PtTINY基因在调控植物盐胁迫耐受性中的应用的制作方法

pttiny基因在调控植物盐胁迫耐受性中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及pttiny基因在调控植物盐胁迫耐受性中的应用，更具体的是pttiny基因在降低植物盐胁迫耐受性中的应用。


背景技术：

2.土壤盐渍化是由土壤中积累了大量的可溶性盐形成的。如今土壤盐渍化已经成为全球性问题，全球约有8％的土地受到盐渍化的威胁。我国是土壤盐渍化比较严重的国家，盐渍土面积占全球盐渍土面积的1/10。近年来在自然和人为因素等条件影响下，土壤盐渍化的面积逐渐扩大，严重影响影响植物正常生长发育，危害农牧业和人类的生存发展，造成许多经济问题。
3.盐胁迫对植物的危害主要表现在三个方面，第一个方面是是渗透胁迫，植物生长在高浓度的离子环境中，高渗透压使得植物失水，从而使得叶片气孔关闭，光合作用受到限制，影响植物的正常生长代谢。第二个方面是离子毒害，由于植物蒸腾作用，导致na
+
和cl-过量积累在植物体中，过量的na
+
会抑制植物体内酶的活性，并且影响植物的新陈代谢，破坏植物体内的渗透压平衡造成，并对其他离子产生竞争性抑制作用，最终导致植物死亡。除了以上两种危害，还存在着间接的氧化胁迫作用。由于盐胁迫导致植物体内的代谢紊乱，使得植物的氧化还原系统受到破坏，代谢过程中产生的活性氧等物质积累在植物体内，影响植物的光合作用，最终使得植物生长受到抑制。
4.植物对环境的适应使其具有一定程度上抵抗盐胁迫的能力，为了减轻土壤盐渍化的危害植物进化出一系列的耐盐机制，包括渗透调节、代谢调节、盐胁迫传感和耐盐排盐机制。杨树生长迅速，成材快，用途广，不仅用作于西北地区的防护林，城市绿化树种，而且木材用于工业用材，具有巨大的经济效益，生态效益和社会效益。研究杨树的耐盐性对我国盐碱地的开发利用具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供pttiny基因在降低植物盐胁迫耐受性中的应用，该基因负调控植物的盐胁迫耐受性。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：
7.本发明采用的pttiny基因在ncbi中基因序列号(sequence id)为xm_002298200.4，pttiny基因的信使rna(mrna)序列长度为1214bp，ghgpx5基因的编码序列长度为702bp，包括233个氨基酸。
8.本发明还构建一系列植物表达载体，含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因植物株系以及含有所述载体的宿主细胞在降低植物耐盐胁迫方面的功能也落入本发明的保护范围之内。
9.本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述pttiny基因，还包括与pttiny基因具有较高同源性(同源性高达99％)的同源基因在耐盐胁迫方面的功能。
10.本发明公开的pttiny基因在植物耐盐胁迫中的生物学功能，具体表现在：在盐胁迫下，pttiny基因过表达株系的根长和鲜重及发芽率低于野生型。
11.根据其功能，可以通过转基因的方式来获得耐盐胁迫的植株，具体地，可以通过构建基因编辑载体，转化目的植株，得到转基因植物，该植株耐盐胁迫能力高于目的植物。
12.具体地，pttiny基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
13.为了提高植物的优良性状，在实际应用过程中，可以通过“调控植物中的pttiny基因的表达”的方法来实现，“调控植物中的pttiny基因的表达”的方法为过表达、沉默或定向突变pttiny基因。调控基因表达水平包括利用dna同源重组技术、农杆菌介导的转化体系调控所述pttiny表达，获得转基因植物株系。
14.本发明还保护一种新的植物育种方法，所述方法为以下(1)或(2)或(3)：
15.(1)通过降低目的植物中pttiny蛋白的活性，获得盐胁迫耐受性强于目的植物的植株；
16.(2)通过促进目的植物中pttiny基因的表达，获得盐胁迫耐受性低于目的植物的植株；
17.(3)通过抑制目的植物中的pttiny基因的表达，获得盐胁迫耐受性高于目的植物的植株。
[0018]“促进目的植物中pttiny基因的表达”的实现方式可为如下(1)或(2)或(3)：
[0019]
(1)将pttiny基因导入目的植物；
[0020]
(2)引入强启动子和/或增强子；
[0021]
(3)本领域内的其它常见方法。
[0022]“抑制目的植物中的pttiny基因的表达”的方式可以采用敲除、沉默或定向突变pttiny基因的方式，敲除pttiny基因的方式可以采用基因编辑技术。
[0023]
其中，目的植物，本发明所述目的植物是拟南芥，杨树，尤其是山新杨。
[0024]
目的基因，也称靶标基因，在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。可以是生物体本身的，也可以是来自不同生物体的。
[0025]
本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
[0026]
作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：杨树、拟南芥，尤其是山新杨(populus davidiana
×
