌素(tsa)等。
[0120]
可测试经分离的ipsc克隆的一种或多种干细胞标志物的表达。在来源于体细胞的细胞中的这种表达将细胞鉴定为诱导多能干细胞。干细胞标志物可包括但不限于ssea3、ssea4、cd9、nanog、oct4、fbx15、ecat1、esg1、eras、gdf3、fgf4、cripto、dax1、zpf296、slc2a3、rex1、utf1和nat1等。在一个实施方式中，将表达nanog和ssea4的细胞鉴定为多能的。
[0121]
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，本文所述的细胞表达至少一种干细胞标志物多肽或多能干细胞标志物多肽，而在重编程之前该细胞或其亲本细胞不表达所述干细胞标志物多肽或多能干细胞标志物多肽。如本文上下文中所用，新的干细胞标志物不是由引入的核酸序列或构建体编码的、而是在引入一种或多种重编程因子后被诱导表达的标志物。
[0122]
检测此类标志物表达的方法可包括例如rt-pcr和检测编码多肽存在的免疫学方
法，如蛋白印迹、免疫细胞化学或流式细胞术分析。最好通过rt-pcr鉴定细胞内标志物，而细胞表面标志物很容易通过例如免疫细胞化学进行鉴定。
[0123]
可通过评估ipsc分化为三个胚层中的每一个的细胞的能力的测试来确认经分离的细胞的多能干细胞特性。作为一个实例，裸鼠中的畸胎瘤的形成可用于评估分离的克隆的多能特性。将细胞引入裸鼠，并使用对不同生殖系谱系的标志物而言特异的抗体针对由细胞产生的肿瘤实施组织学和/或免疫组织化学。包含来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的肿瘤的生长进一步表明或证实了这些细胞为多能干细胞。
[0124]
在一些实施方式中，将细胞(如大象细胞)进行处理以诱导重编程，并产生具有与起始体细胞不同的干细胞样形态且表达在重编程前不表达的一种或多种干细胞标志物的细胞。例如，此类标志物最主要选自干细胞标志物tra-1-60、ssea4、pou5f1和nanog。
[0125]
间充质干细胞(msc)：在某些实施方式中，本文所述的干细胞为间充质细胞(msc)。间充质干细胞具有增殖和分化为肌肉、骨骼(即骨)、血液和血管细胞类型以及结缔组织(特别是成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、心肌细胞和骨骼成肌细胞)的能力。
[0126]
可从本文所述的成年生物体的骨髓或脂肪组织或新生儿的脐带血中回收间充质干细胞。这些细胞被称为间充质干细胞(msc)，因为它们可被进行有限数量的传代的离体培养，并在单细胞水平上分化为如上所述的中胚层细胞类型。
[0127]
分离、纯化和扩增间充质干细胞(msc)的方法是本领域已知的，并且包括在例如u.s.pat.no.5,486,359和jones e.a.等，2002，isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells,arthritis rheum.，46(12)：3349-60。kassis等，bone marrow transplant.，2006年5月；37(10)：967-76描述了从外周血中分离间充质干细胞的方法。zhang等，chinese medical journal，2004，117(6):882-887描述了从胎盘组织中分离间充质干细胞的方法。kern等，stem cells，2006；24：1294-1301描述了分离和培养脂肪组织、胎盘和脐带血间充质干细胞的方法。
[0128]
胚胎干细胞(esc)也可用作产生msc的来源。存在本领域已知的将esc分化为msc的许多方法。例如，参见us专利no.9,725,698b2；u.s.pat.no.5,486,359。
[0129]
在本文所述的任何方面的一些实施方式中，本文所述的细胞表达至少一种msc细胞标志物。
[0130]
用于鉴定msc的标志物包括但不限于分化蛋白簇，包括例如cd13、cd29、cd44、cd71、cd73、cd90、cd105、cd146、cd166、stro-1、波形蛋白和ssea-4。如在人类细胞中举例说明的，但仍然适用于非人类干细胞生物学的msc的额外的标志物和培养msc的方法在如下中进行了综述，例如ullah i等，human mesenchymal stem cells-current trends and future prospective.biosci rep.，2015；35(2)：e00191，通过引用以其整体并入本文。
[0131]
干细胞、诱导多能干细胞、诱导间充质干细胞或具有诱导干细胞形态并表达一种或多种干细胞标志物的细胞在适当条件下培养时具有分化为一种或多种不同表型的能力。因此，无论体细胞被重编程为多能性的还是被重编程为具有诱导但更有限分化能力的细胞，从重编程的细胞分化的细胞都可用于例如评估由引入一个或多个猛犸象基因诱导的表型差异。为此目的，可在细胞重编程为分化较少的形式之前引入猛犸象基因。或者，可在细胞被重编程后并且例如在细胞重新分化为期望表型之前，引入猛犸象基因。
[0132]
在细胞个体发生的背景下，术语“使
…
分化”或“分化”是相对的术语，意味着“分化
的细胞”是在发育途径上比其前体细胞进展得更远的细胞。因此，在一些实施方式中，重编程细胞可分化为谱系受限的前体细胞(例如中胚层干细胞)，其又可分化为沿着该途径进展更远的其他类型的前体细胞(例如组织特异性前体)，然后分化为终末期分化细胞，其在特定组织类型中发挥特征性作用，并且可保留也可不保留进一步增殖的能力。
[0133]
体外分化的细胞：本文所述的某些方法和组合物使用在体外从干细胞分化的细胞。一般来说，在整个分化过程中，多能细胞将沿着特定的发育谱系遵循发育途径，例如原胚层-外胚层、中胚层或内胚层。
[0134]
胚胎胚层是所有组织和器官的来源。例如，中胚层是平滑肌和横纹肌(包括心肌)、结缔组织、血管、心血管系统、血细胞、骨髓、骨骼、生殖器官和排泄器官的来源。
[0135]
可通过特定生物标志物的表达和基因表达来鉴别胚层。检测这些生物标志物的测定包括例如rt-pcr、免疫组织化学和蛋白印迹。由早期中胚层细胞表达的生物标志物的非限制性实例包括hand1、esm1、hand2、hopx、bmp10、fcn3、kdr、pdgfr-α、cd34、tbx-6、snail-1、mesp-1和gsc等。由早期外胚层细胞表达的生物标志物包括但不限于trpm8、pou4f1、olfm3、wnt1、lmx1a和cdh9等。由早期内胚层细胞表达的生物标志物包括但不限于lefty1、eomes、nodal和foxa2等。本领域技术人员可基于细胞类型和该细胞在发育中所来源的胚层来确定在执行分化方案时监测哪些谱系标志物。
[0136]
在体外诱导特定发育谱系通过在促进谱系定型(lineage commitment)的特定试剂或其组合的存在下培养干细胞来实现。通常，本文所述的方法包括将试剂(例如，小分子、生长因子、细胞因子、多肽、载体等)逐步添加到细胞培养基中，或使细胞与促进分化的试剂接触。例如，中胚层的形成由转录因子和生长因子信号传导诱导，包括但不限于vegt、wnt信号传导(例如，通过β-连环蛋白)、骨形态发生蛋白(bmp)途径、成纤维细胞生长因子(fgf)途径和tgfβ信号传导(如激活素a)。参见例如clemens等，cell mol life sci，(2016)，通过引用将其整体并入本文。促进内胚层形成的方法和试剂描述于例如loh等，cell stem cell，14(2)：237-252(2014)。促进外胚层形成的方法和试剂描述于例如rogers等，birth defects res c embryo today，87(3)：249-262，(2009)，ozir等，wiley interdicip.rev dev biol.，2(4)：479-498(2013)和sareen等，j comp neurol 522(12)：2707-2728(2014)，通过引用将其整体并入本文。
[0137]
通常，体外分化的细胞将在整个循序渐进的过程中表现出多能性或干细胞标志物(如hnf4-α、afp、gata-4和gata-6)的下调，并表现出谱系特异性生物标志物(如中胚层、外胚层或内胚层标志物)的表达增加。例如，参见tsankov等，nature biotech(2015)，其描述了人类多能干细胞系的特征和沿着特定谱系的分化。可通过本领域已知的多种方法监测分化过程的效率。这包括使用标准技术检测胚层生物标志物的存在，所述标准技术例如免疫细胞化学、rt-pcr、流式细胞术、功能测定、光学跟踪等。将猛犸象基因引入细胞的方法
[0138]
在任何方面的某些实施方式中，本文所述的细胞组合物表达由至少一种猛犸象核酸序列或基因(包括但不限于表1中的外源猛犸象基因)编码的多肽。
[0139]
本文所述的细胞可通过本领域已知的方法转染、接触或给予本文所述的外源猛犸象基因。
[0140]
在一些实施方式中，通过载体递送编码猛犸象基因的至少一个核酸序列。
[0141]
载体为核酸构建体，被设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移遗传物质。如本文所使用的，载体可为病毒性的或非病毒性的。术语“载体”包括与适当的控制元件相关联时能够复制并能够将遗传物质转移到细胞的任何遗传元件。载体可包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒粒子等。
[0142]
在任何方面的一些实施方式中，载体选自于由质粒、粘粒和病毒载体所组成的组。
