一种截短内含子、包含其的HAO1基因及应用的制作方法

一种截短内含子、包含其的hao1基因及应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，涉及一种截短内含子、包含其的hao1基因及应用。


背景技术：

2.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构、代谢系统、基因组位置和序列的差异，传统的动物模型并不能很好的反映疾病在人体的真实表型和状况，因此，在动物体内建立更接近人类生理特征的疾病模型是科学研究疾病发生发展治疗的迫切需求。
3.随着基因工程技术的不断发展和成熟，通过将人类基因替代或置换动物的同源基因的方法开发人源化动物模型的策略已经实现。尤其是基因编辑技术的快速发展，将人源基因正常或突变的基因序列替换动物基因组的同源基因序列，可以建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。在基因编辑技术应用于治疗疾病的时代，基因人源化动物模型对于临床前的药物研发是至关重要的。
4.在构建基因人源化小鼠模型中最常用的方法是将人源基因的cds编码区(coding sequence)显微注射到小鼠受精卵中，获得人源化基因小鼠。然而如前面所述，仅将cds基因注射到小鼠受精卵后，所得到的相关人源化基因并不与人类基因情况相同。但当同时需要人源基因的内含子时，由于内含子序列通常序列很长，全长基因的显微注射存在难度高，风险高，成功率低，周期长等诸多限制条件。
5.原发性高草酸尿症是一种罕见的常染色体隐性遗传的代谢疾病，由于患病个体缺乏阻止草酸盐积累的特定酶的功能水平，使得草酸盐在肾脏和身体其他器官系统中积累。目前主要的治疗手段是肝肾联合移植，但器官来源短缺和巨额医疗费用限制多数病人无法得到有效医治。目前fda批准的药物oxlumo是一种针对hao1基因的sirna药物，可通过抑制乙醛酸形成来减少草酸从而治疗疾病。由于sirna干扰药物需要重复给药，因此希望通过crispr/cas9基因编辑技术开发一种新的治疗方法，这其中不可缺少的就是动物模型的选择。鉴于人和小鼠基因的差异性，小鼠来源的动物模型将较难满足实验需求，因此迫切需要构建hao1基因人源化的原发性高草酸尿症的小鼠模型，然而hhao1基因全长58kb，构建一个hao1基因全长的人源化小鼠难度高，风险高，成功率低，而只保留cds编码区较难满足完全贴近人类基因的实际情况，对内含子进行截短又容易影响hhao1基因的正常剪接和转录表达。
6.综上所述，对人hao1(hhao1)基因的内含子进行改造，设计在完整cds编码区中含有内含子的hhao1基因，同时不影响hhao1基因的正常剪接和转录表达是目前亟需要解决的问题之一。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足和实际和需求，本发明提供一种截短内含子、包含其的hao1基因及应用，对人hao1(hhao1)基因的内含子进行改造，建立在完整cds编码区中含有一段
显著截短内含子的hhao1基因，同时不影响hhao1基因的正常剪接和转录表达，可有效应用于构建人源化模型。
8.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种截短内含子，所述内含子的核酸序列包括以下中任意一种：
10.(1)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的50-200bp序列和靠近第四外显子的50-200bp序列连接组成的序列；
11.(2)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的50-200bp序列和靠近第三外显子的50-200bp序列连接组成的序列。
12.本发明中，对人hao1基因中第二内含子和第三内含子进行巧妙设计，得到显著截短的内含子，所述内含子可以保留在hao1基因中进行高效地转染、表达，同时不影响hhao1基因的正常剪接和转录表达，解决了目前利用全长hhao1基因构建模型难度高，风险高，成功率低，只保留cds编码区无法满足完全贴近人类基因的情况，而内含子进行盲目截短又容易影响hhao1基因的正常剪接和转录表达的问题。
13.优选地，所述内含子的核酸序列包括以下中任意一种：
14.(3)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的80-120bp序列和靠近第四外显子的80-120bp序列连接组成的序列；
15.(4)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的60-100bp序列和靠近第三外显子的80-180bp序列连接组成的序列。
16.优选地，所述内含子的核酸序列包括以下中任意一种：
17.(5)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的108bp序列和靠近第四外显子的112bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.1所示。