populus bolleana)，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。
[0027]
本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。
[0028]
本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完
整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。
[0029]
本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。
[0030]
本发明的优点：
[0031]
(1)本发明创新性地对山新杨(populus davidiana
×
populus bolleana)中响应逆境胁迫的ap2/erf(apetala2/ethylene responsive factor)转录因子家族基因pttiny进行了克隆。构建pttiny的过表达载体pcambia2300-pttiny，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥(clo-0，wt)，获得过表达植株，分析结果表明在盐胁迫下，相对于野生型，pttiny降低了耐盐性，也就是说pttiny基因负调控拟南芥对盐胁迫的耐受性。可见，pttiny基因在调控植物盐胁迫方面起着重要的作用，对于培育能够抵御外界胁迫条件的杨树品种具有重要的意义。
[0032]
(2)可以通过转基因的方式来获得耐盐性的植株，具体地，可以通过构建pttiny基因编辑载体，转化目的植株，得到转基因植物，该植株耐盐性高于目的植物，为植物耐盐育种提供一种新的途径。
附图说明
[0033]
图1是山新杨、拟南芥、甘蓝型油菜、大豆、玉米和水稻tiny系统发育进化树及氨基酸序列比对；图1a显示山新杨tiny与双子叶植物拟南芥和甘蓝型油菜tiny亲缘关系更近；
[0034]
图1b显示不同物种中tiny所编码的氨基酸ap2结构域序列高度保守；
[0035]
图2是pttiny表达水平分析；图2a显示pttiny在根中表达水平最高；图2b显示200mmnacl诱导pttiny的表达；
[0036]
图3是pttiny过表达载体构建及异源过表达拟南芥表达水平分析；图3a为过表达载体结构示意图；图3b显示不同株系pttiny基因表达水平；
[0037]
图4是盐胁迫下拟南芥野生型与pttiny异源过表达株系表型对比。
[0038]
图5是盐胁迫下拟南芥野生型与pttiny异源过表达株系发芽率对比。
具体实施方式
[0039]
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0040]
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
[0041]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0042]
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、dna重组及生物信息学技术。这些技术
均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的dna提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。
[0043]
此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的dna分子(例如，cdna或者基因组dna)，rna分子(例如，信使rna)，自然类型，合成的dna或rna分子，核苷酸类似物组成的dna或rna分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的dna核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cdna中的编码序列，和/或包括cdna及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cdna。
[0044]
生物材料
[0045]
拟南芥col-0种子为实验室保存；
[0046]
过表达载体psuper-1300-gfp为实验室保存；
[0047]
大肠杆菌dh5α和农杆菌gv3101为实验室保存；
[0048]
引物合成及测序，由擎科生物公司完成。
[0049]
实验试剂
[0050]
rna提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购买自诺唯赞生物科技有限公司；
[0051]
nacl等常用试剂购买自沪市公司；
[0052]
潮霉素购买自索莱宝生物公司；
[0053]
ms培养基购买自北京酷来搏科技有限公司；
[0054]
各种核酸内切酶购买自烟台清骏生物科技有限公司；
[0055]
一步克隆酶购买自诺唯赞生物科技有限公司；
[0056]
质粒小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购买自北京天根生物技术有限公司。
[0057]
实验设备
[0058]
pcr仪购买自bio-rad公司；
[0059]
制冷离心机购买自eppendorf公司；
[0060]