[0143]
表达载体是指导rna或多肽(例如猛犸象多肽)从其中包含的与载体上的转录调控序列连接的核酸序列中表达的载体。所表达的序列通常(但不必须)与细胞异源；被引入活的细胞中的猛犸象基因与该细胞是异源的。表达载体可包含额外的元件，例如，表达载体可具有两个复制系统，从而允许其被维持在两种生物体中(例如在用于表达的动物细胞中和在用于克隆和扩增的原核宿主中)。“表达”是指参与产生rna和蛋白以及在适当情况下分泌蛋白的细胞过程，在适用时，包括但不限于例如转录、转录加工、翻译和蛋白折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的rna，以及通过从基因转录的mrna的翻译而获得的多肽。
[0144]
在一些实施方式中，载体能够驱动哺乳动物细胞中的一个或多个序列的表达；即载体为哺乳动物表达载体。哺乳动物表达载体的实例包括pcdm8(seed，1987，nature，329:840)和pmt2pc(kaufman等，1987，embo j.，6：187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，通常由一种或多种调节元件提供表达载体的控制功能。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猴病毒40，以及本文公开的和本领域已知的其他启动子。对于适合于原核细胞和真核细胞的其他表达系统，参见例如sambrook等，molecular cloning:alaboratory manual.2nd ed.,cold spring harbor laboratory,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,1989的第16章和第17章。
[0145]
在一些实施方式中，重组表达载体能够优先在特定细胞类型中指导外源猛犸象核酸序列的表达(例如，将组织特异性调节元件用于在例如造血细胞或毛囊干细胞中表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性的；pinkert等，1987，genes dev.，1：268-277)、淋巴特异性启动子(calame和eaton，1988，adv.hnmunol，43：235-275)，特别是t细胞受体(winoto和baltimore，1989，embo j.，8：729-733)和免疫球蛋白的启动子(baneiji等，1983，cell，33：729-740；queen和baltimore，1983，cell，33：741-748)、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；byrne和ruddle，1989，proc.natl.acad.sci.usa，86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(edlund等，1985，science，230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；u.s.pat.no.4,873,316和欧洲申请公开no.264,166)。发育调控的启动子也被包括在内，例如鼠hox启动子(kessel和gruss，1990，science，249：374-379)和甲胎蛋白启动子(campes和tilghman，1989，genes dev.，3：537-546)。虽然将猛犸象基因置于组成型启动子的控制下以评估或定量其对细胞或组织功能的影响可能是有用的，但在某些实施方式中，将外源猛犸象基因置于宿主细胞中的调节元件的控制下可能是有利的，所述调节元件对应于在其天然环境中与猛犸象基因连接的那些调节元件。因此，为了评估或定量猛犸象血红蛋白基因或猛犸象毛发相关基因的作用，作为非限制性实例，可使用调节元件来驱动宿主生物体的细胞(例如造血细胞或毛囊干细胞)中的这些基因的相应同源物。此外，或备选地，将宿主细胞的用于给定基因的调节序列或与猛犸象基因同源的序列修饰为更类似于猛犸调节序列也可以是有利的。
[0146]
在一些实施方式中，通过整合载体将本文所述的至少一种核酸序列递送至本文所述的细胞。整合载体将其递送的遗传物质(或其拷贝)永久整合到宿主细胞染色体中。非整合载体保持游离型，这意味着其中包含的核酸从未整合到宿主细胞染色体中。整合载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、杂交腺病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
[0147]
在一些实施方式中，通过非整合载体将本文所述的至少一种核酸序列递送至本文所述细胞。非整合载体包括非整合病毒载体。非整合病毒载体消除了整合的逆转录病毒引起的主要风险之一，因为它们不会将其基因组整合到宿主dna中。一个实例是epstein barr orip/核抗原-1(“ebna1”)载体，它能够有限地自我复制，并且已知在哺乳动物细胞中发挥作用。含有来自eb病毒的两个元件orip和ebna1，ebna1蛋白与病毒复制子区域orip结合，使质粒在哺乳动物细胞中保持相对长期的游离存在。orip/ebna1载体的这一特定特征使其成为产生无整合宿主细胞的理想载体。其他非整合病毒载体包括腺病毒载体和腺相关病毒(aav)载体。
[0148]
另一种非整合病毒载体为rna仙台病毒载体，它可在不进入受感染的细胞的细胞核的情况下产生蛋白。f缺陷的仙台病毒载体在受感染的细胞的细胞质中保留几代，但在数代(例如10代)后迅速稀释并完全丢失。这允许所选择的一个或多个异源基因在靶细胞中的自限性瞬时表达。例如，这个方面对于重编程因子的瞬时引入以及其他用途而言可以有帮助的。如上所述，在一些实施方式中，本文所述的猛犸象核酸序列在细胞中从病毒载体表达。“病毒载体”包括核酸载体构建体，该构建体包含病毒来源的至少一种元件，并具有被包装成病毒载体颗粒的能力。病毒载体可包含编码本文所述的多肽的核酸来代替非必需的病毒基因。载体和/或颗粒可用于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的。
[0149]
在某些实施方式中，通过非病毒方法将本文所述的猛犸象核酸分子引入细胞。可使用任何转染试剂或促进核酸进入细胞的其他物理手段来递送本文所述的核酸。
[0150]
核酸的非病毒递送方法包括脂质转染、核转染、显微注射、电穿孔、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸dna、人工病毒粒子和试剂增强的dna摄取。例如，在u.s.pat.no.5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述了脂质转染，并且脂质转染试剂是商业化销售的(例如transfectam
tm
和lipofectin
tm
)。适用于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括felgner、wo 91/17424、wo 91/16024的那些。可递送至细胞(例如体外或离体给予)或靶组织(例如体内给予)。
[0151]
脂质:核酸复合物(包括靶向脂质体，如免疫脂质复合物)的制备是本领域技术人员众所周知的(参见例如，crystal，science，270：404-410(1995)；blaese等，cancer gene ther.，2：291-297(1995)；behr等，bioconjugate chem.，5：382-389(1994)；remy等，bioconjugate chem.，5：647-654(1994)；gao等，gene therapy，2：710-722(1995)；ahmad等，cancer res.，52：4817-4820(1992)；u.s.pat.no.4,1861,83、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
[0152]“增加细胞摄取的试剂”为促进分子(例如核酸、肽或多肽，或不能有效地跨脂质膜而穿过细胞膜的其他分子)转运的分子。例如，核酸可与亲脂性化合物(例如，胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(cpp)(例如，penetratin、tat、syn1b等)或多胺(例如，精胺)偶联。例如，在winkler(2013)，oligonucleotide conjugates for therapeutic applications.ther.deliv.，4(7)：791-809中公开了增加细胞摄取的试剂的进一步实例。
[0153]
在任何方面的一些实施方式中，对本文所述的细胞(例如大象细胞)进行修饰以表达本文所述的一个或多个猛犸象基因。可通过上面讨论的或本领域已知的任何方法将编码猛犸象基因的一个或多个核酸序列递送到细胞。下面进一步讨论用于以本文所述的一个或者多个核酸序列成功转染本文所述的细胞的细胞标志物。抑制或编辑内源性基因表达的方法
[0154]
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的细胞不表达本文所述的至少一种猛犸象基因的内源性同源物。在任何方面的另一个实施方式中，对细胞进行编辑以抑制至少一种猛犸象基因的内源性同源物的表达。
[0155]
在任一方面的另一个实施方式中，外源核酸序列的非猛犸象同源物已被删除或失活。