18.(6)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的86bp序列和靠近第四外显子的114bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.2所示。
19.(7)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的70bp序列和靠近第三外显子的150bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.3所示。
20.(8)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的75bp序列和靠近第三外显子的105bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.4所示。
21.seq id no.1：
22.gtaaccatgatcatgtgggccccgagctgaggcgaaagggatcttgactgggaatgttagggtctgggttctactgatagcaacgttgctaaacatctagttaatcttgagcagtgaacagccaattgatttgaaaagggtaacatttttcattgaatgaatcattggaaacgtatttctaatttggcaaatttctcattttatgcatttcttattttag。
23.seq id no.2：
24.gtaaccatgatcatgtgggccccgagctgaggcgaaagggatcttgactgggaatgttagggtctgggttctactgatagcaacgtatgagcagtgaacagccaattgatttgaaaagggtaacatttttcattgaatgaatcattggaaacgtatttctaatttggcaaatttctcattttatgcatttcttattttag。
25.seq id no.3：
26.gtaggaggaagattgtcaccacagggacagaaggaggctaacgtttatcgacctccttctctgaatgcactatgggccagactttcttctctctttaagagatttgacttcatattgccaaattgcccttctagatgtctttac
tcatccaactacaattcaaaggtttgggagggtaagcaatgccaggcccatcttgatcatcccctttctttctcag。
27.seq id no.4：
28.gtaggaggaagattgtcaccacagggacagaaggaggctaacgtttatcgacctccttctctgaatgcaccaagctgccaaattgcccttctagatgtctttactcatccaactacaattcaaaggtttgggagggtaagcaatgccaggcccatcttgatcatcccctttctttctcag。
29.第二方面，本发明提供一种hao1基因片段，所述hao1基因片段中含有外显子和内含子，所述内含子包括第二内含子和/或第三内含子，所述第二内含子的核酸序列包括第一方面中所述的截短内含子的序列(2)，所述第三内含子的核酸序列包括第一方面中所述的截短内含子的序列(1)。
30.本发明对人hao1基因内含子进行了截短改造，获得了包含截短内含子的hao1基因，同时通过验证表明，其满足不影响hao1基因表达的要求，为后续构建人源化hao1动物模型(例如，小鼠)提供了基础，同时也为改造其他人源基因的内含子提供了借鉴。
31.优选地，所述内含子为第三内含子，所述第三内含子的核酸序列包括第一方面中所述的截短内含子的序列(5)或(6)。
32.优选地，所述内含子为第二内含子和第三内含子，所述第二内含子的核酸序列包括第一方面中所述的截短内含子的序列(7)，所述第三内含子的核酸序列包括第一方面中所述的截短内含子的序列(5)。
33.优选地，所述内含子为第二内含子和第三内含子，所述第二内含子的核酸序列包括第一方面中所述的截短内含子的序列(8)，所述第三内含子的核酸序列包括第一方面中所述的截短内含子的序列(6)。
34.第三方面，本发明提供一种载体，所述载体含有第一方面中所述的截短内含子的基因序列或第二方面所述的hao1基因片段。
35.优选地，所述基因片段可操作地连接至调节元件。
36.第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第一方面中所述的截短内含子的基因序列或第二方面所述的hao1基因片段或第三方面所述的载体。
37.第五方面，本发明提供第一方面所述的截短内含子、第二方面所述的hao1基因片段、第三方面所述的载体或第四方面所述的宿主细胞在构建人源化hao1基因非人动物模型中的应用。
