一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料及其制备方法

1.本发明涉及生物医用高分子
技术领域：
：，特别涉及一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料及其制备方法。
背景技术：
：：2.糖尿病是一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料的制备方法常见的慢性内分泌系统疾病，具有极高的发病率、死亡率和致残率。而慢性伤口是糖尿病溃疡是糖尿病最严重的并发症之一。由于当代社会人缺乏运动和大量油脂的摄入，患者数量迅速增加，而昂贵且繁琐的治疗方式给患者和社会带来了巨大的痛苦和沉重的经济负担，而细菌滋生，炎症失衡与血管再生异常是其难以愈合的主要原因。3.目前治疗慢性糖尿病伤口的临床模式包括血糖控制、伤口清创手术、抗生素治疗和伤口敷料等。虽然这些治疗方法可以减轻疼痛并有助于预防感染，但它们仍然面临许多不足。例如，长期注射胰岛素会导致身体出现严重并发症；非专业清创术会导致溃疡伤口扩大，加重感染；长期使用抗生素会导致严重的副作用和多药耐药性的形成；传统的伤口敷料功能单一，需要频繁更换[26]。这些问题不利于糖尿病伤口的治疗与愈合，急需安全简便而又有效的治疗方式。[0004]水凝胶是一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料的制备方法具有3d网络结构的聚合物材料，由于其优越的柔韧性、生物相容性、优异的流体吸收性能，并能够提供有利于组织再生的潮湿环境，有效避免伤口粘连造成的二次损伤。此外，通过调整结构设计，水凝胶敷料还可以被赋予最先进的物理和化学性能，如注射、粘附、自愈合、智能响应降解和优异的抗菌性能等。值得注意的是，由动态希夫碱键制备的水凝胶不仅具有良好的注射性和自愈合性能，而且可以在弱酸和高氧化条件下迅速降解和释放药物，发挥负载药物的治疗效果。而这些优异的理化性能，是作为理想伤口敷料重要的因素。因此，例如抗菌、抗炎、抗氧化及促血管化等多种功能化的水凝胶敷料被研究和开发出来，用以治疗糖尿病伤口。[0005]然而，单一的抗菌，抗炎或者抗氧化的治疗方案，面对复杂的糖尿病伤口微环境，往往顾此失彼，反而达不到想要的治疗效果。因而，能够全面应对糖尿病伤口微环境的治疗策略急需开发。[0006]申请人发现，硫化氢(h2s)在抗炎，抗氧化和促血管化作用方面的巨大作用。二烯丙基三硫醚(dats)能够在谷胱甘肽(gsh)存在的情况下释放出h2s，发挥其治疗作用。然而油溶性限制了其应用。水凝胶具有优异的流体吸收性能，并且良好的结构改造性能，拓展了其应用范围。因而，水凝胶与h2s气体疗法结合预计能够高效治疗糖尿病伤口。技术实现要素：[0007]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料及其制备方法，以解决上述问题。[0008]本发明的技术方案是这样实现的：一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料，多功能水凝胶敷料是基于phmg修饰的醛基化f108(pfc)和羧甲基壳聚糖cmc之间的动态希夫碱反应制备。[0009]进一步的，pfc的接枝率为1.4％[0010]进一步的，pfc的浓度为为100mg/ml。[0011]进一步的，包括如下步骤：[0012]s1、首先将10g壳聚糖cs和13.5g氢氧化钠naoh加入到500ml烧瓶中，然后将含有50ml水和50ml异丙醇的混合溶液加入到烧瓶中，充分搅拌形成混合液；[0013]s2、然后将混合液放到50℃的油浴锅中溶胀并碱化1h；[0014]s3、将溶解在20ml异丙醇的15g氯乙酸在30min内均匀滴加到混合液中，剧烈搅拌，并且保持在50℃油浴下反应4h。反应结束后，通过加入200ml的70％(v/v)甲醇停止反应；[0015]s4、将所得的混合液过滤，并收集滤渣。将得到的滤渣用90％(v/v)甲醇洗涤3次。过滤后将滤渣放到50℃的真空干燥箱内真空干燥1天。收集到的固体产物羧甲基壳聚糖cmc[0016]进一步的，还包括如下步骤：[0017]a、将5.8gf108(0.4mmol)，0.6g4-甲酰苯甲酸(4mmol)和30mg4-二甲氨基吡啶dmap加入到500ml带支管梨形瓶；[0018]b、在n2保护下，加入70ml无水二氯甲烷dcm充分溶解，然后将溶解于二氯甲烷的1.01g(4.89mmol)二环己基碳二亚胺dcc在冰浴条件下逐滴加入上述反应体系中，并在室温下反应2天；[0019]c、反应结束后，抽滤除去反应中生成的固体，并且将所得到有机相通过旋转蒸发仪浓缩，再用饱和nacl洗涤三次；[0020]d、洗涤结束后，通过旋蒸仪除去所有dcm，真空干燥5h后，将所得到的白色固体分散在100ml的纯水中，剧烈搅拌2h，通过高速离心(9000r/min，10min)除去沉淀，将所得到的上清液通过冷冻干燥得到产物f108-cho(fc)。[0021]e、将得到的干燥的1gfc与10mgphmg充分溶解于dmso中，搅拌4h，反应结束后，向反应溶液中加入0.62mg氰基硼氢化钠nabh3cn，室温下继续反应12h；[0022]f、反应结束后，用广泛透析袋(spectrum，mwco3500da)透析24h，冷冻干燥得到白色产物(phmg-f108-cho，pfc)。[0023]进一步的，还包括如下步骤：[0024]g、将200mgf108-cho与20mgdats溶解在2mldcm中，充分搅拌1h，然后利用旋转蒸发仪除去所有dcm以形成一层均匀的黄色薄膜；[0025]h、加入纯水水化薄膜8h；[0026]i、将步骤b中得到的混合液离心(10000rpm，10min)除去不溶的产物和较大的胶束；[0027]j、将步骤c所得的滤液经过冷冻干燥得到载药胶束dats@pfcs；[0028]k、通过调节dats/pfc的质量投料比为0.1，0.2与0.5获得dats@pfc-1，dats@pfc-2与dats@pfc-3三种不同载药量的载药胶束。[0029]进一步的，还包括如下步骤：将pfc与三种不同浓度cmc(2.0％w/v，2.5％w/v和3.0％w/v)按照1:1的体积比混合，混合均匀后，将混合液放置于37℃烘箱内分别制备水凝胶pfc&cmc2.0、pfc&cmc2.5和pfc&cmc3.0，接着将pfc胶束溶液更换为同等浓度的同等浓度的dats@pfc-1，dats@pfc-2与dats@pfc-3胶束溶液与制备载药水凝胶dats@pfc&cmc-1、dats@pfc&cmc-2和dats@pfc&cmc-3。