一种红托竹荪黄水病病原的可视化LAMP快速检测技术

一种红托竹荪黄水病病原的可视化lamp快速检测技术
技术领域
1.本发明涉及食用菌病害检测领域，特别是涉及一种红托竹荪黄水病病原的可视化lamp快速检测技术。


背景技术：

2.红托竹荪，学名红托鬼笔，是贵州省重要特色珍稀食用菌，获国家地理标识产品保护“织金竹荪”，隶属于担子菌门basidiomycota，蘑菇纲agaricomycetes，鬼笔菌目phallales，鬼笔科phallaceae，竹荪属phallus。因具有漂亮的外表，经常被美其名曰“菌中皇后”，素有“真菌之花”、“山珍”之称。
3.红托竹荪在我国贵州、四川等地有大面积种植，经济价值很高。营养丰富，含人体必须的18种氨基酸和20％的蛋白质，2.6％的粗脂肪，60.4％的碳水化合物以及维生素b1、b12、c、d等，常食可增强和提高人体免疫功能，降低胆固醇，改善神经功能，对恶性肿瘤、乙肝、糖尿病等具多种药用功能和广阔研究及利用前景。红托竹荪属覆土型栽培，周期达4-10个月，易受环境微生物的影响，发生病害，出现菌蛋外皮开裂，水肿，枯萎，霉菌滋生，腐烂现象，其中尤以黄水病最重，成为红托竹荪致灾性病害，部分地区黄水病发生率达60-80％，部分地区甚至绝收。近30余年来，因尚未确定红托竹荪黄水病发病原因以及未有针对性的高效防治措施，该病害造成了极大经济损失，制约了红托竹荪产业发展。红托竹荪发病迅速，一旦发生，很快便会大面积暴发。因此，如何早期对红托竹荪黄水病病原进行快速有效地检测，是目前亟待解决的额问题。
4.现有的红托竹荪黄水病原的检测多以传统的形态学鉴定为主，准确率以及检测效率均不理想，不适用于现场或实验条件较差的基层实验室。环介导等温扩增(lamp)是一种除pcr外的dna扩增方法。该方法在恒温条件下扩增dna，特异性强、速度快、效率高。检测时间比pcr短，扩增时不依赖热循环仪器，只需要一些简单的小型加热器便能实现扩增，与pcr方法相比，lamp不需要pcr仪，扩增产物通过肉眼观察或浊度仪即可判定结果，适合于现场或条件较差的实验室进行快速检测。目前，尚未报道过对红托竹荪黄水病病原菌进行lamp检测的相关信息。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种红托竹荪黄水病病原的可视化lamp快速检测技术，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供了一组能够特异性检测黄水病病原菌的引物组合，适用于lamp可视化快速检测，为红托竹荪黄水病病原的早期快速检测奠定了基础。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测引物组合，所述引物组合包括包括如seq id no.1所示的正向外引物f3、如seq id no.2所示的负向外引物b3、如seq id no.3所示的正向内引物fip和如seq id no.4所示的负向内引物bip。
8.本发明还提供一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测试剂，包括所述的lamp检测引
物组合。
9.本发明还提供一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测试剂盒，包括所述的lamp检测引物组合。
10.本发明还提供一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测方法，包括采用所述的lamp检测引物组合、所述的lamp检测试剂或者所述的lamp检测试剂盒对红托竹荪黄水病病原进行lamp检测的步骤。
11.进一步地，具体包括以下步骤：
12.s1.提取待测样本dna；
13.s2.以待测样本dna为模板，采用所述的lamp检测引物组合对待测样本进行lamp扩增反应；
14.s3.所述lamp扩增反应结束后进行sybr green1显色反应，若呈现黄绿色，则所述待测样本中含有红托竹荪黄水病病原菌；若呈现橙红色，则所述待测样本中不含红托竹荪黄水病原病原菌。
15.进一步地，在步骤s2中，所述lamp扩增反应的反应体系为：8mm mgso4，0.8m betaine，1.4mm dntps，10mm(nh4)2so4，0.1％tween-20，10mm kcl，20mm tris-hcl，0.4μm f3和b3引物，3.2μm bip和fip引物，8u bst 2.0dnapolymerase，1.0μl dna模板。
16.进一步地，在步骤s2中，所述lamp扩增反应的反应条件为：63℃，60min。
17.进一步地，在步骤s3中，所述sybr green1显色反应为在扩增完成后向反应体系中加入2.5μl sybr green1试剂，混匀。