38.在一个实施方案中，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化羟基酸氧化酶1。进一步优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达上述人源化羟基酸氧化酶1。
39.在一个实施方案中，所述非人动物可以选自啮齿类动物、灵长类动物。例如，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
40.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
41.(1)本发明对人类hao1基因的内含子进行改造，所述内含子可以保留在hao1基因中进行高效地转染、表达，同时不影响hhao1基因的正常剪接和转录表达，解决了目前利用全长hhao1基因构建模型难度高，风险高，成功率低，只保留cds编码区无法满足完全贴近人类基因的情况，而内含子进行盲目截短又容易影响hhao1基因的正常剪接和转录表达的问题；
42.(2)通过对比找出了表达效果较好的内含子截短位置以及截短长度。
附图说明
43.图1为hhao1截短内含子质粒制备策略示意图；
44.图2a为无内含子的hhao1cds质粒表达示意图；
45.图2b为带有第三内含子单独截短方式
①
的hhao1基因质粒表达示意图；
46.图2c为带有第三内含子单独截短方式
②
的hhao1基因质粒表达示意图；
47.图2d为带有第二、三内含子同时截短方式
①
的hhao1基因质粒表达示意图；
48.图2e为带有第二、三内含子同时截短方式
②
的hhao1基因质粒表达示意图；
49.图2f为带有第二内含子和第三内含子同时截短方式
③
且剪切供体位点被破坏的hhao1基因质粒表达示意图；
50.图3为流式分析结果图；
51.图4为intron3-220序列与intron3-219序列对比图，其中seq_1序列为intron3-220序列，seq_2序列为intron3-219序列；
52.图5为cag-hao1-egfp重组表达质粒图谱。
具体实施方式
53.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
54.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
55.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
56.术语解释：
57.可操作地连接：指目标核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如，当载体被引入宿主细胞时，在体外转录/翻译系统中或在宿主中)的方式连接到调控元件。
58.基因剪切位点：真核基因由多个外显子(编码区)和内含子(非编码区)组成，基因剪接位点是指一对外显子和内含子之间的边界，外显子-内含子边界(内含子左侧的连接点)称为“供体(donor)”，内含子-外显子边界(内含子右侧的连接点)称为“受体(accepter)”，前体mrna删除内含子，并通过选择性剪接连接外显子，使基因最终表达为蛋白质，如图1所示。
59.第n内含子：表示第n外显子与第n+1号外显子之间的内含子。例如“第1内含子”表示第1外显子与第2外显子之间的内含子。
60.具体实施中使用部分序列如下：
61.seo id no.5(intron3-219)：
62.taaccatgatcatgtgggccccgagctgaggcgaaagggatcttgactgggaatgttagggtctgggt
tctactgatagcaacgttgctaaacatctagttaatcttgagcagtgaacagccaattgatttgaaaagggtaacatttttcattgaatgaatcattggaaacgtatttctaatttggcaaatttctcattttatgcatttcttattttag。
63.seo id no.6(cag-vect-f)：ctcatgctggagttcttcgc。
64.seo id no.7(cag-vect-r)：ggtgctagcgatatctctag。
65.seo id no.8(hao1-cds-f)：gatatcgctagcaccatgcc。
66.seo id no.9(hao-cds-r)：cccttgctcaccataggtcc。
67.seo id no.10(sv40nls-linker序列片段)：
68.cgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtctggtggttctcccaagaagaagaggaaagtctaagcggccgctatatgtacaagtaactgcagcgcggggatctcatgctggagttcttc。
69.seo id no.11(c-sv40nls-f)：cggcatggacgagctgtaca。
70.seo id no.12(c-sv40nls-r)：gaactccagcatgagatccc。