[0030]本发明的有益效果为：[0031]1、将h2s与水凝胶联合起来制备了水凝胶敷料dats@pfc&cmc；[0032]2、该伤口敷料体系能够在糖尿病伤口低ph和高氧化应激的微环境下迅速降解，从而达到h2s快速释放的效果；[0033]3、该伤口敷料表面修饰的phmg能够与dats联合发挥优异的抗菌作用；[0034]4、释放出来的h2s能够充分发挥其高效的抗炎，抗氧化和促细胞增殖，迁移和血管化的作用；[0035]5、有效的改善糖尿病伤口微环境，达到加速糖尿病伤口愈合的作用。附图说明[0036]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0037]图1为本发明具体实施方式dats@pfc&cmc的制备及具有高效抗菌、抗炎、血管生成和促进mrsa感染的糖尿病伤口愈合的其机制作用示意图；[0038]图2为本发明具体实施方式不同phmg接枝率的pfcs胶束1h(a)和24h(b)溶血率；[0039]图3为本发明具体实施方式pfc&cmc的溶胶-凝胶转变实物图；[0040]图4为本发明具体实施方式pfc(a)和dats@pfc(b)透射电镜(tem)照片；[0041]图5为本发明具体实施方式pfc&cmcs水凝胶的扫描电镜图；[0042]图6为本发明具体实施方式pfc&cmcs水凝胶的孔隙率；[0043]图7为本发明具体实施方式pfc&cmcs水凝胶的溶胀率；[0044]图8为本发明具体实施方式pfc&cmcs水凝胶的粘附强度；[0045]图9为本发明具体实施方式pfc&cmc3.0水凝胶对猪皮的粘附强度实物图；[0046]图10为本发明具体实施方式pfc&cmc3.0水凝胶的表观粘度与剪切速率的关系图；[0047]图11为本发明具体实施方式pfc&cmc3.0水凝胶的可注射性实物图；[0048]图12为本发明具体实施方式pfc&cmcs水凝胶的储能模量(g')和损耗模量(g")随应变的变化；[0049]图13为本发明具体实施方式pfc&cmcs水凝胶的流变特性随应变从0.1％到300％交替变化关系；[0050]图14为本发明具体实施方式pfc&cmc3.0水凝胶的自修复性能实物图；[0051]图15为本发明具体实施方式pfc&cmc3.0水凝胶的氧化降解行为图；[0052]图16为本发明具体实施方式dats@pfc&cmc水凝胶的h2s释放行为图；[0053]图17为本发明具体实施方式(a)活/死染色法和(b)cck-8法评价pfc&cmc和dats@pfc&cmcs对huvecs细胞的细胞毒性的图像；[0054]图18为本发明具体实施方式fc&cmc、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后e.coli和mrsa的平板图像(a)和存活率(b，c)；[0055]图19为本发明具体实施方式fc&cmc、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后e.coli(a)与mrsa(b)的活死染色图像；[0056]图20为本发明具体实施方式fc&cmc、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后e.coli和mrsa的sem照片；[0057]图21为本发明具体实施方式fc&cmc、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后e.coli和mrsa细胞蛋白质的渗漏情况(a)和atp合成水平的变化(b)图像；[0058]图22为本发明具体实施方式细胞内h2s(a)的荧光成像及对应的荧光强度(b)图像；[0059]图23为本发明具体实施方式dats、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后细胞内炎性因子(a)tnf-α,(b)il-1β和(c)il-6的表达水平的变化情况；[0060]图24为本发明具体实施方式dats、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后细胞内炎性因子(a)il-10和(b)il-4的表达水平的变化情况；[0061]图25为本发明具体实施方式dats、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后活化巨噬细胞内p-stat3与p-erk的蛋白的表达水平；[0062]图26为本发明具体实施方式dats、pfc&cmc和dats@pfc&cmc处理后活化巨噬细胞内ho-1的mrna和蛋白的表达水平；[0063]图27为本发明具体实施方式dats@pfc&cmc水凝胶对huvecs细胞划痕愈合和增殖行为的影响对比图；[0064]图28为本发明具体实施方式(a)内皮细胞的导管形成，(b)huvec形成的管网的分支点和毛细管长度，(c)不同处理后huvecs中p-erk1/2和p-p38的表达水平；[0065]图29为本发明具体实施方式小鼠治疗流程示意图；[0066]图30为本发明具体实施(a)伤口愈合图片,(b)伤口追踪和(c)伤口愈合率对比图；[0067]图31为本发明具体实施方式15天时创面组织(a)h&e和(b)masson染色图；[0068]图32为本发明具体实施方式小鼠糖尿病创面治疗5天后细菌计数图；[0069]图33为本发明具体实施方式小鼠血液中炎性因子il-1β、il-6和tnf-α的表达水平图；[0070]图34为本发明具体实施方式创面组织中inos和cd163的成像和定量分析图；[0071]图35为本发明具体实施方式创面组织中ho-1的成像和定量分析图；[0072]图36为本发明具体实施方式15天时创面组织免疫组化分析(cd31)图；[0073]图37为本发明具体实施方式各组小鼠第15天血常规分析，(a)红细胞计数(rbc)，(b)白细胞计数(wbc)和(c)血红蛋白(hgb)图像；[0074]图38为本发明具体实施方式对照组和dats@pfc&cmc组心、肝、脾、肺、肾的h&e染色图。具体实施方式[0075]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0076]在本技术的描述中，需要说明的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。[0077]实施例1：[0078]由于壳聚糖仅能够溶解到酸性溶液中，导致严重限制了其应用。而羧甲基的引入，打破了壳聚糖的规整性，从而增加水溶性，拓展了壳聚糖的应用。