一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物、探针及制备方法和应用

1.本发明属于化工技术领域，具体涉及一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物、探针及制备方法和应用。


背景技术：

2.氨基酸是构成蛋白质的基本物质，是生物体内不可缺少的营养成分。现已被人们所发现的天然氨基酸大概300多种，而组成生物体蛋白质的常见氨基酸有20种，氨基酸由于所带侧链上基团的酸碱性不同可分为酸性、中性和碱性氨基酸，其中，碱性氨基酸是具有两个氨基和一个羧基的氨基酸，其特点是侧链常含有可质子化的碱性化学基团，分别是胍基、氨基、咪唑基。碱性氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸，精氨酸(arg)作为一种人体半必需基酸，在许多化学和生物应用中起着至关重要的作用，例如分子转运体、光催化剂、超分子纳米纤维、纳米结构、蛋白质类生物药物，以及直接形成no、尿素、鸟氨酸。另外，精氨酸对人脑化学具有显著影响，还参与血管扩张、免疫反应和神经传递的重要生命活动。
3.赖氨酸(lys)是人体必需氨基酸，密切参与鸟氨酸循环和多胺合成，在哺乳动物肝脏中通过糖精途径进行分解代谢，在血浆和尿液中高水平的赖氨酸表明先天性代谢紊乱，如胱氨酸尿或高赖氨酸血症。此外，赖氨酸不能在人体内合成，只能从外界摄取，因此，通常提出赖氨酸含量作为评价食物营养价值的评价标准，因此赖氨酸的检测具有积极的营养信号。
4.组氨酸(his)作为婴儿的必需氨基酸，不仅可以作为人类肌肉和神经系统的神经递质或神经调节剂，而且由于其独特的咪唑基团，还可以协助金属元素的转移。医学研究表明，组氨酸的持续缺乏可导致慢性肾病、类风湿性关节炎和其他功能障碍，而异常升高的浓度可与哮喘和肝硬化相关。此外，组氨酸可作为肾细胞癌的肿瘤标志物，用于监测肾细胞癌。
5.在目前的检测技术中，通常是只能同时检测三种碱性氨基酸，而不能区分它们，而每一种碱性氨基酸具有不同的重要性，如何准确识别区分这三种碱性氨基酸具有更加深刻的意义。另外，氨基酸是常常在水相中发挥作用，而目前许多检测方法都是在有机相中，在水相中识别氨基酸是目前的难点之一。因此，实现在水相中识别和区分碱性氨基酸的检测技术亟需开发。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物、探针及制备方法和应用。
7.为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
8.一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，包括如下步骤：
9.s1：称取联萘酚和氢化钠分别溶于适量超干四氢呋喃中，在合适温度条件下，将两
个溶液混合均匀，后恢复至室温反应；一定时间后，将反应体系降温至合适温度，再逐滴加入溴甲基甲醚，随后恢复至室温反应过夜；在冰水浴条件下加入超纯水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到淡黄色固体产物，重结晶溶剂提纯得到白色中间体化合物2；
10.s2：称取化合物2溶于适量超干四氢呋喃中，在合适温度条件下，逐滴加入正丁基锂，反应体系由无色变为棕色，恢复至室温反应；一定时间后，将反应体系降温至合适温度，再逐渐加入超干n-n二甲基甲酰胺，反应体系变为浑浊的淡蓝色，恢复至室温反应；一定时间后，在冰水浴条件下加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发得到黄色固体产物，柱层析提纯，真空干燥得到化合物3；
11.s3：将化合物3溶于适量二氯甲烷和无水乙醇混合溶剂中，逐滴加入浓盐酸；一定时间后，加入碳酸氢钠淬灭反应，再用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发得到黄色固体化合物4；
12.s4：称量化合物4溶于适量二氯甲烷和无水甲醇混合溶剂中，滴加适量三乙胺，在合适温度条件下反应一定时间，后将恢复至室温，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发得到黄色固体产物，柱层析提纯，真空干燥得到目标化合物。
13.进一步地，如上所述的一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，所述步骤s1中，所述合适温度为-5～5℃；所述一定时间为1.5～2.5h；所述重结晶溶剂为甲醇，温度设为70～90℃；
14.所述步骤s2中，所述合适温度为-5～5℃；
15.在反应体系由无色变为棕色并恢复室温反应，反应时间为0.5h～1.5h；