71.seo id no.13(egfp-f)：tatggtgagcaagggcgagg。
72.seo id no.14(egfp-r)：agctcgtccatgccgagagt。
73.seo id no.15(intron3-f)：caggtaaccatgatcatgtggg。
74.seo id no.16(intron3-r)：gtccactgtcgtctccaaaa。
75.seo id no.17(hao1-3-vect-f)：gagacgacagtggacttgct。
76.seo id no.18(hao1-3-vect-r)：gatcatggttacctgagttgtggcggc。
77.seo id no.19(intron2-f)：ccactgtgagaggtaggaggaagattgtc。
78.seo id no.20(intron2-r)：agggactgacaggctgagaaagaaagggg。
79.seo id no.21(hao1-2-vect-f)：agcctgtcagtccctgggaa。
80.seo id no.22(hao1-2-vect-r)：tacctctcacagtggcaagctc。
81.seo id no.23(intron3-f1)：cagtaaccatgatcatgtggg。
82.seo id no.24(hao1-left-f)：gctcccccggctaatttgta。
83.seo id no.25(hao1-right-r)：agctcgaccaggatgggcac。
84.实施例1
85.本实施例进行内含子截短的设计。
86.1、利用genebank中人的hao1基因相关信息(genebank，登录号：54363)，设计的截短内含子的截短方式如下：
87.(1)所有内含子序列均被删除，保留外显子(exon1～exon8)，如图2a所示；
88.(2)第三内含子单独截短方式
①
：仅保留第三内含子靠近第三外显子(exon3)的108bp和靠近第四外显子(exon4)的112bp，故共保留220bp第三内含子序列，该段序列命名为intron3-220，序列参见seq id no.1，其他内含子序列均被删除，如图2b所示；
89.(3)第三内含子单独截短方式
②
：保留第三内含子靠近第三外显子的86bp和靠近第四外显子的114bp，故共保留200bp第三内含子序列，该段序列命名为intron3-200，序列参见seq id no.2，其他内含子序列均被删除，如图2c所示；
90.(4)第二、三内含子同时截短方式
①
：保留第二内含子靠近第二外显子的70bp和靠近第三外显子的150bp，故共保留220bp第二内含子序列，序列参见seq id no.3，命名为intron2-220；第三内含子保留intron3-220序列(seq id no.1)，其他内含子序列均被删除，如图2d所示；
91.(5)第二、三内含子同时截短方式
②
：保留第二内含子靠近第二外显子的75bp和靠近第三外显子的105bp，故共保留180bp第二内含子序列，序列参见seq id no.4，命名为intron2-180；第三内含子保留intron3-200序列(seq id no.2)，其他内含子序列均被删除，如图2e所示；
92.(6)第二、三内含子同时截短方式
③
：保留第二内含子intron2-180序列；保留第三内含子靠近第三外显子的107bp和靠近第四外显子的112bp(故共保留219bp第三内含子，该内含子破坏了剪切位点，具体是将第三内含子序列靠近第三外显子序列的碱基“g”去掉，可参见intron3-220序列去掉5’端一个碱基“g”，序列对比如图4所示)，序列参见seq id no.5，命名为intron3-219，其他内含子序列均被删除，如图2e所示。intron3-219序列和intron3-220序列的对比可参见图4。
93.上述第(2)-(5)种内含子截短方式，截短后后的内含子均保留剪切位点，第(6)种内含子截短方式将剪切位点破坏作为阴性对照。
94.2、设计两种对照实验(验证截短内含子可行性)
95.(1)阳性对照：egfp-c1质粒(novopro，#v012024)作为流式分析阳性对照。
96.(2)阴性对照：将第二、三内含子同时截短方式
③
作为对照处理方式，同时未加处理的细胞作为流式分析阴性对照。
97.实施例2
98.本实施例进行人hao1基因表达质粒构建。
99.hao1截短内含子质粒制备策略示意图如图1所示，对重组表达质粒的人hao1基因的第二内含子和/或第三内含子进行了截短，并将截短处理后的质粒转染至293t细胞，后续对其细胞内的表达进行检测，人hao1基因表达质粒采用的启动子为cag启动子，并在hao1基因片段两端分别连接sv40nls序列，并通过p2a自剪切多肽连接egfp基因。
100.构建过程如下：
101.1、将带有cag启动子的pcag-spcas9-n57质粒(addgene，#169920)作为构建基本载体，利用引物cag-vect-f(seq id no.6)和cag-vect-r(seq id no.7)，将上述pcag-spcas9-n57质粒作为模板进行pcr反应，得到带有cag启动子的载体片段。