[0156]
在本文之列的是，当将一个或多个猛犸象基因递送到宿主细胞时，修饰一个或多个基因的内源性非猛犸象同源物以使内源性的一个或多个基因失去功能可能是有利的。在本文进一步考虑之列的是，如果将两个以上的猛犸象基因递送到宿主细胞，则一个或两个内源性宿主细胞基因将被改变。因此，在这种情况下，宿主细胞可包含对应的猛犸象基因的至少一种非功能的内源性同源物。
[0157]
在大象细胞的情况下，待表达的一个或多个猛犸象基因的大象同源物将被改变、删除或抑制，以使仅一个或多个猛犸象发生(genesis)/被细胞表达。这可通过例如靶序列的标准基因编辑来实现。还在考虑之列的是，例如通过同源重组、或通过选择性编辑非猛犸同源基因以编码和表达猛犸变体基因序列，而不是简单地使内源基因失活，也可实现内源基因的大规模替换。
[0158]
可通过本领域已知的方法确定靶序列。例如，序列比对工具可被用于将猛犸象核酸序列与宿主生物体中的核酸序列进行比较，例如使用ncbi基本局部比对序列工具(blast)、orthomam、ensembl和/或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。
[0159]
抑制宿主细胞中的基因功能的方法是本领域已知的。基因敲除、抑制和改变的非限制性实例包括crispr/cas9系统、转录激活因子样效应物核酸酶(talens)和抑制性核酸。抑制性核酸类型的示例性实施方式可包括例如本领域已知的sirna、shrna、mirna和/或amirna。本领域普通技术人员可设计和测试靶向本文所述的猛犸象基因的内源性同源物的抑制剂。
[0160]
制备和递送基因编辑系统的方法描述于例如wo2015/013583a2；us pat no.10,640,789b2；us pg.no.us2019/0367948a1；us pg no.2017/0266320a1；us pg no.2018/0171361a1；us pg.no.2016/0175462a1；以及us pg.no.2018/0195089a1，通过引用将其各自的内容以其整体并入本文。
[0161]
通常，crispr(规律成簇的间隔短回文重复序列)统指基因修饰系统，该系统使用源自针对噬菌体的原核防御机制的酶和因子来精确修饰给定细胞类型中的靶基因序列。crispr基因编辑系统可包括参与crispr相关(“cas”)基因的表达或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码cas核酸酶基因的序列、tracr(反式激活crispr)序列(例如tracrrna或活性部分tracrrna)、tracr-mate序列(在内源性crispr系统的情况下包括“直接重复”和经tracrrna处理的部分直接重复)、引导序列(在内源性crispr系统的情况下也称为“间隔
区”)或来自crispr基因座的其他序列和转录物。在一些实施方式中，crispr系统的一个或多个元件源自i型、ii型或iii型crispr系统。在一些实施方式中，crispr系统的一个或多个元件源自包含内源性crispr系统(例如化脓性链球菌，streptococcus pyogenes)的特定生物体。
[0162]
将crispr系统的引导序列设计为与靶序列(例如，本文所述的一个或多个猛犸象基因的大象同源物)具有互补性。靶序列可包含任何dna、rna多核苷酸序列。靶序列和引导序列之间的杂交促进crispr复合物的形成。与靶序列杂交并与一个或多个cas蛋白复合的引导序列引起靶序列中或附近(例如距靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。靶序列和引导序列之间的完全互补性不是必须的，只要存在足够的互补性来引起杂交并促进crispr复合物的形成。
[0163]
当期望编辑基因时，编辑序列或编辑模板多核苷酸可用于重组到包含靶序列的靶基因座中。在一些实施方式中，所述重组为同源重组。例如，猛犸象基因的大象同源物可被改变或删除，并被本文所述的一个或多个猛犸象基因序列取代。
[0164]
碱基编辑是改变本文所述的内源性基因的另一种方法。碱基编辑可用于在细胞dna或rna中引入点突变，而不产生双链断裂。在一些实施方式中，本文所述的改变内源性核酸的方法是通过胞嘧啶碱基编辑、腺嘌呤碱基编辑、反义寡核苷酸指导的a至i rna编辑或cas 13碱基编辑。碱基编辑的方法是本领域已知的，并描述于例如rees等，nature rev genet，19(12)，770-788(2018)和kopmor等，nature，533，420-424(2016)，通过引用将其整体并入本文。
[0165]
可将crispr系统或碱基编辑元件组合在单个载体中，并可以以任何合适的取向排列，例如一个元件相对于第二个元件位于5
′
(“上游”)或相对于第二元件位于3
′
(“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二元件的编码序列的相同或相反的链上，并且以相同或相反的方向取向。在一些实施方式中，单个启动子驱动编码crispr酶的转录物和一个或多个引导序列、tracr mate序列(任选地可操作地连接到引导序列)和嵌入一个或更多个内含子序列中的tracr序列(例如，各自在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或全部在单个内含子中)的表达。在一些实施方式中，crispr酶、引导序列、tracr mate序列和tracr序列可操作地连接到同一启动子并从其表达。
[0166]
在一些实施方式中，用基因编辑系统的组分瞬时转染本文所述的细胞(例如通过一种或多种载体的瞬时转染，或用rna转染)，并通过crispr或碱基编辑复合物的活性进行修饰，以建立新的细胞或细胞系，所述细胞或细胞系包括含有对宿主细胞基因的修饰的细胞。
[0167]
在一些实施方式中，本文所述的细胞为经基因编辑的大象细胞。在一些实施方式中，一个或多个大象基因已被改变以编码本文所述的猛犸象基因中的一个或多个。
[0168]
本文提供了包含表2或表3中所列的至少一种引导rna的大象细胞。在一个实施方式中，大象细胞包含表2和/或表3中所列的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至
少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50个、至少51个、至少52个、至少53个、至少54个、至少55个、至少56个、至少57个、至少58个、至少59个、至少60个、至少61个、至少62个、至少63个、至少64个、至少65个、至少66个、至少67个、至少68个、至少69个、至少70个、至少71个、至少72个、至少73个、至少74个、至少75个、至少76个、至少77个、至少78个、至少79个、至少80个、至少81个、至少82个、至少83个、至少84个、至少85个、至少86个、至少87个、至少88个、至少89个、至少90个、至少91个、至少92个、至少93个、至少94个、至少95个、至少96个、至少97个、至少98个、至少99个、至少100个或更多个引导rna。在大象细胞表达超过1个的引导rna(即，至少2个引导rna)的情况下，所述至少2个引导rna的表达可同时或顺序地进行。
[0169]
在一个实施方式中，大象细胞进一步表达由至少一种引导rna引导的rna引导核酸内切酶。rna引导核酸内切酶在本领域是众所周知的，并且本文描述了示例性核酸内切酶。
[0170]
本文还提供了包含表2或表3中所列的至少一种引导rna的非人细胞。在一个实施方式中，所述非人细胞包含表2和/或表3中所列的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个、至少37个、至少38个、至少39个、至少40个、至少41个、至少42个、至少43个、至少44个、至少45个、至少46个、至少47个、至少48个、至少49个、至少50个、至少51个、至少52个、至少53个、至少54个、至少55个、至少56个、至少57个、至少58个、至少59个、至少60个、至少61个、至少62个、至少63个、至少64个、至少65个、至少66个、至少67个、至少68个、至少69个、至少70个、至少71个、至少72个、至少73个、至少74个、至少75个、至少76个、至少77个、至少78个、至少79个、至少80个、至少81个、至少82个、至少83个、至少84个、至少85个、至少86个、至少87个、至少88个、至少89个、至少90个、至少91个、至少92个、至少93个、至少94个、至少95个、至少96个、至少97个、至少98个、至少99个、至少100个或更多个引导rna。在非人细胞表达超过1个的引导rna(即，至少2个引导rna)的情况下，所述至少2个引导rna的表达可同时或顺序地进行。
[0171]
表2和表3包括本文中在某些非洲象和猛犸象基因之间鉴定的示例性点突变，以及用于改变非洲象基因以模拟猛犸象基因的基因编辑方法。例如，表2和表3为各种基因编辑工具(即crispr cas-9和spryc)提供了引导rna序列，这些工具将产生经鉴定的点突变。“spryc”是指从spcas9-vrqr进行工程化的变体，spcas9-vrqr被设计用于识别几乎所有的pam序列，并且在碱基编辑方面非常有效。spry进一步描述于例如zhang d.和shang b.spry:engineered crispr/cas9 harness new genome-editing power.trends genet.，2020年8月；36(8)：546-548；通过引用将其整体并入本文。