18.进一步地，所述红托竹荪黄水病病原为鬼笔复膜孢酵母(saccharomycopsisphalli)。
19.本发明还提供所述的lamp检测引物组合、所述的lamp检测试剂或者所述的lamp检测试剂盒在检测鬼笔复膜孢酵母中的应用。
20.本发明公开了以下技术效果：
21.1.快速、便捷。本发明只需要60min即可完成lamp反应，而且对仪器设备要求低，不需要pcr仪、凝胶成像系统等昂贵仪器，使用水浴锅即可完成检测。
22.2.特异性强。本发明只能够特异地扩增黄水病原鬼笔复膜孢酵母，供试其它对照菌株，均未发生扩增，具有物种特异性。
23.3.灵敏度较高。检测灵敏度为1pg/μldna模板浓度。
24.4.步骤简单。所有试剂在反应前添加，实现一步核酸扩增。
25.5.结果判定简便。其产物的检测方法比较多，用肉眼观察颜色或浊度就能够判断扩增与否，实现了结果可视化。
26.6.对人和环境安全，检测过程不需要使用eb等有毒试剂。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为lamp特异性检测扩增曲线图，其中，1：目标菌株(dna模板浓度1ng/μl)，2：目标菌株(dna模板浓度100pg/μl)；3：目标菌株(dna模板浓度10pg/μl)；4：目标菌株(dna模板浓度1pg/μl)；5-15：阴性对照(dna模板浓度为1ng/μl)；16：空白对照；
29.图2为lamp特异性检测显色反应图，其中，1：目标菌株(dna模板浓度1ng/μl)，2：目标菌株(dna模板浓度100pg/μl)；3：目标菌株(dna模板浓度10pg/μl)；4：目标菌株(dna模板浓度1pg/μl)；5-15：阴性对照(dna模板浓度为1ng/μl)；16：空白对照；
30.图3为lamp灵敏度验证扩增曲线图，其中，1：目标菌株(dna模板浓度1ng/μl)；2：目标菌株(dna模板浓度100pg/μl)；3：目标菌株(模板浓度10pg/μl)；4：目标菌株(dna模板浓度1pg/μl)；5：目标菌株(dna模板浓度100fg/μl)；6：目标菌株(dna模板浓度10fg/μl)；7：空白对照；
31.图4为lamp灵敏度验证显色反应图，其中，1：目标菌株(dna模板浓度1ng/μl)；2：目标菌株(dna模板浓度100pg/μl)；3：目标菌株(模板浓度10pg/μl)；4：目标菌株(dna模板浓度1pg/μl)；5：目标菌株(dna模板浓度100fg/μl)；6：目标菌株(dna模板浓度10fg/μl)；7：空白对照。
具体实施方式
32.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
33.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
35.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
36.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
37.本发明实施例中检测所用到的目标菌株从贵州省红托竹荪黄水病发病竹蛋上分离而来，为鬼笔复膜孢酵母(saccharomycopsisphalli)(公开在袁潇潇等发表的“红托竹荪黄水病病原鉴定”非专利文献中)；阴性对照菌株11株，如表1中编号2-12所示，其中，编号2-10菌株购自贵州金蟾大山生物科技有限责任公司，编号11-12菌株购自中国菌种保藏中心。
38.表1
39.编号菌株信息
1鬼笔复膜孢酵母(saccharomycopsisphalli)2talaromycesvariabilis3mucorirregularis4哈茨木霉trichodermaharzianum5neopestalotiopsissaprophytica6酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)7拟康宁木霉trichodermakoningiopsis8细枝孢霉(cladosporiumtenuissimum)9菌生轮枝孢lecanicilliumfungicola10淡紫紫霉purpureocilliumlilacinum11克拉通覆膜孢酵母(saccharomycopsiscrataegensis)，cgmcc编号：2.416812马加朗酵母saccharomycopsismalanga，cgmcc编号：2.676
40.本技术实施例所涉及到的试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司以及(newengland biolabs,beijing,china)公司，提取样本dna按照试剂盒自带的说明书操作步骤进行即可。反应所需的试剂(如sybr green1，bst 2.0dnapolymerase，引物组，lamp荧光染剂lamp fluorescent dye等放在-20℃保存)，加样时候尽量避开人群，配套实验服、口罩等，规范实验操作，防止污染。