16.在反应体系变为浑浊的淡蓝色并恢复至室温反应，反应时间为2.5～3.5h；
17.所述柱层析提纯的洗脱相体积比为石油醚：乙酸乙酯＝10：1；
18.所述(r)-3：正丁基锂：n-n二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2.5：2.5。
19.进一步地，如上所述的一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，所述步骤s3中，所述一定时间为过夜；
20.所述二氯甲烷：无水甲醇的体积比为1：1。
21.进一步地，如上所述的一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，所述步骤s4中：
22.所述合适温度为60～80℃；
23.所述一定时间为8～12h；
24.所述柱层析提纯的洗脱相体积比为石油醚：乙酸乙酯＝5：1；
25.所述化合物4：盐酸羟胺：三乙胺的摩尔比为1：4：8。
26.进一步地，如上所述的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，所述联萘酚为(r)-binol；所述联萘酚：氢化钠：溴甲基甲醚的摩尔比为1：6：3。
27.如上所述的制备方法制备得到的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物。
28.一种水相中识别并区分碱性氨基酸的荧光探针，包括如上所述的化合物。
29.一种利用如上所述的化合物在水相中识别并区分碱性氨基酸的应用。
30.如上所述的应用，包括：
31.制备探针溶液：将所述化合物溶于适量色谱级四氢呋喃中得到所述探针溶液；
32.将醋酸锌和氨基酸分别溶于超纯水中，分别制备得到3eq醋酸锌溶液和0.5-10eq氨基酸溶液；
33.在离心管中依次加入氨基酸溶液、醋酸锌溶液、探针溶液，再加入超纯水稀释；反应20min后进行荧光测试，其中荧光测试参数为：激发光狭缝为5nm，发射光狭缝为5nm，激发光波长为390nm；
34.通过荧光测试结果以及比色溶液效果来识别并区分碱性氨基酸。
35.如上所述的应用，包括：
36.制备探针溶液：将所述化合物溶于适量四氢呋喃中得到所述探针溶液；
37.将10eq氨基酸和3eq醋酸锌溶液加入洁净的反应离心管中；
38.将探针溶液加入到离心管中，在室温反应5min；
39.通过观察反应溶液在365nm紫外灯下的颜色来识别并区分碱性氨基酸。
40.本发明的有益效果是：
41.本发明提供的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物、探针及制备方法和应用，该制备方法合成简便，价格低廉、反应条件适中，识别灵敏度高、后处理便捷、对环境十分友好。该化合物制备的荧光探针、利用氢键反应原理，检测方法响应时间短、选择性好、可视化程度高，满足了快速检测碱性氨基酸的需求，在许多领域都具有重要的应用价值。
42.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
43.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
44.图1为本发明实施例1化合物合成路线；
45.图2为本发明的化合物与不同浓度的精氨酸作用的荧光光谱图；
46.图3为540nm处体系荧光强度与精氨酸浓度关系曲线；
47.图4为本发明的化合物与不同浓度的赖氨酸作用的荧光光谱图；
48.图5为540nm处体系荧光强度与赖氨酸浓度关系曲线；
49.图6为本发明的化合物与10eq精氨酸和10eq赖氨酸作用的荧光光谱图；
50.图7为540nm处本发明的化合物与20种氨基酸(10eq)作用的荧光强度图；
51.图8为本发明的化合物与20种氨基酸(10eq)作用的荧光光谱图；
52.图9为365nm紫外光下探针与三种碱性氨基酸反应检测溶液的颜色图；
53.图10为三种碱性氨基酸的化学结构式；
54.图11为本发明的化合物与3种碱性氨基酸的反应机理图；
55.图12为(r)-1的核磁氢谱图；
56.图13为(r)-2的核磁氢谱图；
57.图14、15为(r)-3的核磁氢谱图和核磁碳谱图；
58.图16、17为(r)-4的核磁氢谱图和核磁碳谱图；
59.图18为本发明的化合物(r)-4的质谱数据图。
具体实施方式
60.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
61.实施例1
62.本实施例提供一种识别精氨酸或者赖氨酸的化合物的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