cmc具体的合成步骤如下：首先将壳聚糖(cs，10g)和氢氧化钠(naoh，13.5g)加入到500ml烧瓶中，然后将含有50ml水和50ml异丙醇的混合溶液加入到烧瓶中，充分搅拌形成混合液。然后将混合物放到50℃的油浴锅中溶胀并碱化1h。之后。将溶解在20ml异丙醇的15g氯乙酸在30min内均匀滴加到混合物中，剧烈搅拌，并且保持在50℃油浴下反应4h。反应结束后，通过加入200ml的70％(v/v)甲醇停止反应。将所得的混合物过滤，并收集滤渣。将得到的滤渣用90％(v/v)甲醇洗涤3次。过滤后将滤渣放到50℃的真空干燥箱内真空干燥1天。收集到的固体产物即为cmc。利用傅里叶红外光谱(ft-ir)和核磁共振波谱(1hnmr)对cs和cmc的结构进行表征。羧甲基的取代度通过核磁氢谱图的相对积分面积计算。[0079]实施例2：[0080]利用酯化反应对f108进行醛基化修饰。将5.8gf108(0.4mmol)，0.6g4-甲酰苯甲酸(4mmol)和30mg4-二甲氨基吡啶(dmap)加入到500ml带支管梨形瓶，并且在n2保护下，加入70ml无水二氯甲烷(dcm)充分溶解，然后将溶解于二氯甲烷的1.01g(4.89mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)在冰浴条件下逐滴加入到上述反应体系中，并在室温下反应2天。反应结束后，抽滤除去反应中生成的固体，并且将所得到有机相通过旋转蒸发仪浓缩，再用饱和nacl洗涤三次。洗涤结束后，通过旋蒸仪除去所有dcm，真空干燥5h后，将所得到的白色固体分散在100ml的纯水中，剧烈搅拌2h，通过高速离心(9000r/min，10min)除去沉淀，将所得到的上清液通过冷冻干燥得到产物f108-cho(fc)。将得到的干燥的1gfc与10mgphmg充分溶解于dmso中，搅拌4h，反应结束后，向反应溶液中加入0.62mg氰基硼氢化钠(nabh3cn)，室温下继续反应12h。反应结束后，用广泛透析袋(spectrum，mwco3500da)透析24h，冷冻干燥得到白色产物(phmg-f108-cho，pfc)。通过调节phmg/fc的质量比为0.01，0.02与0.03得到三种不同接枝率的pfc，分别命名为pfc-1，pfc-1与pfc-3。并利用傅里叶红外光谱(ft-ir)和核磁共振波谱(1hnmr)对f108与fc的结构进行表征。[0081]phmg的接枝率通过滴定醛基计算，具体实验步骤如下：准确称量5mgfc与5mgpfc溶解于8ml的盐酸羟胺的甲醇溶液(20g/l)，然后向其中加入80μl百里酚蓝乙醇溶液(0.1％)作为指示剂。充分搅拌溶解均匀，由于醛基与盐酸羟胺的反应生成盐酸，此时溶液为酸性，指示剂为粉红色。然后逐滴滴加标准氢氧化钠溶液(0.01mol/l)，直到溶液变黄并且在30s不褪色，实验重复三次。利用以下公式(2-1)计算phmg的接枝率：[0082][0083]公式里，c(mol/l)是标准氢氧化钠溶液浓度，v1与v2(ml)分别是滴定fc与pfc消耗氢氧化钠溶液的体积，m是phmg的相对分子质量(3000g/mol)，m(mg)是pfc的质量。[0084]鉴于phmg有大量的胍基，带来优异的抗菌能力的同时，也会引起巨大的细胞毒性，因而我们通过溶血实验对pfc的接枝率和浓度进行进筛选。具体实验步骤如下：首先将100μl小鼠红细胞和12μl不同浓度或者不同phmg接枝度的pfc在无菌管中用生理盐水混合均匀，并在37℃下孵育1或24h，然后将混合物离心(3000rpm，4℃)，并用酶标仪读数器测量上清液在545nm处的吸光度。0.9％氯化钠和超纯水分别作为阴性对照和阳性对照。溶血率根据公式(2-2)进行计算。[0085][0086]实施例3：[0087]我们通过滴定法，测得phmf的含量如表2-3所示。以上实验表明，fc与pfc成功合成。[0088]表2-3三种胶束中phmg的接枝率和醛基含量[0089]table2-3graftrateofphmgandaldehydecontentinthreetypesofmicelles[0090][0091]溶血实验结果如下图2所示，高浓度的pfc和高phmg接枝率的pfc引起了很大的溶血，在1h后，即使是100mg/ml的pfc-2与pfc-3的溶血率已经达到26％与54％，远远高于安全的溶血率(5％)。值得注意的是，虽然pfc-1在140mg/ml与180mg/ml浓度下的1h溶血率是2.4％与4.5％，但是24h后的溶血率上升到8.1％与14.5％，表明这两个浓度下的pfc-1胶束仍然会引起比较大的溶血，无法使用。而100mg/ml的pfc-1在1h和24h的溶血率分别为0.3％与2.8％(《5％)，表明在pfc-1在100mg/ml浓度下，仍然具有良好的生物安全性。所以下面实验均采用100mg/ml的pfc-1的材料作为研究对象，并命名为pfc。[0092]实施例4：[0093]dats的脂溶性严重限制了其应用，因而我们通过薄膜分散法将dats负载到pfc胶束中。具体实验步骤如下：将200mgfc与20mgdats溶解在2mldcm中，充分搅拌1h，然后利用旋转蒸发仪除去所有dcm以形成一层均匀的黄色薄膜。然后加入少量纯水水化薄膜8h。在水化过程中，pfc胶束将自组装形成胶束以负载dats。将得到的上述混合液离心(10000rpm，10min)以除去不溶的产物和较大的胶束。将得到的滤液经过冷冻干燥得到载药胶束(dats@pfcs)。通过调节dats/pfc的质量投料比为0.1，0.2与0.5以获得dats@pfc-1，dats@pfc-2与dats@pfc-3三种不同载药量的载药胶束。通过有机元素分析仪计算dats@pfc载药量与载药效率。具体实验步骤如下[67]：准确称量dats@pfcs，在氦气气流中，在1150℃下利用氧化钨在过量氧气下燃烧，然后利用金属铜在850℃下还原，得到二氧化硫。通过测量二氧化硫的质量计算s元素含量，从而得出dats的质量。dats的载药量与载药效率用下列公式计算：[0094][0095][0096]f108是可以在水中自组装成胶束的两亲性嵌段共聚物，因而在负载药物方面得到广泛研究。如图3所示，油状的dats与水直接混合会引发乳化现象，溶液为白色乳浊液。而制备的载药胶束的水溶液是黄色的澄清液体(dats为黄色油状物)，这表明dats成功的负载到pfc胶束内，并且所获得的在载药胶束能够均匀的分散在水中。[0097]实施例5：[0098]通过马尔文粒度仪(dls)测定了pfc和dats@pfc的粒径与电位，并且通过tem进一步研究了胶束的形貌等特征。结果如图4所示。