一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法与流程

1.本发明属于医疗技术领域，具体为一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法。


背景技术：

2.随着人们年龄增长，皮肤中原有的纤维原细胞陷入休眠或是死亡，于是皮肤开始变差，而通过实验中表明，纤维原细胞可以使皮肤光滑、紧密、更有弹性、更显年轻，8岁以下男童包皮，分离表皮和真皮提取纤维原细胞进行培养，而这种纤维原细胞负责生成胶原质，进而修复皮肤、去除皱纹。而现有技术中，在通过人源性包皮提取纤维原细胞时，容易对纤维原细胞造成损坏，且提取困难，因此提出一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法。


技术实现要素：

3.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，有效的解决了目前在通过人源性包皮提取纤维原细胞时，容易对纤维原细胞造成损坏，且提取困难的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，包括以下操作方法：
5.一、分离表皮和真皮：
6.①
在无菌条件下取新生儿包皮，用生理盐水洗净皮片上的血迹；
7.②
将皮片放入盛有0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液的三角瓶中，密封后存放于4℃冰箱中18h；
8.③
转移皮片至培养皿中，小心分离表皮层并弃之；
9.④
用dmem清洗真皮片，备用；
10.二、制备细胞悬液：
11.①
充分剪碎真皮片，加入胶原酶溶液，于37℃孵育1h；
12.②
用吸管反复吹打组织块，分散细胞；
13.③
经100目筛网过滤消化液，收集滤过的细胞悬液；
14.④
离心细胞悬液(800r/min，5min)，弃上清液；
15.⑤
用dmem培养液将沉淀的细胞团制成细胞悬液；
16.⑥
细胞计数，调整细胞密度；
17.三、有血清培养：原代细胞和传代后的1—3代细胞用10％胎牛血清的dmem培养液维持培养；
18.①
以5
×
10-5个/ml的密度将细胞接种于培养瓶中，于37℃、5％co2培养箱内培养。每2—3d换液一次；
19.②
原代培养至成纤维细胞汇合成单层后，按常规方法传代；
20.四、无血清培养：用dmf培养液支持已建立细胞系的包皮成纤维细胞的生长和增长；
21.①
取在含血清条件下已生长汇合成片的培养物，弃培养液。用pbs清洗3次，尽量除去残留血清；
22.②
用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液消化分散细胞，在镜下观察到细胞变圆后，加入大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化；
23.③
加入dmf培养液，用吸管吹打分散细胞。调整细胞密度；
24.④
取已包被人纤维连接蛋白的35mm培养皿，每皿接种5
×
104个细胞。于37℃、5％co2的培养箱内培养，每2—3d换液一次；
25.⑤
细胞长满基质表面后，按常规方法传代；培养12d得到纤维原细胞。
26.优选的，所述生理盐水加入不含ca2+和mg2+的1
×
pbs，并添加200000iu/l青霉素和200mg/l链霉素，且生理盐水的ph为7.2。
27.优选的，所述0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液：两者比例为1：1，并采用d-hanks液配制。
28.优选的，所述dmem培养液采用dmem培养基，加10％胎牛血清、青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml配置而成。
29.优选的，所述大豆胰蛋白酶抑制剂采用述dmem培养液配制而成。
30.优选的，所述dmf培养液为无血清化学限定性培养液，由基础培养基为1：1的dmem和hamf12混合培养基，再加入egf100ng/ml、胰岛素100ng/ml、转帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、氢化可的松5
×
10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素，同时添加青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml配制而成。
31.本发明的技术效果和优点：
32.1、本发明在通过人源性包皮提取纤维原细胞时，制剂安全，便于提取纤维原细胞，且能够对提取的纤维原细胞进行有效培养，便于人们使用。
具体实施方式
33.本发明提供了一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，包括以下操作方法：
34.一、分离表皮和真皮：
35.①
在无菌条件下取新生儿包皮，用生理盐水洗净皮片上的血迹；
36.②
将皮片放入盛有0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液的三角瓶中，密封后存放于4℃冰箱中18h；
37.③
转移皮片至培养皿中，小心分离表皮层并弃之；
38.④
用dmem清洗真皮片，备用；
39.二、制备细胞悬液：
40.①
充分剪碎真皮片，加入胶原酶溶液，于37℃孵育1h；
41.②
用吸管反复吹打组织块，分散细胞；
42.③
经100目筛网过滤消化液，收集滤过的细胞悬液；
43.④
离心细胞悬液(800r/min，5min)，弃上清液；
44.⑤
用dmem培养液将沉淀的细胞团制成细胞悬液；
45.⑥
细胞计数，调整细胞密度；
46.三、有血清培养：原代细胞和传代后的1—3代细胞用10％胎牛血清的dmem培养液维持培养；
47.①
以5
×
10-5个/ml的密度将细胞接种于培养瓶中，于37℃、5％co2培养箱内培养。每2d换液一次；
48.②
原代培养至成纤维细胞汇合成单层后，按常规方法传代；
49.四、无血清培养：用dmf培养液支持已建立细胞系的包皮成纤维细胞的生长和增长；
50.①
取在含血清条件下已生长汇合成片的培养物，弃培养液。用pbs清洗3次，尽量除去残留血清；
51.②