102.根据hao1cds序列信息设计引物hao1-cds-f(seq id no.8)、hao-cds-r(seq id no.9)，利用上述引物，以带有人hao1基因cds序列片段的质粒(由北京擎科生物科技有限公司合成)作为模板进行pcr反应，得到hao1cds序列片段；将合成的sv40nls-linker序列片段(seq id no.10，由北京擎科生物科技有限公司合成)作为模板，利用c-sv40nls-f(seq id no.11)，c-sv40nls-r(seq id no.12)作为引物进行pcr反应，得到egfpc端sv40-nls序列片段；将pegfp-c1质粒(novopro，#v012024)作为模板，同时利用引物egfp-f(seq id no.13)和egfp-r(seq id no.14)进行pcr，得到egfp序列片段。将上述四个序列片段通过非连接酶依赖型的多片段一步克隆技术进行同源重组，所用试剂盒为多片段同源重组试剂盒(诺维赞，#c113-01)，得到cag-hao1-egfp重组表达质粒(pcag-hao1-cds-egfp)，重组质粒图谱参见图5。
103.2、根据实施例1所设计的不同截短方式的hao1内含子序列，通过同源重组方式将各个hao1内含子序列克隆到cag-hao1-egfp重组表达质粒上，得到hhao1基因表达质粒。
104.其中，具体操作如下：
105.(1)第三内含子单独截短方式
①
的hhao1基因(人hao1基因)表达质粒1构建过程如下：
106.合成含有intron3-220序列的质粒(由北京擎科生物科技有限公司合成)并将其作为pcr模板，利用intron3-f(seq id no.15)和intron3-r(seq id no.16)进行pcr，得到pcr产物intron3-220片段；将步骤1中得到的cag-hao1-egfp重组表达质粒作为模板，利用引物hao1-3-vect-f(seq id no.17)和hao1-3-vect-r(seq id no.18)扩增得到cag-hao1-egfp片段1，将intron3-220和cag-hao1-egfp片段通过非连接酶依赖型的多片段一步克隆技术进行组装，所用试剂盒为多片段同源重组试剂盒(诺维赞，#c113-01)，得到第三内含子单独截短方式
①
的hhao1基因表达质粒1。
107.(2)第三内含子单独截短方式
②
的hhao1基因表达质粒2构建过程如下：
108.合成含有intron3-200序列的质粒(由北京擎科生物科技有限公司合成)并将其作为pcr模板，利用intron3-f(seq id no.15)和intron3-r(seq id no.16)进行pcr，得到pcr产物intron3-200片段；将步骤1中得到的cag-hao1-egfp重组表达质粒作为模板，利用引物hao1-3-vect-f(seq id no.17)和hao1-3-vect-r(seq id no.18)得到cag-hao1-egfp片段1，将intron3-200片段和cag-hao1-egfp片段通过非连接酶依赖型的多片段一步克隆技术进行组装，所用试剂盒为多片段同源重组试剂盒(诺维赞，#c113-01)，得到第三内含子单独截短方式
②
的hhao1基因表达质粒2。
109.(3)第二、三内含子同时截短方式
①
的hhao1基因表达质粒构建过程如下：
110.分别合成含有intron2-220序列的质粒、含有intron3-220序列的质粒(均由北京擎科生物科技有限公司合成)。以含有intron2-220内含子序列的质粒为pcr模板，利用引物intron2-f(seq id no.19)和intron2-r(seq id no.20)进行pcr，扩增得到intron2-220片段。将步骤1中得到的cag-hao1-egfp重组表达质粒作为模板，利用引物hao1-2-vect-f(seq idno.21)和hao1-3-vect-r(seq id no.18)进行pcr，得到cag-hao1-egfp片段2。将步骤1中得到的cag-hao1-egfp重组表达质粒作为模板，利用引物hao1-3-vect-f(seq idno.17)和hao1-2-vect-r(seq id no.22)进行pcr，得到cag-hao1-egfp片段3，通过非连接酶依赖型的多片段一步克隆技术将intron2-220片段、intron3-220片段、cag-hao1-egfp片段2、cag-hao1-egfp片段3同源重组得到hhao1基因表达质粒3。
111.(4)第二、三内含子同时截短方式
②
的人hao1基因表达质粒构建过程如下：