相较于pfc，dats@pfc的粒径更小，这可能是胶束负载的脂溶性dats使得原本胶束的舒适内核更加紧缩，从而减少了胶束的尺寸。透射电镜(tem)检测到pfc与dats@pfc的胶束是都具有明确三维结构，并且胶束分散均匀。[0099]实施例6：[0100]在确定载药胶束dats@pfcs的成功制备后，通过高温燃烧法检测了载药胶束中s元素的含量，从而计算载药胶束中的载药量与载药效率。以dats@pfc-1为例，5.254mg的dats@pfc-1中s元素的含量为1.545％。所以5.254mg中s的质量为5.254×1.545％＝0.0812mg。而一个dats有三个硫原子，s的相对分子质量为32g/mol，dats相对分子质量为178.34g/mol。所以根据比例关系，计算得到dats@pfc-1中dats的质量＝s元素质量/(s元素的相对分子质量×3)×dats的相对分子质量＝0.151mg。所以可以计算得到，dats@pfc-1中dats的载药量＝(胶束中dats的质量)/(dats@pfc-1的质量)×100％＝(0.151/5.254)×100％＝2.88％。dats@pfc-1中dats的载药效率＝(胶束中dats的质量)/(dats的质量)×100％＝(0.151/5.254)×100％＝31.63％。同理可得其余两种载药胶束的载药量与载药效率，计算结果分别如表2-3所示。[0101]表2-3三种胶束中dats载药量和载药效率[0102][0103]综上所述，合成了水凝胶的组分cmc与pfc，并通过ft-it和1hnmr对其结构进行表征，并且通过溶血实验对phmg的接枝率和pfc浓度进行筛选。后将dats负载到pfc的疏水内核中，制备了载药胶束dats@pfc，并计算三种不同投料比的载药胶束的载药量与载药效率。还对制备的空白胶束与载药纳米胶束的粒径和形貌进行了表征。可以得出以下结论：1)合成cmc与pfc，并且测定cmc的羧甲基取代度为74％且经过溶血筛选得到pfc的安全接枝率为1.4％和安全浓度为100mg/ml；2)成功将dats负载到pfc胶束中，制备的载药胶束粒径为198nm，并且结构均匀；3)通过不同的投料比制备了三种不同载药量的纳米胶束，并且通过高温燃烧法检测了三种载药胶束的载药量与载药效率。[0104]实施例7：[0105]在上述实施例中，通过溶血实验筛选了安全的pfc浓度(10％，w/v)，因而我们制备了三种不同的cmc浓度(2.0％，2.5％和3.0％，w/v)，以制备三种不同的水凝胶。首先将pfc与不同浓度的cmc按照1:1的体积比混合，混合均匀后，将混合液放置于37℃烘箱内以制备三种水凝胶：pfc&cmc2.0，pfc&cmc2.5和pfc&cmc3.0。将pfc胶束溶液更换为同等浓度的dats@pfc-1，dats@pfc-2与dats@pfc-3胶束溶液以制备三种载药水凝胶，并分别命名为dats@pfc&cmc-1，dats@pfc&cmc-2和dats@pfc&cmc-3。[0106]实施例8：[0107]水凝胶的凝胶时间通过倒置瓶法测定。具体实验方法如下，将100μl的10％(w/v)pfc水溶液分别与100μl不同浓度的cmc溶液加入到1.5ml离心管中，混合均匀后，将离心管放置到恒温在37℃的水浴锅中。每个10s取出来倒置观察离心管内液体的状态，直到观察液体不再流动，记录此时的时间，即为成胶时间。[0108]结果如表3-1所示。可以发现，随着cmc的浓度的增加，水凝胶的成胶时间液逐渐减少，这是由于cmc浓度的增加，使得水凝胶间的交联密度增大和氢键作用增强，加快了水凝胶的形成。这种水凝胶的成胶时间有利于在伤口上的应用。[0109]表3-1不同质量比的pfc&cmc水凝胶的凝胶化时间[0110][0111]实施例9：[0112]将冷冻干燥后的水凝胶样品利用液氮脆面法制备截面样品，具体步骤如下：将得到的水凝胶放入到液氮中，充分冷却后，然后用镊子取出，用刀片切开水凝胶，并用高分辨透射电子显微镜(sem)观察截面的形貌，最后通过imagej软件分析水凝胶的孔隙率。[0113]水凝胶的大量孔隙赋予水凝胶良好的吸水性能，所以通过溶胀实验检验水凝胶的吸水性能。具体实验步骤如下：将大小相同的干燥的水凝胶准确称重，记录此时的质量为w0，然后放置于纯水中，每隔1h取出称重，直到水凝胶质量不再变化，可认为此时达到溶胀平衡，将此时的水凝胶称重，并记录为wt。水凝胶的溶胀率通过公式(3-1)计算：[0114][0115]我们利用sem对干燥的三组水凝胶pfc&cmc2.0，pfc&cmc2.5和pfc&cmc3.0的截面形貌进行表征，并用使用imagej软件计算了这三种水凝胶的孔隙率，结果如图5所示。所有的水凝胶都有多孔结构，并且随着cmc浓度的增加，水凝胶截面的网络孔洞变得更小。并且孔隙率也随着cmc浓度的增加(图6)，从43.1％降低到24.8％。这种孔径的减少和孔隙率的降低也体现在了溶胀率上。如图7，随着cmc浓度的增加，水凝胶的溶胀率从17.6降低到16.1，这是由于紧凑的网络结构使得储存水的空间减少，但是即使是溶胀率最低的cmc&pfc3.0，也能够吸收超过自身质量15倍的水，这是因为大量的孔径和大量的氢键作用能够很好的锁住水分。以上结果表明水凝胶优异的吸水性能，能够有效的吸收伤口组织的渗出液，并且保持伤口的湿润环境，有利于伤口组织的快速愈合。[0116]实施例10：[0117]如图8所示，随着cmc浓度的增加，pfc&cmc2.0，pfc&cmc2.5与pfc&cmc3.0的黏附强度分别为4.4，7.6与13.8kpa。pfc&cmc3.0的黏附强度远高于其余两组，通过搭接剪切试验研究水凝胶对于组织的黏附强度。实验步骤如下：实验用新鲜的猪皮模拟正常的皮肤组织，先将猪皮用pbs浸泡一天以除去表面油脂，然后将猪皮切成10×40(mm2)的长条，将50μl不同浓度的cmc溶液与50μl的pfc溶液混合均匀后，均匀的涂抹在一块猪皮上，再将另一块猪皮紧贴在涂有胶的位置，然后在37℃下放置4h。利用万能试验机测定水凝胶对于组织间的黏附强度，设定为20n，测压速率设定在1mm/min。而我们通过在粘接好的猪皮下悬挂100g的砝码进一步验证了水凝胶对于组织的黏附力。[0118]从图9可以看出，用pfc&cmc3.0水凝胶黏附在一起的两块猪皮，能够承受100g的砝码长时间不分开。水凝胶的这种黏附是源自水凝胶表面的电荷与细胞上的磷脂分子强烈的静电相互作用，并且随着cmc浓度的增加，这种黏附强度可以得到很大的提高。这种强大的黏附强度，能够让水凝胶牢固的黏附到伤口组织，保证良好的治疗效果。以上结论可以清晰的证明该水凝胶优异的黏附性能。[0119]实施例11：[0120]pfc&cmc3.0水凝胶的表观粘度随剪切速率的变化情况。