用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液消化分散细胞，在镜下观察到细胞变圆后，加入大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化；
52.③
加入dmf培养液，用吸管吹打分散细胞。调整细胞密度；
53.④
取已包被人纤维连接蛋白的35mm培养皿，每皿接种5
×
104个细胞。于37℃、5％co2的培养箱内培养，每2—3d换液一次；
54.⑤
细胞长满基质表面后，按常规方法传代；培养12d得到纤维原细胞。
55.同时，所述生理盐水加入不含ca2+和mg2+的1
×
pbs，并添加200000iu/l青霉素和200mg/l链霉素，且生理盐水的ph为7.2。
56.并且，所述0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液：两者比例为1：1，并采用d-hanks液配制。
57.另外，所述dmem培养液采用dmem培养基，加10％胎牛血清、青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml配置而成。
58.还有，所述大豆胰蛋白酶抑制剂采用述dmem培养液配制而成。
59.还需要说明的是，所述dmf培养液为无血清化学限定性培养液，由基础培养基为1：1的dmem和hamf12混合培养基，再加入egf100ng/ml、胰岛素100ng/ml、转帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、氢化可的松5
×
10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素，同时添加青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml配制而成。
60.本发明工作原理：本发明在通过人源性包皮提取纤维原细胞时，制剂安全，便于提取纤维原细胞，且能够对提取的纤维原细胞进行有效培养，便于人们使用。
61.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
62.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，其特征在于：包括以下操作方法：一、分离表皮和真皮：
①
在无菌条件下取新生儿包皮，用生理盐水洗净皮片上的血迹；
②
将皮片放入盛有0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液的三角瓶中，密封后存放于4℃冰箱中18h；
③
转移皮片至培养皿中，小心分离表皮层并弃之；
④
用dmem清洗真皮片，备用；二、制备细胞悬液：
①
充分剪碎真皮片，加入胶原酶溶液，于37℃孵育1h；
②
用吸管反复吹打组织块，分散细胞；
③
经100目筛网过滤消化液，收集滤过的细胞悬液；
④
离心细胞悬液(800r/min，5min)，弃上清液；
⑤
用dmem培养液将沉淀的细胞团制成细胞悬液；
⑥
细胞计数，调整细胞密度；三、有血清培养：原代细胞和传代后的1—3代细胞用10％胎牛血清的dmem培养液维持培养；
①
以5
×
10-5个/ml的密度将细胞接种于培养瓶中，于37℃、5％co2培养箱内培养。每2—3d换液一次；
②
原代培养至成纤维细胞汇合成单层后，按常规方法传代；四、无血清培养：用dmf培养液支持已建立细胞系的包皮成纤维细胞的生长和增长；
①
取在含血清条件下已生长汇合成片的培养物，弃培养液。用pbs清洗3次，尽量除去残留血清；
②
用0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液消化分散细胞，在镜下观察到细胞变圆后，加入大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化；
③
加入dmf培养液，用吸管吹打分散细胞。调整细胞密度；
④
取已包被人纤维连接蛋白的35mm培养皿，每皿接种5
×
104个细胞。于37℃、5％co2的培养箱内培养，每2—3d换液一次；
⑤
细胞长满基质表面后，按常规方法传代；培养12d得到纤维原细胞。2.根据权利要求1所述的一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，其特征在于：所述生理盐水加入不含ca2+和mg2+的1
×
pbs，并添加200000iu/l青霉素和200mg/l链霉素，且生理盐水的ph为7.2。3.根据权利要求2所述的一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，其特征在于：所述0.25％胰蛋白酶-0.02％edta溶液：两者比例为1：1，并采用d-hanks液配制。4.根据权利要求3所述的一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，其特征在于：所述dmem培养液采用dmem培养基，加10％胎牛血清、青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml配置而成。5.根据权利要求4所述的一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，
其特征在于：所述大豆胰蛋白酶抑制剂采用述dmem培养液配制而成。6.根据权利要求5所述的一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，其特征在于：所述dmf培养液为无血清化学限定性培养液，由基础培养基为1：1的dmem和hamf12混合培养基，再加入egf100ng/ml、胰岛素100ng/ml、转帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、氢化可的松5
×
10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素，同时添加青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml配制而成。

技术总结
本发明公开了一种用于皮肤抗衰的人源性包皮纤维原细胞提取培养方法，涉及到医疗领域，包括以下操作方法：一、分离表皮和真皮：


技术研发人员：何文丽
受保护的技术使用者：华悦汇（上海）健康科技有限公司
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/21