[0172]
本文进一步提供了包含选自seq id no：1至seq id no：426的序列的引导rna。
[0173]
本文还提供了包含本文所述的任何引导rna的细胞。在一个实施方式中，该细胞进一步包含rna引导核酸内切酶，该酶的活性由引导rna引导。
[0174]
本文还提供了编码本文所述的任何引导rna的核酸。在一个实施方式中，编码引导rna的核酸可操作地连接到指导引导rna的表达的核酸序列。
[0175]
本文还提供了包含本文所述的任何核酸的载体。
[0176]
本文还提供了包含本文所述的任何核酸的细胞。在一个实施方式中，所述细胞进一步包含rna引导核酸内切酶，该酶的活性由引导rna引导。
[0177]
本文还提供了包含本文所述的任何载体的细胞。在一个实施方式中，所述细胞进一步包含rna引导核酸内切酶，该酶的活性由引导rna引导。猛犸象的基因表达和表型
[0178]
本文所述的组合物和方法可用于在活的非人细胞中表达猛犸象基因。在任何方面的一些实施方式中，大象细胞表达表1中的一个或多个猛犸象基因。
[0179]
在任何方面的一些实施方式中，本文所述的细胞表现出与本文所述的猛犸象基因(例如，表1中的那些)的细胞功能或表达相关的表型。
[0180]
可通过本领域已知的任何方法将猛犸象表型与宿主细胞表型区分开，例如通过形态学(例如通过显微镜)、免疫组织化学、电生理记录、代谢测定、rt-pcr、蛋白组学或测序分析。
[0181]
可通过使用标准方法检测或测量rna和/或蛋白来确定指示给定表型的基因(例如，表1中的一个或多个猛犸象基因)的表达。
[0182]
代谢测定可用于确定本文所述的细胞的分化阶段和/或功能表型。例如，本文所述的猛犸象基因可调节给定细胞中的蛋白合成速率和atp产生速率等过程。代谢测定的非限制性实例包括细胞生物能量学测定(例如，seahorse bioscience xf细胞外通量分析仪
tm
)，以及耗氧量测试。具体而言，可通过耗氧率(ocr)、脂肪酸应激测试期间的ocr追踪(trace)、ocr的最大变化、添加fccp后ocr的最大变化以及最大呼吸能力等参数来量化细胞代谢。此外，代谢挑战(metabolic challenge)或乳酸盐富集测定可提供细胞成熟度、分化阶段的测量，或递送到这些细胞的各种核酸序列的效果的测量。经由例如表达、荧光或生物发光测定，通过例如ucp1和hif1a活性来测量棕色脂肪的产热。
[0183]
本文所述的猛犸象基因可改变宿主细胞的电生理特性。可改变本文所述的细胞的电生理特性的基因的非限制性实例包括：trpm8、trpv3、trpa1和trpv4。
[0184]
测量细胞电生理功能的方法是本领域已知的。确定细胞的电生理功能的此类方法的非限制性实例包括全细胞膜片钳(手动或自动的)、多电极阵列、场电位刺激、钙成像和光学标测等。可在全细胞电流钳或场电位记录期间对细胞进行电刺激，以产生电响应。本文所述的细胞的场电位和生物电位的测量可用于确定分化阶段和/或猛犸象表型。
[0185]
检测瞬时受体电位(trp)通道活性的方法是本领域已知的，并描述于例如samanta等，subcell biochem，2018，87：141-165以及talavera和nilius，trp channels.ch.11.boca raton(fl):crc press/taylor&francis，2011，通过引用将其整体并入本文。大多数trp通道对钙(ca
2+
)是可渗透的，因此在多种细胞类型中构成ca
2+
进入通道。因此，在一些实施方式中，与适当的对照相比，本文描述的细胞的表型涉及钙信号的调节和/或电生理功能的调节。
[0186]
在某些实施方式中，与适当的对照相比，本文所述的细胞的表型涉及细胞膜的脂质组成的调节。在一些实施方式中，与适当的对照相比，本文所述的细胞的表型涉及蛋白合成速率的调节，和/或细胞增殖速率、转录组学谱和分化潜能(对于干细胞)的调节。
[0187]
可通过例如液相色谱-质谱(lc-ms)或电喷雾电离(esi)来确定细胞膜的脂质组成。测量蛋白合成速率的方法在例如princiotta等，immunity，第18卷：343-354(2003)中进
行了讨论，通过引用将其整体并入本文。可使用市售试剂盒或流式细胞仪确定细胞增殖率，例如，thermofisher(目录号：c34564)或(细胞增殖试剂盒i(mtt)，目录号：11465007001)销售的试剂盒。
[0188]
本领域技术人员可确定适当的测定来检测和测量特定细胞表型的改变。该测定的结果可与适当的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，合适的对照细胞是未被修饰以包含或表达本文所述的猛犸象基因的细胞。遗传学上修饰的卵母细胞、囊胚和非人类生物体
[0189]
通过将细胞核从供体细胞(如胚胎)转移到去核卵母细胞或单细胞受精卵来重建胚胎，使得能够产生遗传学上相同的个体。体细胞核转移或scnt是本领域已知的用于生物体(例如哺乳动物)重建和繁殖的实验室程序。这对研究和商业应用(即，遗传学上有价值的牲畜的繁殖、野生动物产品的一致性、动物管理和生态保护工作)都有明显的优势。
[0190]
可通过在核转移和/或核转移程序之前修饰供体细胞的染色质来产生本文所述的组合物。
[0191]
在各种情况下，对供体细胞进行修饰以编码和表达本文所述的猛犸象基因。在任何方面的一些实施方式中，供体细胞为体细胞。在任何方面的一些实施方式中，供体细胞为大象体细胞。在任何方面的一些实施方式中，供体细胞为胎儿成纤维细胞。在任何方面的一些实施方式中，供体细胞为大象胎儿成纤维细胞。在任何方面的一些实施方式中，供体细胞为干细胞，包括但不限于：成体干细胞，诱导干细胞，来源于或获得自胎盘、脐带或脐带血的干细胞，或例如通过重编程诱导出成干细胞形态并表达至少一种干细胞标志物的细胞。可对供体细胞进行修饰，从而减少、抑制与引入的猛犸象基因相对应的内源性基因的表达，或使其失活。
[0192]
在任何方面的一些实施方式中，受体细胞为非人卵母细胞。在任何方面的一些实施方式中，受体细胞为非人哺乳动物卵母细胞。在任何方面的一些实施方式中，受体细胞为大象卵母细胞、蹄兔卵母细胞或海牛卵母细胞。
[0193]
在任何方面的一些实施方式中，受体细胞已将其遗传物质或细胞核移除。因此，本文描述了其中内源性细胞核已被本文所述的细胞的细胞核取代的卵母细胞。在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人卵母细胞。
[0194]
核转移的方法是本领域已知的，并被描述于例如us专利no.7,355,094b2、us专利no.7,332,648b2、wo 1996/007732 a1、keefer等，biol.reprod，50：935-939(1994)；sims&first，pnas，90：6143-6147(1994)；smith&wilmut，biol.reprod，40：1027-1035(1989)和wilmut等，nature，385：810-813(1997)；r.p.lanza等，cloning of an endangered species(bos gaurus)using interspecies nuclear transfer.cloning，2(2000)，第79-90页；m.c.g
ó
mez等，birth of african wildcat cloned kittens born from domestic cats.cloning stem cells，6(2004)，第247-258页；b.c.lee，dogs cloned from adult somatic cells.nature，436(2005)，p641；d.shi等，buffalos(bubalus bubalis)cloned by nuclear transfer of somatic cells.biol reprod，77(2007)，第285-291页；n.a.wani等，production of the first cloned camel by somatic cell nuclear transfer.biol reprod，82(2010)，第373-379页，通过引用将其整体并入本文。在scnt之前
修饰供体细胞的方法综述于例如rodriguez-osorio等，reprogramming mammalian somatic cells.theriogenology，78：9(2012)1869-1886；loi等，genetic rescue of an endangered mammal by cross-species nuclear transfer using post-mortem somatic cells.nat biotechnol，19(2001)，962-964。通常，核转移是在显微镜下用细针或微吸管进行的，该细针或微吸管能够以真空从供体细胞(例如体细胞)和宿主细胞中提取细胞核。或者，用钻头(drill)刺穿细胞的外层以移除细胞核。一旦供体细胞和宿主细胞的细胞核被移除，供体细胞核就可取代宿主细胞(例如卵母细胞)的细胞核。在另一方法中，移除宿主细胞核，并通过电脉冲将供体体细胞与空的宿主细胞融合。
[0195]