63.s1、称取(r)-binol(18mmol，5g)和氢化钠(108mmol，4.3g)分别溶于30ml超干四氢呋喃中，在0℃条件下，将两个溶液混合，完成后恢复至室温反应。2h后，将反应体系降温至0℃，再逐滴加入溴甲基甲醚(54mmol，4.4ml)，随后恢复至室温反应过夜。在冰水浴条件下加入超纯水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到淡黄色固体粗产物，甲醇提纯，温度设置为80℃，真空干燥得到白色固体(r)-1。
[0064][0065]
s2、称取(r)-1(10.68mmol，4g)溶于45ml超干四氢呋喃中，在0℃条件下，逐滴加入正丁基锂(26.7mmol，16.6ml)，反应体系由无色变为棕色，恢复至室温反应。1h后，将反应体系降温至0℃，再逐渐加入超干n-n二甲基甲酰胺(25.64mmol，2ml)，体系变为浑浊的淡蓝色，恢复至室温反应。3h后，在冰水浴条件下加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到黄色固体粗产物，柱层析提纯，其中柱层析提纯的洗脱相体积比为石油醚：乙酸乙酯＝10：1，真空干燥得到(r)-2。
[0066][0067]
s3、将(r)-2溶于10ml二氯甲烷和10ml无水乙醇混合溶剂中，逐滴加入1ml浓盐酸。反应过夜，加入碳酸氢钠淬灭反应，再用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋蒸得到黄色固体(r)-3。
[0068]
[0069]
s4、称量(r)-3(1mmol，342mg)和盐酸羟胺(4mmol，278mg)溶于20ml二氯和20ml甲醇混合溶液中，再逐步滴加三乙胺(8mmol，1.12ml)，完成后升温至65℃反应加热回流过夜，后恢复反应至室温后，用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发得到黄色固体粗产物，柱层析提纯，其中柱层析提纯的洗脱相体积比为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，真空干燥得到荧光探针(r)-4。
[0070][0071]
本发明实施例提供的制备方法简单，成本低，反应条件温和。
[0072]
实施例2
[0073]
实施例1制备得到的化合物在水相中识别并区分碱性氨基酸的方法，包括：
[0074]
将探针(r)-4溶于适量色谱级四氢呋喃中，制备0.8mm探针溶液，并将醋酸锌和氨基酸分别溶于超纯水中，制备3eq醋酸锌溶液和0.5-10eq氨基酸溶液。随后在离心管中依次加入50ul氨基酸溶液、50ul醋酸锌溶液、50ul探针溶液，再加入3.85ml超纯水稀释，反应20min后进行荧光测试，其中荧光测试参数为：激发光狭缝为5nm，发射光狭缝为5nm，激发光波长为390nm。
[0075]
如图2-图8所示，在水相中(r)-4自身没有明显的荧光。当(r)-4与10eqarg和3eq醋酸锌反应时，在λ＝540nm处产生较大的荧光强度。而(r)-4与10eqlys和3eq醋酸锌反应时，在λ＝540nm处产生的荧光强度稍弱于精氨酸。当(r)-4与另外18种氨基酸相互作用时，荧光强度显著降低，大多数甚至没有荧光响应。
[0076]
本发明制备方法制备的化合物在水相中可以在多种氨基酸中特异性识别精氨酸或者赖氨酸。
[0077]
实施例3
[0078]
基于化合物的比色检测溶液的应用：
[0079]
如图9所示，将1ml的10eq氨基酸和1ml的3eq醋酸锌加入到5ml的比色皿中混合1min后，将1ml的探针溶液加入其中，反应5min后，用365nm紫外灯照射，其中，精氨酸检测溶液呈明亮的黄色，赖氨酸呈现出荧绿色，组氨酸则为透明颜色。
[0080]
本发明实施例的检测溶液具有响应时间短，选择性好和可视化程度高的优势，满足了快速识别并区分三种碱性氨基酸的需求。
[0081]
本发明实施例提供的检测方法采用绿色溶剂，价格低廉、后处理便捷、对环境十分友好。
[0082]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

技术特征：