如图10所示，随着剪切速率的增加，pfc&cmc3.0水凝胶的表观粘度从3000pa·s迅速降低到0.55pa·s。表明水凝胶具有良好的剪切变稀性能。此外，水凝胶能够从注射器力挤出来，并且在水中形成连续的长条(图11)。表明水凝胶具有良好的可注射性。这种优异的可注射性源自水凝胶的成胶方式：基于动态亚胺键的的席夫碱反应，这种可逆的动态亚胺键可以在没有外力的作用下自发进行。因而，当水凝胶从注射器中挤出，水凝胶会受到强大的剪切力作用，此时水凝胶的交联网络被破坏，水凝胶向流动态转化，因此水凝胶能够从注射器中被挤出；而挤出后的水凝胶由于剪切力的消失，动态亚胺键迅速连接到一起，恢复到原来的连接状态，水凝胶也因此重新恢复到凝胶状态。以上结论可以证明，pfc&cmc水凝胶具有良好的可注射性能，这种良好的可注射能力，让pfc&cmc水凝胶能够应用到各种地方，极大的拓展了pfc&cmc水凝胶的应用范围[0121]实施例12：[0122]通过流变仪研究了pfc&cmc的自修复性能。像前面的步骤制备样品，利用时间扫描模式对水凝胶的储能模量g’与损耗模量g”随时间的变化进行研究，应变设置为0.1％-1500％，频率设定为1hz。之后利用交替扫描模式对水凝胶的自修复性能进行研究，角频率设定为6rad/s，应变设定为0.1％(60s)与300％(60s)交替切换三次，记录储能模量g’与损耗模量g”的变化。[0123]如图12所示，在0.1％的小应变下，pfc&cmc2.0，pfc&cmc2.5与pfc&cmc3.0的储能模量g’与损耗模量g”的数值和大小关系都能保持不变(g’大于g”)，值得注意的是，pfc&cmc2.0，pfc&cmc2.5与pfc&cmc3.0的储能模量g’分别为150，4000和5300kpa，这表明pfc&cmc3.0有着更好的机械强度，这是由于cmc浓度的增加，使得pfc&cmc3.0具有更大的交联密度。然而，随着应变的增加，g’与g”也随之发生变化，并且最终产生了交点，而在这个交点之后的g’与g”的大小关系发生颠倒，这种大小关系的变化表明水凝胶的基础结构被破坏，此时处于流动态。值得注意的是，pfc&cmc3.0(270.23)％的交点对应的应变值远远大于pfc&cmc2.0(68.2％)与(160.2％)pfc&cmc2.5交点对应的应变值。这是因为交联密度的增加，使得水凝胶的结构变得更加牢固，因而拥有更优异的抗应变能力。[0124]实施例12：[0125]通过上述实施例确定三种水凝胶的临界破坏对应的应变后，通过流变仪的时间循环扫描模式对水凝胶的破坏-修复的循环过程进行研究，如图13所示，以pfc&cmc3.0水凝胶为例，在0.1％的应变作用下，水凝胶的g’与g”分别为5300pa与2000pa，并且这样的应变大小能够在60s保持不变。相反，当应变达到300％(》270.23％)后，g”迅速超过g’，并且这种大小关系能够抑制保持60s而不发生很大的变化，表明pfc&cmc3.0的稳定结构被破坏。但在应变恢复到0.1％时，g’与g”有能够迅速恢复到起始水平，并且数值也几乎与之前一致，表明pfc&cmc3.0水凝胶重新恢复到原来的稳定结构。这样的结果在两个循环内可重复，这样的结论表明水凝胶具有良好的自修复性能。[0126]将两块不同颜色的水凝胶先切开成半圆放置到一起，两块水凝胶能够很好的连接到一起，从图14可以看出，由于两块水凝胶的成功连接，连接处变成黑色，表明水凝胶的成功连接。值得注意的是，连接好的水凝胶能够承受一定的拉伸而不会断裂，表明水凝胶已经很好的修复到一起。因此，以上结果清晰的表明，pfc&cmc3.0水凝胶具有良好的自修复性能，这种自修复能够保证水凝胶在应用过程中即使被破坏，也能够很快的修复，从而让水凝胶有更优异的敷料性能.[0127]实施例13：[0128]为了评价pfc&cmc体外降解行为，首先准确称取冷冻干燥后的pfc&cmc水凝胶，质量记录为w1，先使其达到溶胀平衡。再将水凝胶分别浸泡到不同条件的pbs中：1)ph＝7.4；2)ph＝7.4，100μmh2o2；3)ph＝6.5；4)ph＝6.5，100μmh2o2。每隔一天取出水凝胶样品，除去多余盐分并干燥，质量记录为w2。通过公式(3-2)计算水凝胶的剩余质量比来评估水凝胶的降解行为：[0129]实施例14：[0130]通过不同的条件模拟水凝胶pfc&cmc3.0在糖尿病伤口微环境的体外降解行为，如图15所示，在6天后，pfc&cmc3.0水凝胶的剩余质量分别降低到原来的37％(ph＝7.4)，23％(ph＝7.4+100μmh2o2)，20％(ph＝6.5)与10％(ph＝6.5+100μmh2o2)，表明，pfc&cmc3.0水凝胶在低ph和高氧化状态下，在糖尿病伤口实现药物的快速响应释放，很好的避免了传统敷料需要频繁更换敷料而可能带来的二次伤害，严重抑制伤口的愈合。[0131]实施例15：[0132]通过用不同浓度的gsh评价dats对gsh的响应释放h2s行为，如图16所示，在pbs处理的dats@pfc&cmc-1水凝胶在80min内没有检测到任何h2s的释放，而随着gsh浓度的增加，h2s的释放速率逐渐增大，并且释放量也随之增大。如，在ph＝7.4的条件下，dats@pfc&cmc-1水凝胶在gsh浓度为2.0mm，h2s释放量能达到1.1μmol，远高于同等ph条件但是gsh浓度为1.0mm(0.5μmol)与1.5mm(0.6μmol)的释放量。酸性条件虽然会加快水凝胶的降解，但是由于gsh的还原性主要源自与巯基(-sh)，而在酸性条件下的比较难以脱去质子形成有反应活性的硫醇盐负离子(-s-1)，导致dats释放速率反而会下降。不过值得注意的是，dats@pfc&cmc-1水凝胶在80min的时候，释放量仍然能够达到0.9μmol，表明微酸环境影响对dats的释放速率和释放量影响不大。因而，dats@fc&cmc-1水凝胶能够在gsh存在的情况下，释放足量的h2s，从而发挥h2s的治疗作用，这种长效缓释有利于的h2s对于糖尿病伤口这种慢性伤口恢复效果。[0133]综上所述：1)首先制备空白水凝胶pfc&cmc2.0，pfc&cmc2.5和pfc&cmc3.0以及载药水凝胶dats@pfc&cmc-1，dats@pfc&cmc-2和dats@pfc&cmc-3，并且研究了空白水凝胶的成胶时间，溶胀，黏附，可注射与自修复等相关理化性能，发现水凝胶具有优异的理化性能；2)空白水凝胶pfc&cmc3.0虽然溶胀率较低，但是仍然具有良好的吸水性能，除此以外，pfc&cmc3.0具有更加良好的黏附性，机械性能与自修复性能；3)水凝胶能够在模拟的糖尿病微环境内快速降解，释放出载药胶束，并且在有gsh存在下能够快速释放出h2s。