来自供体细胞的遗传物质允许受体(宿主)细胞的重编程。在这种情况下，重编程不是逆转分化的过程，而是将卵母细胞的整个遗传程序改变为由供体细胞核编码的过程。已经采用了各种策略来提高scnt的成功率。其中大多数集中于供体细胞，包括：1)细胞类型或来源组织；2)传代数；3)细胞周期阶段；和4)使用化学试剂和细胞提取物来修饰供体细胞的表观遗传状态。参见例如hill等，development rates of male bovine nuclear transfer embryos derived from adult and fetal cells.biol reprod，62(2000)，第1135-1140页；kato等，cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult,newborn and fetal cows.j reprod fertil，120(2000)，第231-237页；jones等，dna hypomethylation of karyoplasts for bovine nuclear transplantation.mol reprod dev，60(2001)，第208-213页；b.p.enright等，methylation and acetylation characteristics of cloned bovine embryos from donor cells treated with5-aza-2'-deoxycytidine.biol reprod，72(2005)，第944-948页；liu等，hypertonic medium treatment for localization of nuclear material in bovine metaphase ii oocytes.biol reprod，66(2002)，第1342-1349页；yamanaka等，gene silencing of dna methyltransferases by rna interference in bovine fibroblast cells.j reprod dev，56(2010)，第60-67页，和wang等，sucrose pretreatment for enucleation:an efficient and non-damage method for removing the spindle of the mouse mii oocyte.mol reprod dev，58(2001)，第432-436页，通过引用将其整体并入本文。
[0196]
此类试剂和条件的非限制性实例包括微管抑制剂(例如，诺考达唑)、细胞松弛素b、dna甲基转移酶抑制剂、曲古抑菌素a、5-氮杂-2
’‑
脱氧胞苷、dnmt1基因表达的敲除和直流(dc)脉冲。
[0197]
如本文所述的携带经修饰的供体细胞核的卵母细胞可被刺激以分裂并形成早期胚胎。该过程可通过在包含生长因子的培养基中培养细胞来实现(例如，如wu等，cell，168：473-486(2017)中所述，通过引用将其整体并入本文)。本文描述了包含本文所述的细胞或细胞群的非人胚胎。在另一个方面，本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因的所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人胚胎。在任何方面的一些实施方式中，所述胚胎包含大象细胞或由大象细胞组成，所述大象细胞包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。
[0198]
可通过胚胎移植将本文所述的非人胚胎植入雌性非人生物体(例如，雌性大象)的子宫中，或者可在允许形成囊胚的条件下培养胚胎。可由熟练的从业者在胚胎发生的任何
阶段(包括囊胚阶段)进行胚胎移植。选择胚胎或囊胚并将其转移到生物体中的方法是本领域已知的。参见例如mains l，van voorhis bj(2010年8月)，"optimizing the technique of embryo transfer".fertility and sterility，94(3)：785-90；meseguer m，rubio i，cruz m，basile n，marcos j，requena a(2012年12月)，"embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator:aretrospective cohort study".fertility and sterility，98(6)：1481
–
9.e10，以及mullin cm、fino me、talebian s、krey lc、licciardi f、grifo ja(2010年4月)，"comparison of pregnancy outcomes in elective single blastocyst transfer versus double blastocyst transfer stratified by age".fertility and sterility，93(6)：1837-43，通过引用将其整体并入本文。
[0199]
在核移植的卵母细胞来源的胚胎发育到足月可能受到限制的情况下，可优选产生嵌合的非人生物体，该嵌合的非人生物体由来源于天然形成的胚胎和通过卵母细胞核移植修饰的胚胎中的细胞形成。这种嵌合体可以通过直至囊胚期的任何阶段获取天然胚胎的细胞群和经卵母细胞核移植修饰的胚胎细胞群并通过聚集或注射形成新胚胎来形成。所添加的细胞的比例可处于约50:50的比率或其他合适的比率内，以形成发育到足月的胚胎。在本文考虑之列的是在这些情况下的野生型细胞(例如，不表达本文所述的猛犸象基因的细胞)的存在，以帮助挽救重建的胚胎，并使得能够成功发育至足月和非人类生物体的活产。此外，可将重构的胚胎在体内或体外培养至囊胚。例如，在us pat no.7,232,938b2中讨论了用于形成嵌合体的额外方案。
[0200]
囊胚是在动物胚胎发育早期期间形成的中空细胞球。本文描述了包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的非人囊胚。在任何方面的一些实施方式中，囊胚由表达本文所述的一种或多种猛犸象基因的大象细胞组成。
[0201]
胚胎发生过程中的囊胚阶段的标志物是本领域已知的，并在例如lombardi，julian(1998)，"embryogenesis".comparative vertebrate reproduction.springer，第226页中进行了讨论。培养和产生囊胚的方法在以下中进行讨论：例如，latham等，alterations in protein synthesis following transplantation of mouse 8-cell stage nuclei to enucleated1-cell embryos,developmental biology，第163卷，第2期，(1994)和ng.等，epigenetic memory of active gene transcription is inherited through somatic cell nuclear transfer.proc natl acad sci usa，102(2005)，第1957-1962页，通过引用将其整体并入本文。
[0202]
在通过上文讨论的方法成功转移本文所述的胚胎或囊胚后，可使本文所述的生物体的胚胎发育能够进展至例如原肠胚形成或进一步发育。这样的发育可允许产生活的、经遗传修饰的非人类生物体，该生物体包含一个或多个细胞，所述细胞包含并表达如本文所述的一种或多种猛犸象基因。本文描述的是包含表达选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列的一个或多个细胞的大象。
[0203]
将理解的是，上述描述和以下实施例仅为说明性的，而不应被视为对本发明范围的限制。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的实施方式进行对本领域技术人员来说显而易见的各种改变和修改。此外，为了描述和公开的目的，通过引用将所识别的所有专利、专利申请和出版物(例如，可与本发明结合使用的在这些出版物中描述的方法
学)明确地并入本文。这些出版物仅因为其公开早于本技术的申请日而被提供。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借现有发明或任何其他原因而将该公开提前。关于这些文献的内容的描述或关于日期的所有声明均基于申请人可获得的信息，而不构成对这些文献日期或内容的正确性的任何承认。
[0204]
为了描述和公开的目的，通过引用将所识别的所有专利和其他出版物(例如，可与本发明结合使用的在这些出版物中描述的方法学)明确并入本文。这些出版物仅因为其公开早于本技术的申请日而被提供。在这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借现有发明或任何其他原因而将该公开提前。关于这些文献的内容的描述或关于日期的所有声明均基于申请人可获得的信息，而不构成对这些文献日期或内容的正确性的任何承认。
[0205]