112.分别合成含有intron2-180序列、intron3-200序列的质粒(均由北京擎科生物科技有限公司合成)。以含有intron2-180序列的质粒作为pcr模板，利用引物intron2-f(seq id no.19)和intron2-r(seq id no.20)进行pcr扩增，得到intron2-180片段。以含有intron3-200序列的质粒作为pcr模板，利用引物intron3-f(seq id no.15)和intron3-r(seq id no.16)进行pcr扩增，得到intron3-200片段。将步骤1中得到的cag-hao1-egfp重组表达质粒作为模板，利用引物hao1-2-vect-f(seq id no.21)和hao1-3-vect-r(seq id no.18)进行pcr，扩增得到cag-hao1-egfp片段2；利用引物hao1-3-vect-f(seq id no.17)和hao1-2-vect-r(seq id no.22)得到cag-hao1-egfp片段3，通过同源重组方式将intron2-180片段、intron3-200片段、cag-hao1-egfp片段2、cag-hao1-egfp片段3进行同源重组，所用试剂盒为多片段同源重组试剂盒(诺维赞，#c113-01)，得到第二、三内含子同时截短方式
②
的人hao1基因表达质粒4。
113.(5)第二、三内含子同时截短方式
③
且剪切供体被破坏的人hao1基因表达质粒构建过程如下：
114.分别合成含有intron2-180序列、intron3-200序列的质粒(均由北京擎科生物科技有限公司合成)。以含有intron2-180序列的质粒作为pcr模板，利用引物intron2-f(seq id no.19)和intron2-r(seq id no.20)进行pcr，扩增得到intron2-180片段。为破坏剪切供体，发明人根据intron3-200序列设计引物intron3-f1(seq id no.23)，以含有intron3-200序列的质粒作为模板，利用引物intron3-f1(seq id no.23)和intron3-r(seq id no.16)进行pcr，扩增得到intron3-219片段。将步骤1中得到的cag-hao1-egfp重组表达质粒作为模板，利用引物hao1-2-vect-f(seq id no.21)和hao1-3-vect-r(seq id no.18)进行pcr，扩增得到cag-hao1-egfp片段2；利用引物hao1-3-vect-f(seq id no.17)和hao1-2-vect-r(seq id no.22)得到cag-hao1-egfp片段3，通过同源重组方式将intron2-180片段、intron3-219片段、cag-hao1-egfp片段2、cag-hao1-egfp片段3进行同源重组，所用试剂盒为多片段同源重组试剂盒(诺维赞，#c113-01)，得到第二内含子和第三内含子同时被截短且剪切供体被破坏的人hao1基因表达质粒5。
115.实施例3
116.本实施例进行细胞转染验证。
117.为验证截短内含子对hao1基因表达的影响，本实施中将实施例2中所得到的5种重组质粒以及对照组egfp-c1质粒(novopro，#v012024)进行细胞转染。
118.1、准备转染细胞
119.所用细胞为293t细胞(购自atcc)，提前24小时进行24孔板铺板，每孔铺板为18万细胞。采用培养基为dmem完全培养基，37℃、5％co2培养箱中培养，至细胞汇合度达到70％-80％左右时进行转染。
120.2、制备转染液
121.采用转染液为聚乙烯亚胺pei转染试剂，配制用于转染的a液和b液，其中，
122.a液：将1μg质粒溶于50μlopti-mem减血清培养基，得到a液；
123.b液：将4μlpei转染试剂(1μg/μl)溶于50μlopti-mem减血清培养基中，得到b液。
124.将a、b液分别轻轻混匀，静置5min后，将b液吸取至a液中，然后轻轻混匀，25℃静置25min，得到转染液c液。将293t细胞吸去dmem完全培养基，更换optim-mem培养基(gibco，#31985070)。将转染液c液加到24孔板对应孔细胞中，6h后，更换为有血清的dmem完全培养基，继续培养60h。
125.本实施例共设置了7个实验组，具体如表1所示。
126.表1
127.128.3、分析含有截短内含子的hhao1基因及对照组的基因表达
129.293t细胞转染90h后，通过流式分析egfp基因的表达情况确定hao1基因的表达情况。
130.吸去dmem完全培养基后，使用pbs溶液洗一遍细胞，37℃条件下，利用胰酶进行消化，加入dmem完全培养基终止消化，将细胞平均分成两份，500g离心5min，其中一份作为流式分析组，吸去上清后加入400μlpbs进行流式分析，另外一份未处理组备用。
131.根据未处理流式分析阴性对照节前向角散射光(forward scatter，fsc)和侧向角散射光(side scatter，ssc)，并对egfp阴性细胞群体圈门，根据流式分析阳性对照调节fitc电压。若egfp能够正常表达，说明待检测质粒所带有的hao1基因可以正常表达。
132.分析结果参见图3，其中：
133.横坐标的nc为第二内含子和第三内含子同时截短方式3且破坏第三内含子剪切供体位点的hao1基因表达质粒转染组，pc为egfp-c1质粒转染流式分析阴性对照组，1为无内含子的hao1cds质粒表达，2为带有第二、三内含子同时截短方式