综上，鉴于pfc&cmc3.0具有最优异的理化性能，因而后续实验均采用该空白水凝胶进行实验，并且命名为pfc&cmc。[0134]实施例16：[0135]选用人脐静脉血管内皮细胞(huvecs)和巨噬细胞raw264.7进行细胞实验。huvecs采用dmem为培养基，并加入10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素配制成完全培养基。raw264.7采用巨噬细胞专用培养基培养。细胞均在37℃，5％co2的细胞培养箱内培养。实验将未经任何处理的巨噬细胞称为正常巨噬细胞，而将与脂多糖(lps，5μg/ml)的培养基孵育24h后的巨噬细胞成为活化巨噬细胞。[0136]用上述步骤中的完全培养基培养huvecs，并在37℃，5％co2的细胞培养箱内培养细胞。实验步骤如下：首先，将24μl的灭菌后的fc&cmc，pfc&cmc，dats@pfc&cmc-1，dats@pfc&cmc-2与dats@pfc&cmc-3水凝胶液体加入96孔板内，并在烘箱里放置10min使其成胶。然后每孔加入1×104个huvecs细胞，并且在37℃下培育48h。孵育结束后，用pbs清洗细胞，后将cck-8加入孔板，并且在黑暗中孵育30min。通过多功能酶标仪检测器检测细胞在450nm处的吸光度。此外，按照上述步骤处理hunvecs后，用am/pi对细胞染色30min，并且用倒置荧光显微镜观察细胞荧光并且拍照。[0137]过量的h2s会导致比较大的细胞毒性，因而需要筛选出安全的载药量，如图17所示，fc&cmc，pfc&cmc与dats@pfc&cmc-1处理后的huvecs细胞存活率都在90％以上，因而这些都具有良好的生物安全性。与之相反的是，dats@pfc&cmc-2与dats@pfc&cmc-3处理后的huvecs细胞存活率都在70％以下，产生了大量的细胞毒性。而细胞的活死染色实验同样验证了这一结论。如图17所示，fc&cmc，pfc&cmc与dats@pfc&cmc-1处理后的细胞都有大量的绿色荧光(钙黄素am标记的活细胞)，相反，dats@pfc&cmc-2与dats@pfc&cmc-3处理的huvecs出现大量的红色荧光(pi标记的死细胞)，表明大量的死细胞出现。这种毒性主要是源自phmg与dats释放出过量的h2s导致的。综上，pfc&cmc与dats@pfc&cmc-1水凝胶都具有良好的生物安全性。鉴于以上结果，选择dats@pfc&cmc-1进行后续的实验，并且命名为dats@pfc&cmc。[0138]实施例17：[0139]选取大肠杆菌(e.coli)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)两种细菌通过菌落计数法评价水凝胶的体外抗菌效果，如图18所示，dats@pfc&cmc表现出比pfc&cmc更好的抗菌能力，6h处理后的细菌存活数下降到2.2和1.6log10cfu/ml，这是由于dats本身的抗菌能力，与phmg产生了良好的协同抗菌作用，从而表现出更加优异的抗菌性能。如图19所示pfc&cmc与dats@pfc&cmc处理后的e.coli与mrsa有大量的红色荧光，而几乎没有绿色荧光，表明pfc&cmc与dats@pfc&cmc几乎杀死了所有的细菌。[0140]实施例18：[0141]为了研究dats@pfc&cmc的抗菌机理，处理e.coli和mrsa后，4℃下离心收集水凝胶处理后的细菌并用增强型bca蛋白测定试剂盒测量蛋白质浓度和增强型atp分析试剂盒测量处理后细菌atp水平的变化；如图20所示，pbs与fc&cmc处理的e.coli与mrsa仍然能够保持完整的细菌结构。而pfc&cmc与dats@pfc&cmc处理后的e.coli出现大量孔洞，并且mrsa出现收缩和塌陷，并且有大量物质泄露，表明pfc&cmc与dats@pfc&cmc能够通过破坏细菌的细胞膜的完整结构高效的杀死细菌。[0142]实施例19：[0143]通过bca和atp试剂盒研究了pfc&cmc与dats@pfc&cmc处理后的e.coli与mrsa的蛋白质浓度和atp水平。如图21，可以清晰的表明，pfc&cmc与dats@pfc&cmc能够通过破坏细菌的细胞膜，导致蛋白泄露和抑制atp水平，从而达到高效消灭细菌的作用。[0144]实施例20：[0145]在确认有gsh存在的情况下，dats@pfc&cmc能够在体外释放出h2s后，我们进一步探究了dats@pfc&cmc在细胞内能否产生h2s；如图22，dats@pfc&cmc处理的活化巨噬细胞的绿色荧光强度远远高于其余组，接近于dats组荧光强度的三倍，以上结论可以证明，dats@pfc&cmc能够在细胞内产生大量的h2s，为之后发挥h2s治疗作用打下铺垫。[0146]实施例21：[0147]通过elisa试剂盒研究了dats@pfc&cmc对炎症因子的影响情况；[0148]如图23和图24所示，dats@pfc&cmc处理后的活化巨噬细胞的tnf-α、il-1β和il-6水平分别为1.2，0.4和2.1ng/ml，远远低于lps诱导的巨噬细胞的水平，dats@pfc&cmc处理后的活化巨噬细胞的il-10与il-4表达水平分别为79与68pg/ml，足量的h2s，极大的促进了抗炎因子il-10与il-4的表达，从而发挥抗炎作用。[0149]实施例22：[0150]通过wrt-qpcr检测巨噬细胞ho-1，cd206和inos的mrna表达水平；[0151]通过westernblot检测ho-1、erk、p-erk、stat3、p-stat3、cd163和inos的蛋白表达水平；[0152]为了观察巨噬细胞的形态的变化，按照上述步骤处理巨噬细胞，然后在倒置荧光显微镜显微镜下观察细胞形态并拍照。此外，还通过免疫荧光实验研究dats@pfc&cmc的抗炎机理；如图25所示，dsta@pfc&cmc能够通过抑制stat3和erk的磷酸化水平，从而发挥抗炎作用；如图26所示，dsta@pfc&cmc处理进一步特异性激活血红素加氧酶的表达，表明dsta@pfc&cmc也有优良的抗氧化作用。[0153]实施例23：[0154]通过huvecs增殖的实验评估dats@pfc&cmc在促进huvecs细胞增殖和迁移中的作用；如图27所示，结果表明dats@pfc&cmc确实能促进内皮细胞的快速增殖、迁移，最终促进了划痕的愈合。[0155]实施例24：[0156]通过huvecs模拟血管的生成。