可通过本文中以下的任何编号段落进行进一步描述本文提供的技术。1)一种活细胞，所述细胞包含选自于由表1中的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。2)如段落1所述的细胞，其中，所述细胞表达由所述至少一种核酸序列编码的多肽。3)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞为干细胞。4)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞表达至少一种干细胞标志物。5)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述干细胞标志物选自nanog、ssea1、ssea4或tra-1-60。6)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述干细胞为诱导干细胞、胚胎干(es)细胞或间充质干细胞(msc)。7)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞为重编程细胞。8)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞为成纤维细胞或间充质细胞。9)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞或表皮细胞。10)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞先前在体外分化为选自于由如下所组成的组中的细胞：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞或表皮细胞。11)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞不表达所述至少一种基因的内源性同源物。12)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，对所述细胞进行编辑以抑制所述至少一种基因的内源性同源物的表达。13)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞为非人细胞。14)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞为大象细胞。15)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述大象细胞为非洲象(非洲草原象)细胞或亚洲象细胞。16)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞为蹄兔细胞或海牛细胞。17)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述蹄兔细胞选自于由如下所组成的组：南非树蹄兔细胞、西非树蹄兔细胞、黄斑岩蹄兔细胞和岩蹄兔细胞。
18)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述海牛细胞选自于由如下所组成的组：亚马逊海牛细胞、西印度海牛细胞、佛罗里达海牛细胞、安地列斯海牛细胞和西非海牛细胞。19)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，将所述细胞冷冻保存。20)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，所述细胞先前为冷冻保存的。21)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，与适当的对照相比，所述细胞表现出选自于由如下所组成的组中的一种或多种表型：钙信号的调节、电生理功能的调节、蛋白合成速率的调节、代谢功能的调节、以及细胞膜的脂质含量的调节。22)一种卵母细胞，其中，所述内源性细胞核已被前述段落中任一段所述的细胞的细胞核取代。23)一种非猛犸象细胞，所述细胞包含选自于由表1中的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列24)一种经基因编辑的大象细胞，所述细胞包含选自于由表1中的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列，其中，对所述大象细胞进行编辑以改变所述至少一种基因的大象同源物。25)如前述段落中任一段所述的细胞，其中，对所述大象细胞进行编辑以删除或抑制至少一种基因的功能。26)一种经基因编辑的大象细胞，所述细胞具有选自于由(1)所组成的组中的至少一种基因，对所述细胞进行编辑以模拟具有相同基因的猛犸象变体。27)一种经重编程为如下表型的大象体细胞，所述细胞在形态学上为干细胞样并表达至少一种内源性干细胞标志物。28)如前述段落中任一段所述的大象细胞，其中，所述干细胞标志物选自nanog、ssea1、ssea4或tra-1-60。29)如前述段落中任一段所述的大象细胞，其中，所述细胞包含编码选自于由猛犸象多肽所组成的组中的一种或多种外源多肽的外源核酸。30)如前述段落中任一段所述的大象细胞，其中，对应于所述一种或多种外源多肽的大象同源基因是失活的。31)一种非人生物体，所述非人生物体包含前述段落中任一段所述的细胞。32)一种非人胚胎，所述非人胚胎包含前述段落中任一段所述的细胞。33)一种非人胚胎，所述非人胚胎包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。34)一种非人卵母细胞，所述非人卵母细胞包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。35)一种非人4细胞期胚胎，所述非人4细胞期胚胎包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。36)一种非人8细胞期胚胎，所述非人8细胞期胚胎包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。37)一种非人囊胚，所述非人囊胚包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。
38)一种去核的非人卵母细胞，所述卵母细胞包含供体细胞核，所述供体细胞核包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种基因的核酸序列。39)如前述段落中任一段所述的胚胎，其中，所述胚胎为原肠胚形成前的胚胎。40)如前述段落中任一段所述的胚胎，其中，所述胚胎为嵌合胚胎。41)如前述段落中任一段所述的胚胎、囊胚或卵母细胞，其中，将所述胚胎、囊胚、或卵母细胞冷冻保存。42)如前述段落中任一段所述的卵母细胞、胚胎或囊胚，其中，所述外源核酸序列的非猛犸象同源物已被删除或失活。43)一种非人生物体，所述非人生物体包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种基因的核酸序列。44)一种大象细胞，所述大象细胞包含表2或表3所列的至少一种引导rna。45)如段落44所述的大象细胞，所述大象细胞进一步表达由所述至少一种引导rna引导的rna引导核酸内切酶。46)一种非人细胞，所述非人细胞包含表2或表3所列的至少一种引导rna。47)如段落46所述的非人细胞，所述非人细胞进一步表达由所述至少一种引导rna引导的rna引导核酸内切酶。48)一种引导rna，所述引导rna包含选自seq id no：1至seq id no：426的序列。49)一种核酸，所述核酸编码段落48所述的引导rna。50)如段落49所述的核酸，其中，所述编码引导rna的核酸可操作地连接到指导所述引导rna的表达的核酸序列。51)一种载体，所述载体包含段落49或50所述的核酸。52)一种细胞，所述细胞包含段落48所述的引导rna。53)一种细胞，所述细胞包含段落49或段落50所述的核酸。54)一种细胞，所述细胞包含段落51所述的载体。55)如段落52-54中任一段所述的细胞，所述细胞进一步包含rna引导核酸内切酶，该酶的活性由所述引导rna引导。实施例
[0206]
以下实施例通过说明而非限制的方式提供。实施例1：猛犸象对寒冷的适应
[0207]
猛犸象(真猛犸象)是象科中耐寒的成员，在上一个冰河时期，猛犸象曾分布在北半球广阔的猛犸草原上，并在10000年前在其大部分范围内灭绝。无论是通过史前艺术还是从西伯利亚和阿拉斯加发现的冷冻遗骸来看，猛犸象可以说是最具特征的史前动物(图1)。这些保存完好的标本为灭绝动物的适应性进化提供了难得的功能表征机会。居住在极端环境中(如北纬度的寒冷地区)需要一系列适应性的进化变化。猛犸象标本的遗传和形态学分析揭示了对寒冷的多种生理适应，包括浓密的长毛、脂肪组织增加、耳朵和尾巴减小以及血红蛋白结构多态性。对其他耐寒哺乳动物的研究已经鉴别了在相同的基因和途径上的许多趋同适应，以及对共享的环境压力源的独特适应。冷敏感性降低
[0208]
对温度的敏感性由躯体感觉神经元中的一系列温度感知离子通道调节。在猛犸象
中鉴别了这些基因中的数个(trpm8、trpv3、trpa1和trpv4)的多态性(lynch等，elephantid genomes reveal the molecular bases of woolly mammoth adaptations to the arctic.cell reports，12：2，第217-228页(2015))。此外，对耐寒的十三线地松鼠(thirteen-lined ground squirrel)的研究已在实验上证明，在该物种的躯体感觉神经元中表达的对冷不敏感的trpm8蛋白归于六种遗传多态性(matos-cruz等，molecular prerequisites for diminished cold sensitivity in ground squirrels and hamsters.cell reports，21：12，第3329-3337页(2017))。皮肤和毛发发育