定量pcr仪购买自bio-rad公司；
[0061]
高温高压灭菌器mls-3750购买自日本三洋公司；
[0062]
核酸检测仪nanodrop 2000c购买自thermo scientific公司；
[0063]
常温离心机购买自thermo scientific公司。
[0064]
实施例1 pttiny基因的克隆及氨基酸序列
[0065]
提取生长15天山新杨的rna，以反转录反应获得的cdna为模板，由ncbi数据库中获得的基因序列经primer premier5.0设计特异性引物经过pcr反应，克隆pttiny基因的编码序列，经translate(https://www.expasy.org/resources/在线工具将核酸序列转化为蛋白质序列。在ncbi下载拟南芥、甘蓝型油菜、大豆、玉米和水稻tiny蛋白序列，进一步地利用mega软件构建不同物种tiny的系统进化树，利用dnaman软件对不同物种tiny蛋白序列进行比对。
[0066]
结果表明，山新杨pttiny基因的编码序列，包含702bp碱基。所编码的蛋白包括233
个氨基酸。且山新杨与双子叶植物拟南芥和甘蓝型油菜亲缘关系最近(图1a)，不同物种tiny蛋白序列的ap2结构域高度保守(图1b)。
[0067]
实施例2 pttiny基因的表达模式分析
[0068]
选取生长时间为25-30d的、生长健壮、大小一致的野生型山新杨土培苗，将样品叶、茎、根、木质部和韧皮部五个组织部位分别取样，迅速放入液氮中，提取rna，反转录后获得cdna。
[0069]
取野生型山新杨组培苗，随机分成6组，每组3棵。配制含200mm nacl的水溶液，将幼苗转移到含盐的水溶液中进行胁迫处理，然后分别在处理的0h、1h、3h、6h、12h、24h，6个时间点取样。取整株杨树样品，迅速置于液氮中，提取rna，反转录后获得cdna。
[0070]
使用primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/)设计qrt-pcr引物，并通过ncbi-primer blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)验证引物特异性，将ptactin作为qrt-pcr分析的内参基因。rt-qpcr实验使用cfx96实时荧光定量pcr检测系统(bio-rad，hercules，ca，美国)和sybrpremix ex taq试剂
tm
盒(takara)进行。每个样品均使用进行三个生物学重复和三个技术重复。扩增参数如下：95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，循环40次。
[0071]
结果表明，pttiny在所测的组织中都表达，但是在木质部中表达水平最高(图2a)。盐胁迫处理诱导pttiny的表达，在处理后12小时，表达水平上调约40倍，24小时上调约10倍(图2b)。
[0072]
实施例3过表达拟南芥验证pttiny基因在拟南芥盐胁迫耐受性中的功能
[0073]
为了进一步分析pttiny的功能，发明人分别构建了pttiny的过表达载体p35s-pttiny-gfp，获得了过表达拟南芥植株。具体过程简要介绍如下：
[0074]
第一，设计带有限制性内切酶bamhi酶切位点的引物，序列如下：
[0075]
1300-pttiny-f：5
′‑
gagctcggtacccggggatccatgacgaaagaagaaagcagtaacag-3
′
；
[0076]
1300-pttiny-r：5
′‑
caggtcgactctagaggatccttaattcaactcagatcctccaaagt-3
′
；
[0077]
第二，以实例1制备的cdna样品为模板，进行pcr扩增，并纯化回收扩增产物；
[0078]
第三，对1300-gfp载体采用bamhi进行单酶切，对酶切产物进行纯化；
[0079]
第四，把pcr扩增产物和酶切后的载体进行同源重组连接，构建1300-pttiny过表达载体；
[0080]
第五，采用热激转化法，将连接产物转化大肠杆菌dh5α，进行k
+
(卡那霉素，50μg/ml)抗性筛选，选择阳性菌落进行pcr检测，对pcr检测鉴定正确菌落进行扩增、送测序，测序正确的菌液提取质粒备用；
[0081]
第六，将所提取的质粒转化至农杆菌感受态细胞gv3101中，-80℃保存备用；
[0082]
第七，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥(clo-0，wt)，将收获的种子在含有潮霉素的1/2ms培养基上筛选，对潜在的转基因植株单株收获种子，再次在含有潮霉素的培养基上筛选，直至t3代筛选获得潜在的纯合转基因植株；
[0083]
利用qrt-pcr分别分析潜在转基因植株中pttiny的表达水平，结果发现，在野生型植株中，不能检测到pttiny的表达，在异源过表达植株中，检测到pttiny的表达(图3b)。
[0084]
盐胁迫抑制植株的生长，为了分析pttiny是否参与调控盐胁迫抑制植株生长的过程，我们将wt、过表达pttiny拟南芥种子分别播种在含0mm，50mm，150mm，200mm nacl的1/
2ms培养基上，在4℃低温处理3d，然后竖直放置于12h光照/12h黑暗的温室(21℃)中，观察拟南芥植株的生长状况。
[0085]