我们接下来研究了dats@pfc&cmc的处理刺激huvecs在基质胶上形成管状网络；使用elisa试剂盒测定不同了时间点的p-p38与p-erk1/2的表达水平；如图28所示，表明dats@pfc&cmc促进了huvecs生成了更长和更密的血管，这有利于营养物质的运输，从而促进伤口的愈合；dats@pfc&cmc能够通过保持p-p38与p-erk1/2的持续高表达，从而促进huvecs的增殖，迁移与促血管化，最终能够加快伤口的愈合。[0157]实施例25：[0158]动物实验：雄性icr小鼠(25-30g，6-8周)适应性培养三天后，连续四天注射stz的柠檬酸钠溶液(80mg/kg)，并用血糖仪监控小鼠的血糖，当血糖值高于16.8mm时，表明此时老鼠处于糖尿病状态。老鼠用异氟烷麻醉后，对老鼠进行脱毛处理，并用直径1cm打孔器在小鼠的脱毛部位打孔，然后在孔位置滴加10μl的mrsa的pbs溶液(108cfu/ml)，建立糖尿病伤口模型。小鼠随机分为4组，用不同的材料治疗伤口：1)pbs(50μl)；2)dats@fc&cmc(50μl)；3)pfc&cmc(50μl)；4)dats@pfc&cmc(50μl)。在固定的时间用直尺测量小鼠伤口面积，并拍照。伤口的闭合率用公式(5-1)计算：[0159][0160]其中，a0为第0天伤口的面积，at为指定时间点的伤口面积。[0161]收集治疗后的5天小鼠的伤口组织，放入pbs中，超声0.5h后，将得到的液体以10倍系数梯度稀释，然后取100μl不同浓度的液体用涂布棒均匀的涂布到固体lb板上，37℃下培养20h，观察细菌生长情况并拍照。同时，将上述梯度稀释的液体接种到固体lb板上，37℃下培养20h，观察细菌的菌落数。[0162]收集治疗15天后小鼠的血液，在2000rpm，4℃下离心，收集上清液，使用elisa试剂盒检测上清液中tnf-α、il-6和il-1β的表达水平。[0163]收集治疗15天后的伤口组织，经过固定，脱水，浸蜡，包埋，切片等步骤，然后用ho-1，inos和cd163抗体进行免疫标记，倒置荧光显微镜观察并拍照。得到的切片用h&e和masson染色，以观察伤口愈合情况。[0164]收集15天后的小鼠静脉血，并由武汉赛维尔生物技术公司检测小鼠血液中红细胞(rbc)、白细胞(wbc)和血红蛋白(hgb)的数量来评估治疗过程的安全性。[0165]收集治疗15天后的心、肝、脾、肺和肾进行h&e染色以评估水凝胶的生物安全性。[0166]如图29展示了mrsa感染的糖尿病小鼠伤口模型的建立和治疗过程[0167]如图30所示，pbs组在第5、10和15天的伤口闭合率分别为28.8％、51.4％和68.4％，明显慢于pfc&cmc组与dats@fc&cmc组，因为dats@fc&cmc组和pfc&cmc组在第15天的伤口闭合率，分别高达79.0％和80.4％。dats@fc&cmc组和pfc&cmc组的伤口愈合率显著加快可分别归因于phmg以及dats的抗菌或者抗炎作用，有效的杀死伤口的细菌或者抑制伤口的炎症，从而部分改善了伤口的微环境，促进了伤口的愈合。然而，单一的抗菌或抗炎作用无法应对复杂的糖尿病微环境，往往会顾此失彼，因此伤口愈合的情况仍然不令人满意。幸运的是由于dats@pfc&cmc的高效杀菌，抗炎，抗氧化和促进组织再生的多种调节作用的整合，能够高效的改善了糖尿病伤口的微环境，最终显著加速了伤口愈合，在第10天达到85.8％的伤口闭合率，在第15天达到97.5％的伤口闭合率，伤口几乎闭合。[0168]h&e和masson染色同样验证了这一结论，如图31所示，1)dats@pfc&cmc组伤口部位新形成的肉芽组织和皮肤附着物(腺体和毛囊)的数量以及胶原沉积明显多于其他组，成熟的纤维组织更多；2)在dats@pfc&cmc组不成熟的组织宽度和上皮角化层厚度最小，表明dats@pfc&cmc能加速组织愈合，更快的成熟改建。[0169]如图32显示了5天后伤口部位组织的菌落情况。dats@pfc&cmc治疗5天后的伤口组织的几乎没有菌落生成，表明dats@pfc&cmc能够高效的杀死伤口部位的细菌。pfc&cmc由于phmg的作用，使得细菌的菌落数也几乎很少，然而其余组仍然有大量的菌落生成，表明仍然存在细菌感染的情况。菌落计数也同样验证了这一结论。dats@pfc&cmc治疗后的组织的仅仅有101.6log10cfu/ml，高于pfc&cmc的103.5log10cfu/ml。这是由于dats与phmg的协同杀菌的作用，高效的消灭伤口的细菌。[0170]利用elisa试剂盒检测了小鼠治疗15天后血液中的炎症因子水平，如图33所示，pbs治疗的糖尿病小鼠伤口部位仍有严重的炎症反应，因为il-1β、il-6和tnf-α的表达水平仍分别高达310.9、287.2和413.3pg/ml。然而，dats@fc&cmc、pfc&cmc治疗后，il-1β、il-6和tnf-α的表达水平都有一定程度的降低，主要是由于dats的抗炎作用或者phmg的抗菌作用，部分缓解了糖尿病伤口的炎症反应。值得注意的是，使用dats@pfc&cmc也达到了最佳的抗炎效果，il-1β、il-6和tnf-α的表达水平分别显著下降至139.5、91.9和222.3pg/ml，远远低于糖尿病小鼠的炎症水平，与正常健康小鼠分泌的几乎相同。这些结果表明，phmg的优异抗菌作用和dats的优异抗炎作用共同高效地缓解了伤口部位的炎症反应。[0171]此外，dats@pfc&cmc卓越的抗炎作用伤口组织的免疫荧光染色结果进一步证明。如图34，在pbs处理的伤口组织中仅观察到强烈的红色荧光(inos标记的m1型巨噬细胞)，表明糖尿病小鼠的伤口组织仍有严重炎症，而在dats@pfc&cmc处理的伤口组织中出现了大量的绿色荧光(cd163标记的m2巨噬细胞)。荧光强度的定量数据也同样炎症了这一结论。以上结论表明，dats@pfc&cmc可以通过调节巨噬细胞表型发挥抗炎作用。[0172]此外如图35所示，与其余组相比，dats@pfc&cmc治疗进一步显著激活了伤口组织中ho-1的表达。绿色荧光的量远远高于其余组，荧光定量结果与之一致。表明dats@pfc&cmc能够促进ho-1的表达从而发挥其优异的抗氧化作用。[0173]值得注意的是，伤口组织的免疫组织化学染色结果进一步证实dats@pfc&cmc治疗显著促进了伤口组织的血管化作用，如图36所示，dats@pfc&cmc处理的伤口组织中cd31阳性微血管的数量比pbs，dats@fc&cmc和pfc&cmc组中的伤口组织高5.3倍、1.7倍和4倍。[0174]综合来看，这些结果清楚地表明dats@pfc&cmc可以通过高效的抗菌、抗炎和促血管生成等作用，显著促进糖尿病伤口的快速愈合。