[0209]
与其中纬度大象近亲相比，猛犸象在其皮肤和毛发发育中具有许多良好表征的生理差异。对猛犸象毛发的检查已经鉴定了三种不同的毛发类型，包括亚洲象和非洲象中不存在的浓密的绒毛。对保存完好的猛犸皮肤的检查也显示出皮脂腺的存在，而亚洲象或非洲象中不存在皮脂腺，这是防水和提高绝缘性所必需的。基因本体论分析已经鉴定了猛犸象中与这些特征相关的遗传多态性，包括(lynch等，cell reports(2015))：导致皮脂腺肿大的三种基因(barx2、cd109、rbl1)，以及与毛根鞘发育(rbl1、mki67、barx2、bnc1、pof1b、frem1、bmp2、prdm1)、毛囊(nes、rbl1、dll1、ptch1、mki67、sema5a、barx2、bnc1、bhlhe22、glmn、ackr4、frem1、akt1、bmp2、selenop、krt8、lgals3、ncam1、prdm1)和毛发外根鞘(rbl1、mki67、barx2、bnc1、frem1和bmp2)相关的毛发发育基因的取代。脂肪发育与脂质代谢
[0210]
对保存完好的猛犸象标本的检查显示，颈部后方存在大的棕色脂肪沉积物，据信这些脂肪沉积物在冬季起到了热源和脂肪库的作用(boeskorov，g.g.，tikhonov，a.n.&lazarev，p.a.a new find of amammoth calf.dokl biol sci，417，480-483(2007))。基因本体论分析已经鉴定了与猛犸象中的异常棕色脂肪组织形态(adrb2、dlk1、ghr、gpd2、hrh1、lepr、lgals12、lpin1、med13、mlxipl、pds5b、ptprs、sik3、sqstm1、itprid2)和异常棕色脂肪组织量(dlk1、ghr、gpd2、hrh1、lepr、lgals12、lpin1、med13、mlxipl、pds5b、sik3、itprid2)相关的遗传多态性(lynch等，cell reports(2015))。此外，对猛犸的耐寒性的进化分析显示出与异常的循环脂质和胆固醇水平(abcg8、crp、fabp2)相关的lof基因的统计学上显著的富集(lynch等，cell reports(2015))。最后，在北极熊(apob)的基因组分析中也鉴定到改变的脂质代谢。形态特征
[0211]
保存完好的猛犸象标本揭示了许多对寒冷的形态学适应，包括较小的耳朵和尾巴、较短的躯干和圆顶颅骨。基因本体论分析已经鉴定了与猛犸象中的这些特征相关的遗传多态性，包括：异常的尾巴形态(apaf1、avil、axin2、bmp2、brca1、brca2、cdc7、celsr1、chst14、crh、dact1、dll1、dmrt2、dst、fat4、fn1、hist1h1c、jak1、krt76、lepr、lrp2、lyst、med12、mthfr、ndc1、noto、phc1、phc2、ptch1、rc3h1、sepp1、slx4、sytl1、tcea1、zeb1)，异常的尾芽形态(brca1、dact1、fn1、phc1、phc2)，小尾芽(phc1、phc2)，异常的耳朵形态(apaf1、atp8b1、bhlhe22、bmp2、celsr1、col9a1、dll1、fat4、foxq1、gpr98、htt、jag1、jak1、loxhd1、lrp2、lyst、mecom、muc5b、nf1、otoa、pcdh15、phc1、phc2、ptprq、synj2、tbx10、tcof1、tub、zeb1)、杯状耳朵(tcof1)、圆顶颅骨(col27a1、fig4、hdac4、htt、pfas、pkd1、ptch1、slx4、tcof1、trip1)、异常的顶骨形态(apaf1、hhat、nell1、ptchl、sik3、tcof1)以及短吻(apaf1、
asph、col27a1、frem1、hhat、kif20b、lrp2、ltbp1、mia3、pds5b、pfas、pkdl、rbl1、trip11、zc3hc1)。血液适应
[0212]
血红蛋白是结合血液中的氧的温度敏感的四聚体蛋白。在寒冷的温度下，氧分子不能被转移到组织。血红蛋白α和β基因(hba，hbb)的猛犸象取代已在实验上显示出改善低温下的氧输送(campbell，k.，roberts，j.，watson，l.等，substitutions in woolly mammoth hemoglobin confer biochemical properties adaptive for cold tolerance.nat genet，42：536-540(2010))。非耐寒哺乳动物的血小板在暴露于寒冷时发展出病变。相比之下，十三线地松鼠中的血小板已在实验上显示出对这些病变的抵抗(cooper等，the hibernating 13-lined ground squirrel as a model organism for potential cold storage of platelets.american journal of physiology-regulatory,integrative and comparative physiology(2012))。昼夜节律生物学
[0213]
时钟基因在某些细胞和代谢事件的计时中发挥着关键作用。在经历长时间黑夜或白昼的北极动物中，已经在数个关键的昼夜节律时钟基因中鉴定到功能丧失(lof)突变。值得注意的是，驯鹿没有表现出昼夜褪黑素节律，并且在培养物中生长的驯鹿成纤维细胞缺乏典型的节律时钟基因活性。有人认为，这些观察到的表型是由per2和bmal1中的lof突变引起。类似地，在猛犸象中，已经鉴定出以下时钟基因中的lof突变：hrh3、lepr、per2(lynch等，cell reports(2015))。实施例2：在猛犸象和其他寒冷气候野生动物中赋予降低的冷敏感性的适应性基因。
[0214]
以下基因被发现对猛犸象和其他动物(如驯鹿和北极熊)适应寒冷气候而言很重要。
实施例3：赋予降低的寒冷气候敏感性的基因的额外地实例
[0215]
hbb(血红蛋白β/δ融合基因)：猛犸象hbb中的氨基酸多态性降低了氧亲和力。该基因亚基的突变降低了从肺部输送氧的能量成本。
[0216]
hba-2(血红蛋白亚基a的变体)
[0217]
温度敏感的瞬时受体电位(thermotrp)
[0218]-trpa1-根据物种感知有害的寒冷或热
[0219]-trpv3-感知无害的温暖。trpv3中的猛犸特异性取代(n647d)发生在充分保守的位点，该位点可影响猛犸象trpv3的温度感知。与猛犸中的耐寒性、长毛和大量脂肪储存的进化有关。
[0220]-trpm4-它对热敏感，但并不知晓参与温度感知-[0221]
trpm8-感知有害的寒冷
[0222]
图2显示了trp基因活跃的温度范围。
[0223]
图3显示了具有克隆的猛犸等位基因的多顺反子载体。实施例4：多顺反子载体的产生和非洲象细胞的重编程
[0224]
产生了具有克隆的猛犸等位基因的多顺反子载体(图3-图5)。
[0225]
接下来，获得了来自非洲象(非洲草原象)冷冻胎盘的活检的诱导干细胞，并将其保持在培养物中(图4，左侧)。产生了含有sv40lt和潮霉素抗性基因的转座子质粒。该质粒通过将phage2-ef1-oskm克隆到pme1位点中而产生，该位点包含人重编程因子oct4、sox2、klf4和c-myc、永生化基因sv40lt和潮霉素选择性标志物(图5-图6)。
[0226]
用转座子重编程因子和转座酶转染非洲草原象细胞。在潮霉素存在下筛选细胞，并扩增存活的细胞，并用上述的重编程载体启动重编程(图3-图6)。细胞集落来源于饲养细胞(mef)层(预先涂布有0.1％明胶的平板)中，并保持在本文称为essential 8(gibco)的用nahco3调节ph的培养基中，该培养基在dmem/f12中含有胰岛素、硒、转铁蛋白、l-抗坏血酸、fgf2和tgfβ(或nodal)的专有配方(例如，如chen g等，nat methods，2011中所述的)(图7)。在两周时开始出现集落。将单集落转移到涂布有基质胶的平板，并维持在具有essential 8的无饲养层条件下。
[0227]
然后用matrigel
tm
在无饲养层条件下扩增非洲草原象的诱导干细胞集落(图8)。为了测试向不同谱系的分化，进行了畸胎瘤检测。将非洲草原象的诱导干细胞注射到免疫受损的小鼠中。
[0228]
可通过本领域已知的各种方案使细胞从诱导干细胞阶段沿着不同的谱系分化，或者用不同的转录因子从成纤维细胞样转分化为其他细胞类型。
[0229]
非洲草原象的诱导干细胞群的rna seq实验表明，比起终末分化表型，输送细胞更接近于多能干细胞。主成分分析或pca用于鉴别以下细胞的特定特性：ele1 asmsc af28亚洲间充质干细胞(亚洲象亲代细胞)；ele2 asmscim af28亚洲间充质干细胞sv40lt(永生化的亚洲象亲代细胞)；ele3 loxpla loxodonta afr胎盘细胞p.3(非洲象亲代细胞)；ele4 loxplaim loxodonta afr胎盘细胞sv40lt(永生化的非洲象亲代细胞)；ele5 loxipsc p.9来自loxodonta胎盘的诱导干细胞(非洲象诱导干细胞)；ele6 loxipsctra160-2x用tra160 pe和fitc p.7分选2x(经分选的非洲象诱导干细胞)；ele7 loxipsctra161-1x用tra160 fitc p.9分选1x(经分选的非洲象诱导干细胞)；和ele8 loxipsctra160-2x diff用分化的tra160 pe和fitc p.7分选2x(从干细胞分化的非洲象)(图9)。