41.实施例1引物的设计
42.发明人根据前期对红托竹荪黄水病原鬼笔复膜孢酵母的全基因测序内容，以及从红托竹荪黄水病发病竹蛋上分离下来的9株真菌以及近缘种克拉通覆膜孢酵母(saccharomycopsiscrataegensis)和马加朗酵母saccharomycopsis malanga(表1)的相同基因用bioedit软件进行序列对比，找到特异性片段，在primer exploerv5在线引物设计网站进行lamp引物组设计。引物组包括正向外引物f3，负向外引物b3，正向内引物fip，负向内引物bip。外引物f3/b3、内引物fip/bip能够针对红托竹荪黄水病原鬼笔复膜孢酵母的基因上的6个区域进行识别扩增，分别位于3’端的f3c区段，f2c区段，f1c区段和5’端的b1区段，b2区段，b3区段。引物的核苷酸序列如表2。
43.表2
44.primer名称序列(5
’‑3’
)碱基数hsb-1-f3gtgcactcgtttttcactgg(seq id no.1)20hsb-1-b3acacccaaacactcgcatag(seq id no.2)20hsb-1-fiptcgacaagtggatcgtctcattttggcggtggagtacct(seq id no.3)39hsb-1-biptttgtgctaggatattggcgtactccttggttcgtgtttca(seq id no.4)41
45.实施例2红托竹荪黄水病病原的可视化lamp快速检测
46.提取鬼笔复膜孢酵母样本dna，采用实施例1设计的引物组合对鬼笔复膜孢酵母进行lamp扩增反应。
47.反应体系：8mm mgso4，0.8m betaine，1.4mm dntps，10mm(nh4)2so4，0.1％tween-20，10mm kcl，20mm tris-hcl(ph＝9.0)，0.4μm f3和b3引物，3.2μm bip和fip引物，8u bst2.0dnapolymerase(生工生物工程(上海)股份有限公司)，1.0μldna模板，25μl体系。
48.反应体系所需试剂加入到pcr管中，加完后，用200μl移液枪滴两滴矿物油用以液
封。在水浴锅中以63℃反应60min。
49.反应结束后观察发现管内有沉淀出现，添加稀释10倍的sybr green12.5μl进入反应体系，摇晃观察颜色，反应管内呈现黄绿色，说明特异性扩增出了鬼笔复膜孢酵母dna。
50.实施例3lamp引物的特异性验证
51.提取表1所示12个待测样本的dna，其中，1号样本鬼笔复膜孢酵母dna浓度分别调整为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl和1pg/μl，其余待测样本作为阴性对照，dna浓度为1ng/μl。
52.采用实施例1设计的引物组合对待测样本进行lamp扩增反应，反应在qpcr仪上进行。
53.反应体系为：8mm mgso4，0.8m betaine，1.4mm dntps，10mm(nh4)2so4，0.1％tween-20，10mm kcl，20mm tris-hcl(ph＝9.0)，0.4μm f3和b3引物，3.2μm bip和fip引物，8u bst2.0dnapolymerase(生工生物工程(上海)股份有限公司)，1.0μldna模板，25μl体系。
54.反应体系所需试剂加入到qpcr管中，加完后，用200μl移液枪滴两滴矿物油用以液封。
55.反应条件为：63℃反应60min，80℃10min终止反应。
56.反应结束后通过扩增曲线和溶解曲线进行判断，扩增曲线呈现“s”型，溶解曲线呈现单峰，则为特异性扩增，说明检测样本中含有红托竹荪黄水病原鬼笔复膜孢酵母，扩增曲线如图1所示。
57.继续添加稀释10倍的sybr green12.5μl进入反应体系，摇晃观察颜色，若反应管内呈现黄绿色，说明发生特异性扩增，检测样本中含有红托竹荪黄水病原鬼笔复膜孢酵母dna；若呈现橙红色则为阴性，说明未出现特异性扩增，检测样本中不含红托竹荪黄水病原鬼笔复膜孢酵母dna，结果如图2所示。
58.根据图1-2可知，本发明只能够特异地扩增黄水病原鬼笔复膜孢酵母的dna，供试其它对照菌株的dna，均未发生扩增，本发明的检测引物组合具有特异性。
59.实施例4lamp引物的灵敏度验证
60.提取表1中鬼笔复膜孢酵母的dna，浓度分别调整为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl，100fg/μl和10fg/μl。
61.采用实施例1设计的引物组合对待测样本进行lamp扩增反应，反应在qpcr仪上进行。