[0175]上述结果表明dats@pfc&cmc在糖尿病伤口的有效管理方面具有重要的潜力，但其在临床实践中的成功应用取决于其良好的生物相容性。因此，在整个治疗期间定期测量体重的变化。此外，在治疗结束时采集血液和重要器官，进行常规血液分析和h&e染色。除了用pbs处理的糖尿病小鼠经历了显著的体重减轻，用三种水凝胶治疗伤口的所有糖尿病小鼠的重量没有显著变化(图37)，这表明所制备的水凝胶具有良好的生物相容性。血常规分析和小鼠的心，肝，脾，肺，肾的h&e染色结果进一步证实dats@pfc&cmc具有良好的生物相容性，表现为：1)三种代表性血液学标志物(红细胞计数(rbc)、白细胞计数(wbc)、血红蛋白(hgb))的值均在正常范围内(图37)；2)dats@pfc&cmc治疗的小鼠与正常健康小鼠相比，小鼠的心，肝，脾，肺，肾的h&e染色结果中未观察到明显的组织损伤(图38)。总之，所有上述结果清楚地证明了dats@pfc&cmc具有良好的生物安全性。[0176]综上所述，我们用不同的材料对mrsa感染的糖尿病小鼠伤口进行治疗，得到以下结论：1)dats@pfc&cmc能够促进微血管生成加快糖尿病小鼠伤口的愈合，在15天后伤口闭合率为97.5％；2)dats@pfc&cmc能够有效杀死伤口的细菌，并促进巨噬细胞向m2型转化发挥抗炎作用以及上调ho-1的表达发挥抗氧化作用；3)dats@pfc&cmc在拥有良好的治疗效果的同时，还具有良好的生物安全性。[0177]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料，其特征在于，多功能水凝胶敷料是基于phmg修饰的醛基化f108(pfc)和羧甲基壳聚糖cmc之间的动态希夫碱反应制备。2.根据权利要求1所述的一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料，其特征在于：pfc的接枝率为1.4％。3.根据权利要求1所述的一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料，其特征在于：pfc的浓度为为100mg/ml。4.根据权利要求1所述的一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、首先将10g壳聚糖cs和13.5g氢氧化钠naoh加入到500ml烧瓶中，然后将含有50ml水和50ml异丙醇的混合溶液加入到烧瓶中，充分搅拌形成混合液；s2、然后将混合液放到50℃的油浴锅中溶胀并碱化1h；s3、将溶解在20ml异丙醇的15g氯乙酸在30min内均匀滴加到混合液中，剧烈搅拌，并且保持在50℃油浴下反应4h。反应结束后，通过加入200ml的70％(v/v)甲醇停止反应；s4、将所得的混合液过滤，并收集滤渣。将得到的滤渣用90％(v/v)甲醇洗涤3次。过滤后将滤渣放到50℃的真空干燥箱内真空干燥1天。收集到的固体产物羧甲基壳聚糖cmc。5.根据权利要求1所述的一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：a、将5.8g f108(0.4mmol)，0.6g 4-甲酰苯甲酸(4mmol)和30mg 4-二甲氨基吡啶dmap加入到500ml带支管梨形瓶；b、在n2保护下，加入70ml无水二氯甲烷dcm充分溶解，然后将溶解于二氯甲烷的1.01g(4.89mmol)二环己基碳二亚胺dcc在冰浴条件下逐滴加入上述反应体系中，并在室温下反应2天；c、反应结束后，抽滤除去反应中生成的固体，并且将所得到有机相通过旋转蒸发仪浓缩，再用饱和nacl洗涤三次；d、洗涤结束后，通过旋蒸仪除去所有dcm，真空干燥5h后，将所得到的白色固体分散在100ml的纯水中，剧烈搅拌2h，通过高速离心(9000r/min，10min)除去沉淀，将所得到的上清液通过冷冻干燥得到产物f108-cho(fc)。e、将得到的干燥的1g fc与10mg phmg充分溶解于dmso中，搅拌4h，反应结束后，向反应溶液中加入0.62mg氰基硼氢化钠nabh3cn，室温下继续反应12h；f、反应结束后，用广泛透析袋(spectrum，mwco 3500da)透析24h，冷冻干燥得到白色产物(phmg-f108-cho，pfc)。6.根据权利要求5所述的一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：g、将200mg f108-cho与20mg dats溶解在2ml dcm中，充分搅拌1h，然后利用旋转蒸发仪除去所有dcm以形成一层均匀的黄色薄膜；h、加入纯水水化薄膜8h；i、将步骤b中得到的混合液离心(10000rpm，10min)除去不溶的产物和较大的胶束；j、将步骤c所得的滤液经过冷冻干燥得到载药胶束dats@pfcs；k、通过调节dats/pfc的质量投料比为0.1，0.2与0.5获得dats@pfc-1，dats@pfc-2与
dats@pfc-3三种不同载药量的载药胶束。7.根据权利要求6所述的一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：将pfc与三种不同浓度cmc(2.0％w/v，2.5％w/v和3.0％w/v)按照1:1的体积比混合，混合均匀后，将混合液放置于37℃烘箱内分别制备水凝胶pfc&cmc2.0、pfc&cmc2.5和pfc&cmc3.0，接着将pfc胶束溶液更换为同等浓度的同等浓度的dats@pfc-1，dats@pfc-2与dats@pfc-3胶束溶液与制备载药水凝胶dats@pfc&cmc-1、dat s@pfc&cmc-2和dats@pfc&cmc-3。

技术总结
本发明属于生物医用高分子技术领域，特别涉及一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料及其制备方法，一种基于硫化氢气体疗法的多功能水凝胶敷料，多功能水凝胶敷料是基于PHMG修饰的醛基化F108(PFC)和羧甲基壳聚糖CMC之间的动态希夫碱反应制备。本发明的有益效果为：伤口敷料体系能够在糖尿病伤口低pH和高氧化应激的微环境下迅速降解，从而达到H2S快速释放的效果。该伤口敷料表面修饰的PHMG能够与DATS联合发挥优异的抗菌作用；而释放出来的H2S能够充分发挥其高效的抗炎，抗氧化和促细胞增殖，迁移和血管化的作用，从而改善糖尿病伤口微环境，达到加速糖尿病伤口愈合的作用。用。用。


技术研发人员：蔡晓军 陈佳乐 李林 陈冬帆
受保护的技术使用者：温州医科大学附属口腔医院
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/21