[0230]
构建了各种非洲草原象的诱导干细胞群的热图，以确定何种多能细胞标志物在大
象诱导干细胞中显著表达，而在从非洲草原象获得的成纤维细胞样细胞中低表达(图10)。
[0231]
对大象诱导干细胞中为低而在分化的亲代细胞群中为高的分化标志物进行了计算比较。在大象细胞中差异表达的基因包括：在非洲草原象的诱导干细胞中具有增高的丰度的lin 28a、sall4、trim 7、lama1、enslafg00000026668、fgfr4和c4bpa，以及在非洲草原象的诱导干细胞中具有降低的丰度的ensslafg00000000910、lgals1(图11)。
[0232]
此外，观察到在非洲草原象诱导干细胞群中差异化表达的基因的编码区中的约11,000个snp变化。许多enslaf基因被注释，并且具有未知的功能作用。基因本体论分析显示，在该分析中富集的基因与发育、细胞周期、离子通道和代谢途径相关(图12)。
[0233]
将猛犸相关物种的23个基因组分析用于鉴定猛犸的特定特征(图1)。这些基因参与了下表中所列的数个生物学过程、分子功能和蛋白类别。
[0220]
表2中，“abe”指腺嘌呤碱基编辑器；“cbe”指胞嘧啶碱基编辑器；“hdr”指同源定向修复；且“pam”指原间隔区邻近基序。

技术特征：
1.一种活细胞，所述细胞包含选自于由表1中的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。2.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞表达由所述至少一种核酸序列编码的多肽。3.如权利要求1或2所述的细胞，其中，所述细胞为干细胞。4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞，其中，所述细胞表达至少一种干细胞标志物。5.如权利要求4所述的细胞，其中，所述干细胞标志物选自nanog、ssea1、ssea4或tra-1-60。6.如权利要求3所述的细胞，其中，所述干细胞为诱导干细胞、胚胎干(es)细胞或间充质干细胞(msc)。7.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞为重编程的细胞。8.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞为成纤维细胞或间充质细胞。9.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞选自于由如下所组成的组：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞或表皮细胞。10.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞先前在体外分化为选自于由如下所组成的组中的细胞：神经细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、骨骼细胞、脂肪细胞或表皮细胞。11.如权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中，所述细胞不表达所述至少一种基因的内源性同源物。12.如权利要求1-11中任一项所述的细胞，其中，对所述细胞进行编辑以抑制所述至少一种基因的内源性同源物的表达。13.如权利要求1-12中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为非人细胞。14.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞为大象细胞。15.如权利要求14所述的细胞，其中，所述大象细胞为非洲象细胞或亚洲象细胞。16.如权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞为蹄兔细胞或海牛细胞。17.如权利要求16所述的细胞，其中，所述蹄兔细胞选自于由如下所组成的组：南非树蹄兔细胞、西非树蹄兔细胞、黄斑岩蹄兔细胞和岩蹄兔细胞。18.如权利要求17所述的细胞，其中，所述海牛细胞选自于由如下所组成的组：亚马逊海牛细胞、西印度海牛细胞、佛罗里达海牛细胞、安地列斯海牛细胞和西非海牛细胞。19.如权利要求1-18中任一项所述的细胞，其中，将所述细胞冷冻保存。20.如权利要求1-19中任一项所述的细胞，其中，所述细胞先前为冷冻保存的。21.如权利要求1-20中任一项所述的细胞，其中，与适当的对照相比，所述细胞表现出选自于由如下所组成的组中的一种或多种表型：钙信号的调节、电生理功能的调节、蛋白合成速率的调节、代谢功能的调节、以及细胞膜的脂质含量的调节。22.一种卵母细胞，其中，内源性细胞核已被权利要求1-21中任一项所述的细胞的细胞核取代。23.一种非猛犸象细胞，所述细胞包含选自于由表1中的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。24.一种经基因编辑的大象细胞，所述细胞包含选自于由表1中的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列，其中，对所述大象细胞进行编辑以改变所述至少一种基因
的大象同源物。25.如权利要求24所述的细胞，其中，对所述大象细胞进行编辑以删除或抑制至少一种基因的功能。26.一种经基因编辑的大象细胞，所述细胞具有选自于由表1所列的基因所组成的组中的至少一种基因，对所述细胞进行编辑以模拟具有相同基因的猛犸象变体。27.一种经重编程为如下表型的大象体细胞，所述细胞在形态学上为干细胞样并表达至少一种内源性干细胞标志物。28.如权利要求27所述的大象细胞，其中，所述干细胞标志物选自nanog、ssea1、ssea4或tra-1-60。29.如权利要求27所述的大象细胞，其中，所述细胞包含编码选自于由猛犸象多肽所组成的组中的一种或多种外源多肽的外源核酸。30.如权利要求27所述的大象细胞，其中，对应于所述一种或多种外源多肽的大象同源基因是失活的。31.一种非人生物体，所述生物体包含权利要求1-27中任一项所述的细胞。32.一种非人胚胎，所述胚胎包含权利要求1-27中任一项所述的细胞。33.一种非人胚胎，所述胚胎包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。34.一种非人卵母细胞，所述卵母细胞包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。35.一种非人4细胞期胚胎，所述胚胎包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。36.一种非人8细胞期胚胎，所述胚胎包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。37.一种非人囊胚，所述囊胚包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种外源核酸序列。38.一种去核的非人卵母细胞，所述卵母细胞包含供体细胞核，所述供体细胞核包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种基因的核酸序列。39.如权利要求32、33、35和36中任一项所述的胚胎，其中，所述胚胎为原肠胚形成前的胚胎。40.如权利要求32、33、35和36中任一项所述的胚胎，其中，所述胚胎为嵌合胚胎。41.如权利要求32-40中任一项所述的胚胎、囊胚或卵母细胞，其中，将所述胚胎、囊胚或卵母细胞冷冻保存。42.如权利要求32-41中任一项所述的卵母细胞、胚胎或囊胚，其中，所述外源核酸序列的非猛犸象同源物已被删除或失活。43.一种非人生物体，所述生物体包含选自于由表1所列的猛犸象基因所组成的组中的至少一种基因的核酸序列。44.一种大象细胞，所述细胞包含表2或表3所列的至少一种引导rna。45.如权利要求44所述的大象细胞，所述细胞进一步表达由所述至少一种引导rna引导的rna引导核酸内切酶。
46.一种非人细胞，所述细胞包含表2或表3所列的至少一种引导rna。47.如权利要求46所述的非人细胞，所述细胞进一步表达由所述至少一种引导rna引导的rna引导核酸内切酶。48.一种引导rna，所述引导rna包含选自seq id no：1至seq id no：426的序列。49.一种核酸，所述核酸编码权利要求48所述的引导rna。50.如权利要求49所述的核酸，其中，所述编码引导rna的核酸可操作地连接到指导所述引导rna的表达的核酸序列。51.一种载体，所述载体包含权利要求49或50所述的核酸。52.一种细胞，所述细胞包含权利要求48所述的引导rna。53.一种细胞，所述细胞包含权利要求49或权利要求50所述的核酸。54.一种细胞，所述细胞包含权利要求51所述的载体。55.如权利要求52-54中任一项所述的细胞，所述细胞进一步包含rna引导核酸内切酶，所述核酸内切酶的活性由所述引导rna引导。

技术总结
本文描述了用于产生表达至少一种或多种猛犸象基因的活细胞的组合物和方法。本文还描述了用于产生表达一种或多种猛犸象基因的胚胎、囊胚、卵母细胞或非人生物体的组合物和方法。法。法。


技术研发人员：乔治
受保护的技术使用者：哈佛大学校长及研究员协会
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2023/8/9