结果表明，在不含nacl(0mm)培养基上生长7天后，过表达株系鲜重显著低于野生型(图4a，f)，表现为野生型鲜重约2.71mg，而过表达株系鲜重低于1.87mg。不同浓度的nacl处理明显抑制了植株的生长，而且，随着1/2ms培养基中nacl浓度升高，抑制植株生长的效果更加显著。在含有50mm的1/2ms培养基上生长7天后，野生型植株鲜重约2.46mg，而过表达株系鲜重低于1.33mg，过表达株系鲜重显著低于野生型(图4b，f)。在含有150mm的1/2ms培养基上生长7天后，野生型植株鲜重约0.88mg，而过表达株系鲜重低于0.42mg，过表达株系鲜重显著低于野生型(图4c，f)。在含有200mm的1/2ms培养基上生长7天后，野生型植株鲜重约0.08mg，而过表达株系鲜重约为0mg，过表达株系鲜重显著低于野生型(图4d，f)。盐胁迫对植株鲜重的抑制率结果显示，不同浓度nacl对过表达株系抑制率显著高于野生型(图4h)。
[0086]
在不含nacl(0mm)培养基上生长7天后，过表达株系根长显著低于野生型(图4a，e)，表现为野生型根长约3.06cm，而过表达株系根长低于2.40cm(图4a，e)。高浓度的nacl处理明显抑制了植株根的生长，而且，随着1/2ms培养基中nacl浓度升高，抑制植株根生长的效果更加显著。在含有50mm的1/2ms培养基上生长7天后，野生型植株根长约3.16cm，而过表达株系根长低于2.13cm，过表达株系根长显著低于野生型(图4b，e)。在含有150mm的1/2ms培养基上生长7天后，野生型植株根长约1.41cm，而过表达株系根长低于0.84cm，过表达株系根长显著低于野生型(图4c，e)。在含有200mm的1/2ms培养基上生长7天后，野生型植株根长约0.20cm，而过表达株系根长为0cm，过表达株系根长显著低于野生型(图4d，e)。盐胁迫对植株根长的抑制率结果显示，不同浓度nacl对过表达株系抑制率显著高于野生型(图4g)。
[0087]
为了分析pttiny是否参与拟南芥发芽过程中的盐胁迫响应，我们将野生型、过表达pttiny拟南芥种子播种在含0mm和200mm nacl的1/2ms培养基上，在4℃低温处理3d，然后竖直放置于12h光照/12h黑暗的温室(21℃)中，观察拟南芥发芽状况。结果表明，在不含nacl(0mm)培养基上生长10天后，野生型发芽率显著高于转基因植株(图5a，b)，表现为野生型发芽率约98.32％，而过表达株系发芽率约75.58％。在含200mm nacl培养基上生长10天后，野生型发芽率显著高于转基因植株(图5a，b)，表现为野生型发芽率约92.76％，而过表达株系发芽率低于40.33％(图5a，b)。盐胁迫对拟南芥发芽抑制率的结果显示，200mm nacl对过表达株系的发芽抑制率显著高于野生型(图5c)。
[0088]
综上，异源过表达拟南芥后其盐胁迫耐受性降低，表明pttiny基因负调控拟南芥对盐胁迫的耐受性。可见，pttiny基因在调控植物盐胁迫方面起着重要的作用，对于培育能够抵御外界胁迫条件的杨树品种具有重要的意义。
[0089]
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

技术特征：
1.pttiny基因在调控植物盐胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述pttiny基因能够降低植物盐胁迫耐受性，所述pttiny基因在ncbi中基因序列号为xm_002298200.4。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过构建pttiny过表达载体，获得盐胁迫耐受性降低的转基因植株。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥，杨树。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述杨树为山新杨。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述盐胁迫耐受性表现为：在盐胁迫下，pttiny过表达株系的根长抑制率、植株鲜重抑制率及发芽抑制率均高于野生型。6.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下(1)或(2)：(1)通过增加目的植物中pttiny蛋白的活性，获得盐胁迫耐受性低于目的植物的植株；(2)通过促进目的植物中pttiny基因的表达，获得盐胁迫耐受性低于目的植物的植株；所述pttiny基因在ncbi中基因序列号为xm_002298200.4。7.根据权利要求6所述的植物育种方法，其特征在于，所述目的植物为拟南芥，杨树。8.根据权利要求7所述的植物育种方法，其特征在于，所述杨树为山新杨。

技术总结
本发明公开了一种PtTINY基因在调控植物盐胁迫耐受性中的应用，所述PtTINY基因在NCBI中基因序列号为XM_002298200.4。本发明通过构建PtTINY的过表达载体pCAMBIA2300-PtTINY，利用农杆菌花序侵染法转化野生型拟南芥(Clo-0，WT)，获得过表达植株，分析结果表明，在盐胁迫下，相对于野生型，过表达后降低了拟南芥幼苗的盐胁迫耐受性，从而为作物耐盐分子育种提供了基因资源。了基因资源。了基因资源。


技术研发人员：刘延凤 杨磊 程爽 孙楠 刘晓燕 王力敏 张洪霞 高晴
受保护的技术使用者：百思禾（山东）干细胞工程有限公司 招远市盛慧农业技术发展有限公司
技术研发日：2023.04.07
技术公布日：2023/8/14