1.一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：称取联萘酚和氢化钠分别溶于适量超干四氢呋喃中，在合适温度条件下，将两个溶液混合均匀，后恢复至室温反应；一定时间后，将反应体系降温至合适温度，再逐滴加入溴甲基甲醚，随后恢复至室温反应过夜；在冰水浴条件下加入超纯水淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到淡黄色固体产物，重结晶溶剂提纯得到白色中间体化合物2；s2：称取化合物2溶于适量超干四氢呋喃中，在合适温度条件下，逐滴加入正丁基锂，反应体系由无色变为棕色，恢复至室温反应；一定时间后，将反应体系降温至合适温度，再逐渐加入超干n-n二甲基甲酰胺，反应体系变为浑浊的淡蓝色，恢复至室温反应；一定时间后，在冰水浴条件下加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，再用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发得到黄色固体产物，柱层析提纯，真空干燥得到化合物3；s3：将化合物3溶于适量二氯甲烷和无水乙醇混合溶剂中，逐滴加入浓盐酸；一定时间后，加入碳酸氢钠淬灭反应，再用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发得到黄色固体化合物4；s4：称量化合物4溶于适量二氯甲烷和无水甲醇混合溶剂中，滴加适量三乙胺，在合适温度条件下反应一定时间，后将恢复至室温，无水硫酸镁干燥，旋转蒸发得到黄色固体产物，柱层析提纯，真空干燥得到目标化合物。2.根据权利要求1所述的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述合适温度为-5～5℃；所述一定时间为1.5～2.5h；所述重结晶溶剂为甲醇，温度设为70～90℃；步骤s2中，所述合适温度为-5～5℃；在反应体系由无色变为棕色并恢复室温反应，反应时间为0.5h～1.5h；在反应体系变为浑浊的淡蓝色并恢复至室温反应，反应时间为2.5～3.5h；所述柱层析提纯的洗脱相体积比为石油醚：乙酸乙酯＝10：1；所述(r)-3：正丁基锂：n-n二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2.5：2.5。3.根据权利要求1所述的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述一定时间为过夜；所述二氯甲烷：无水甲醇的体积比为1：1。4.根据权利要求1所述的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述合适温度为60～80℃；所述一定时间为8～12h；所述柱层析提纯的洗脱相体积比为石油醚：乙酸乙酯＝5：1；所述化合物4：盐酸羟胺：三乙胺的摩尔比为1：4：8。5.根据权利要求1-4任一项所述的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物的制备方法，其特征在于，所述联萘酚为(r)-binol；所述联萘酚：氢化钠：溴甲基甲醚的摩尔比为1：6：3。6.根据权利要求5所述的制备方法制备得到的水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物。
7.一种水相中识别并区分碱性氨基酸的荧光探针，其特征在于，包括如权利要求6所述的化合物。8.一种利用权利要求6所述的化合物在水相中识别并区分碱性氨基酸的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：制备探针溶液：将所述化合物溶于适量色谱级四氢呋喃中得到所述探针溶液；将醋酸锌和氨基酸分别溶于超纯水中，分别制备得到3eq醋酸锌溶液和0.5-10eq氨基酸溶液；在离心管中依次加入氨基酸溶液、醋酸锌溶液、探针溶液，再加入超纯水稀释；反应20min后进行荧光测试，其中荧光测试参数为：激发光狭缝为5nm，发射光狭缝为5nm，激发光波长为390nm；通过荧光测试结果以及比色溶液效果来识别并区分碱性氨基酸。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括：制备探针溶液：将所述化合物溶于适量四氢呋喃中得到所述探针溶液；将10eq氨基酸和3eq醋酸锌溶液加入洁净的反应离心管中；将探针溶液加入到离心管中，在室温反应5min；通过观察反应溶液在365nm紫外灯下的颜色来识别并区分碱性氨基酸。

技术总结
本发明提供一种水相中识别并区分碱性氨基酸的化合物、探针及制备方法和应用，其中制备方法包括：将联萘酚和氢化钠进行反应，然后加入溴甲基甲醚反应得到中间体化合物2；将化合物2与正丁基锂反应，再加入N-N二甲基甲酰胺反应，得到化合物3；将化合物3与浓盐酸反应，得到化合物4；将化合物4与三乙胺反应，得到目标化合物。本发明制备方法合成简便，价格低廉、反应条件适中，识别灵敏度高、后处理便捷、对环境十分友好；制备方法得到的化合物可制备荧光探针，利用氢键反应原理，检测方法响应时间短、选择性好、可视化程度高，满足了快速检测碱性氨基酸的需求。基酸的需求。基酸的需求。


技术研发人员：曾潮元 黄嘉荣 董勤喜 杜耕宇 樊彩玲 余贤哲
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2023.05.08
技术公布日：2023/8/21