①
的hao1基因质粒转染组，3为带有第二、三内含子同时截短方式
②
的hao1基因质粒转染组，4为带有第三内含子单独截短方式
①
的hao1基因质粒转染组，5为带有第三内含子单独截短方式
②
的hao1基因质粒转染组。从图3可以看出在保留剪切位点的前提下带有不同截短方式和截短长度截短内含子的hao1基因均能够正常表达hhao1基因。第三内含子单独截短方式
①
、
②
所对应的实验组4、5的egfp的表达量接近于无内含子的实验组1的egfp阳性率，第二、三内含子同时截短方式
①
、
②
所对应的实验组2、3的egfp的阳性率也接近10％。
134.实施例4
135.本实施例通过rt-pcr分析含有截短内含子的hao1基因的剪切情况。
136.1、将实施例3中保留备用的未处理组细胞离心后去掉上清，然后加入500μltrizol抽提rna，然后加入100μl氯仿，用手剧烈振荡15s，25℃条件下静置3min；
137.2、4℃条件下，12000rpm离心15min，使水和有机相分离，可以观察到离心管中液体分为三层，其中，rna在上层水相中，将管子倾斜45度，吸取上层无色水相到新的预冷的ep管中，注意不要吸到中间层和下层有机相；
138.3、加入250μl(500μl/1mltrizol)异丙醇，混匀；
139.4、在4℃条件下，对步骤3得到的混合物进行12000rpm离心10min，使沉淀凝聚沉底；离心后将上清液倒掉，保留rna沉淀；加入1ml rnase-free的75％乙醇洗涤沉淀；4℃条件下，8000rpm，离心5min，去掉上清液，瞬离后吸干净液体；晾干后得到rna沉淀，加入20μl rnase-free水重悬溶解rna，测浓度，od260为单峰，od260/od280在1.8-2.0之间；
140.5、取步骤4中得到的rna，使用反转录试剂盒primescripttm rt master mix(perfect real time)(takara公司，#rr036a)，将rna反转录成cdna，按照表2中的反应体系进行反转录，反应条件如下：37℃，15min，85℃，5sec。4℃条件下保存。
141.表2
142.组分用量rna500ng5
×
primescript rt master mix2μlh2o补齐至10μl
143.反转录结束后，将得到的cdna产物按照1:10体积用ddh2o稀释后，将其作为模板进行rt-pcr。按照以下反应条件及表2中的反应体系进行rt-pcr，具体所用引物如下所示：
144.上游引物hao1-left-f：gctcccccggctaatttgta(seq id no.24)；
145.下游引物hao1-right-r：agctcgaccaggatgggcac(seq id no.25)。
146.反应体系如下：
147.上游引物hao1-left-f：1μl，下游引物hao1-right-r：1μl，cdna：1μl，2
×
santaq fast pcr master mix(上海生工，#b532062-0001)：25μl，h2o：22μl。
148.反应程序如下：
149.94℃、5min，94℃、10sec，60℃、20sec，72℃、90sec，72℃、5min，35个循环。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，并确认条带正常后送测，采用sanger测序对带有截短内含子的hao1基因剪切情况进行验证，测序结果显示各个带有截短内含子(包括第二、三内含子同时截短方式
①
、第二、三内含子同时截短方式
②
、第三内含子单独截短方式
①
、第三内含子单独截短方式
②
)的hao1基因能够正常剪切，其表达阅读框没有改变，这说明本发明所采用的不同截短内含子策略有效，包含内含子的hao1基因剪切方式没有改变，hao1基因仍然能够正常表达。
150.综上所述，本发明对人类hao1基因的内含子进行改造，获得显著截短的内含子，以及包含其的人类hao1基因，能够同时满足不影响hhao1基因的正常剪接和转录表达的需求，对于构建更贴近人类基因的情况的人源化动物模型具有重要意义。
151.通过对内含子不同的截短位置和截短长度的对比，申请人发现对于第三内含子单独截短方式
①
的hhao1基因，选择hhao1基因中第三内含子靠近第三外显子的80-120bp(更优选108bp)的序列和靠近第四外显子的80-120bp(更优选地，112bp)序列连接组成的序列；对于第三内含子单独截短方式
②
的hhao1基因，选择hhao1基因中第三内含子靠近第三外显子的80-120bp(更优选86bp)序列，选择靠近第四外显子的80-120bp(更优选114bp)序列连接组成的序列；对于第二、三内含子同时截短方式
①
的hhao1基因，选择hhao1基因中第二内含子靠近第二外显子的60-100bp(更优选70bp)序列和靠近第三外显子的100-180bp(更优选150bp)序列连接组成的序列；对于第二、三内含子同时截短方式