62.反应体系为：8mm mgso4，0.8m betaine，1.4mm dntps，10mm(nh4)2so4，0.1％tween-20，10mm kcl，20mm tris-hcl(ph＝9.0)，0.4μm f3和b3引物，3.2μm bip和fip引物，8u bst2.0dnapolymerase(生工生物工程(上海)股份有限公司)，1.0μldna模板，25μl体系。
63.反应体系所需试剂加入到qpcr管中，加完后，用200μl移液枪滴两滴矿物油用以液封。
64.反应条件为：63℃反应60min，80℃10min终止反应。
65.反应结束后的扩增曲线如图3所示，继续添加稀释10倍的sybr green12.5μl进入反应体系，摇晃观察颜色，如图4所示。
66.根据图3-4可知，将样本dna浓度在1ng/μl～1pg/μl时，均能够特异性检测出鬼笔复膜孢酵母，当样本dna浓度调整到100fg/μl和10fg/μl时，不再出现“s”型扩增曲线，反应结束后无沉淀产生，sybr green1显色反应为橙红色，说明本技术检测灵敏度为1pg/μldna
模板浓度。
67.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测引物组合，其特征在于，所述引物组合包括包括如seq id no.1所示的正向外引物f3、如seq id no.2所示的负向外引物b3、如seq id no.3所示的正向内引物fip和如seq id no.4所示的负向内引物bip。2.一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的lamp检测引物组合。3.一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的lamp检测引物组合。4.一种红托竹荪黄水病病原的lamp检测方法，其特征在于，包括采用如权利要求1所述的lamp检测引物组合、如权利要求2所述的lamp检测试剂或者如权利要求3所述的lamp检测试剂盒对红托竹荪黄水病病原进行lamp检测的步骤。5.根据权利要求4所述的lamp检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：s1.提取待测样本dna；s2.以待测样本dna为模板，采用权利要求1中所述的lamp检测引物组合进行lamp扩增反应；s3.所述lamp扩增反应结束后进行sybrgreen1显色反应，若呈现黄绿色，则所述待测样本中含有红托竹荪黄水病病原菌；若呈现橙红色，则所述待测样本中不含红托竹荪黄水病原病原菌。6.根据权利要求5所述的lamp检测方法，其特征在于，在步骤s2中，所述lamp扩增反应的反应体系为：8mmmgso4，0.8mbetaine，1.4mmdntps，10mm(nh4)2so4，0.1％tween-20，10mmkcl，20mmtris-hcl，0.4μmf3和b3引物，3.2μmbip和fip引物，8ubst2.0dnapolymerase，1.0μldna模板。7.根据权利要求5所述的lamp检测方法，其特征在于，在步骤s2中，所述lamp扩增反应的反应条件为：63℃，60min。8.根据权利要求5所述的lamp检测方法，其特征在于，在步骤s3中，所述sybrgreen1显色反应为在扩增完成后向反应体系中加入2.5μlsybrgreen1试剂，混匀。9.根据权利要求4所述的lamp检测方法，其特征在于，所述红托竹荪黄水病病原为鬼笔复膜孢酵母(saccharomycopsisphalli)。10.如权利要求1所述的lamp检测引物组合、权利要求2所述的lamp检测试剂或者权利要求3所述的lamp检测试剂盒在检测鬼笔复膜孢酵母中的应用。

技术总结
本发明公开了一种红托竹荪黄水病病原的可视化LAMP快速检测技术，属于食用菌病害检测领域。本发明设计了一组针对红托竹荪黄水病病原的特异性LAMP检测引物组合，所述引物组合包括包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、如SEQ ID NO.2所示的负向外引物B3、如SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP和如SEQ ID NO.4所示的负向内引物BIP。通过实验验证，该引物组合只能够特异地扩增黄水病原鬼笔复膜孢酵母，特异性强，检测灵敏度可达1pg/μLDNA模板浓度，并且只需要60min即可完成LAMP反应，对仪器设备要求低，为红托竹荪黄水病病原的早期快速检测奠定基础。测奠定基础。测奠定基础。


技术研发人员：田风华 李超 卢君茜 谢江涛 彭科琴 冯文卓 赵志博 谭廷俊 覃再丽 刘雪 卢思蓓 梅世惠 张雨萌 余娜琴 林美伶
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/21