②
的人hao1基因，选择hhao1基因中第二内含子靠近第二外显子的60-100bp(更优选75bp)序列和靠近第三外显子的80-120bp(更优选105bp)序列连接组成的序列的表达效果相对于其他截短方式更好，且内含子的长度相对较短。
152.本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种截短内含子，其特征在于，所述内含子的核酸序列包括以下中任意一种：(1)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的50-200bp序列和靠近第四外显子的50-200bp序列连接组成的序列；(2)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的50-200bp序列和靠近第三外显子的50-200bp序列连接组成的序列。2.根据权利要求1所述的截短内含子，其特征在于，所述内含子的核酸序列包括以下中任意一种：(3)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的80-120bp序列和靠近第四外显子的80-120bp序列连接组成的序列；(4)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的60-100bp序列和靠近第三外显子的80-180bp序列连接组成的序列。3.根据权利要求1或2所述的截短内含子，其特征在于，所述内含子的核酸序列包括以下中任意一种：(5)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的108bp序列和靠近第四外显子的112bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.1所示；(6)人hao1基因中第三内含子靠近第三外显子的86bp序列和靠近第四外显子的114bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.2所示；(7)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的70bp序列和靠近第三外显子的150bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.3所示；(8)人hao1基因中第二内含子靠近第二外显子的75bp序列和靠近第三外显子的105bp序列连接组成的序列，序列如seq id no.4所示。4.一种hao1基因片段，其特征在于，所述hao1基因片段中含有外显子和内含子；所述内含子包括第二内含子和/或第三内含子；所述第二内含子的核酸序列包括权利要求1中所述的截短内含子的序列(2)；所述第三内含子的核酸序列包括权利要求1中所述的截短内含子的序列(1)。5.根据权利要求4所述的hao1基因片段，其特征在于，所述内含子为第三内含子，所述第三内含子的核酸序列包括权利要求3中所述的截短内含子的序列(5)或(6)。6.根据权利要求4所述的hao1基因片段，其特征在于，所述内含子为第二内含子和第三内含子，所述第二内含子的核酸序列包括权利要求3中所述的截短内含子的序列(7)，所述第三内含子的核酸序列包括权利要求3中所述的截短内含子的序列(5)。7.根据权利要求4所述的hao1基因片段，其特征在于，所述内含子为第二内含子和第三内含子，所述第二内含子的核酸序列包括权利要求3中所述的截短内含子的序列(8)，所述第三内含子的核酸序列包括权利要求3中所述的截短内含子的序列(6)。8.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1-3任一项中所述的截短内含子的基因序列，或权利要求4-7任一项所述的hao1基因片段；优选地，所述基因片段可操作地连接至调节元件。9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1-3任一项中所述的截短内含子的基因序列，或权利要求4-7任一项所述的hao1基因片段，或权利要求8所述的载体。10.如权利要求1-3任一项中所述的截短内含子、权利要求4-7任一项所述的hao1基因
片段、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞在构建人源化hao1基因非人动物模型中的应用。

技术总结
本发明公开了一种截短内含子、包含其的HAO1基因及应用。本发明对人HAO1基因内含子进行了截短改造，获得了包含上述截短内含子的HAO1基因，同时通过验证表明，其满足不影响HAO1基因表达的要求，为后续构建人源化HAO1动物模型提供了基础，同时也为改造其他人源基因的内含子提供了借鉴。的内含子提供了借鉴。的内含子提供了借鉴。


技术研发人员：张昊堃
受保护的技术使用者：尧唐（上海）生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.17
技术公布日：2023/8/21