洛匹那韦在制备预防胃癌转移药物中的应用

1.本发明涉及医药领域，特别涉及洛匹那韦在制备预防胃癌转移药物中的应用。


背景技术：

2.胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在发展中国家包括我国，其发病率及死亡率尤为突出，位居癌症相关死亡的第三位。近年来胃癌发病呈年轻化倾向，然而我国胃癌早期发现率低，大部分患者就诊时多在中晚期。癌细胞的浸润及远处转移是进展期胃癌治疗失败的主要原因，随转移程度增加，胃癌患者术后5年生存率从97%(ia期)降至6%(iv期)，然而，对于胃癌转移目前尚缺乏有效的干预手段。
3.肿瘤转移是多步骤过程，肿瘤细胞从原发灶脱落后侵入脉管系统，在循环系统中存活并随血液循环过程转移，从循环中渗出并定植到远处器官。由于上皮细胞需依赖细胞外基质及细胞间连接存活，一旦由细胞外基质脱落，则触发失巢凋亡，因此肿瘤细胞在无细胞外基质情况下得以存活(即获得抗失巢凋亡能力)，对肿瘤转移至关重要。诱导肿瘤细胞失巢凋亡，可能对预防胃癌转移具有重要意义。
[0004] 洛匹那韦 (lopinavir, lpv)，又称abt-378，是美国fda于2000年批准上市的复方制剂克立芝的有效成分之一，主要用于预防和治疗人类免疫缺陷病毒(hiv)感染和获得性免疫缺陷综合征(aids)。洛匹那韦作为一种抗逆转录病毒蛋白酶抑制剂，主要通过阻断gag-pol聚蛋白的分裂，产生未成熟的、无感染力的病毒颗粒而发挥抗hiv病毒的作用。尽管未将洛匹那韦纳入标准治疗方案中，但临床数据显示，在新冠病毒感染早期给予洛匹那韦干预，可显著抑制病毒复制从而降低传播风险，并有效降低重症风险。但有关将洛匹那韦用于抗肿瘤治疗，国内外文献及国内发明专利均未见报道。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供洛匹那韦的在制备预防胃癌转移药物中的应用，所述洛匹那韦可抑制胃癌细胞转移，在目前临床上缺乏有效防治胃癌转移手段的情况下，应用前景良好。
[0006]
本发明的技术方案是：洛匹那韦在制备预防胃癌转移药物中的应用。
[0007]
所述药物促进ags胃癌细胞失巢凋亡。
[0008]
所述药物抑制胃癌细胞转移。
[0009]
所述药物采用腹腔注射给药。
[0010]
所述药物的给药剂量10mg/kg/次。
[0011]
洛匹那韦是临床抗hiv病毒常用药物，经实验证明，洛匹那韦可在体外促进ags等胃癌细胞失巢凋亡，并呈现出较好的剂量效应关系。经裸鼠尾静脉注射人胃癌细胞，模拟胃癌细胞在体内抵抗失巢凋亡从而最终发生转移的情况，通过上述模型在体内实验证实洛匹那韦可抑制胃癌细胞转移。在目前临床上缺乏有效防治胃癌转移手段的情况下，应用前景
良好。
[0012]
为检测洛匹那韦是否具有预防胃癌转移的作用，本发明首先在体外采用超低吸附培养板对胃癌细胞进行培养，模拟胃癌细胞在循环系统无细胞外基质情况下的存活状态，并进一步使用洛匹那韦处理培养板中的细胞，通过采用流式细胞术检测胃癌细胞凋亡情况，在体外评估洛匹那韦对肿瘤细胞失巢凋亡的影响；其次，通过裸鼠尾静脉注射人胃癌细胞，在动物体内模拟胃癌细胞抵抗失巢凋亡并最终发生转移的情况，进一步采用小动物活体成像技术评价洛匹那韦对胃癌转移的影响。本发明使用的药物洛匹那韦可以促进体外培养的胃癌细胞失巢凋亡，并抑制胃癌细胞在裸鼠体内转移。
附图说明
[0013]
图1为洛匹那韦对悬浮培养的ags胃癌细胞凋亡的影响；图2为洛匹那韦对胃癌细胞在裸鼠体内转移的影响。
具体实施方式
[0014]
实施例中主要试剂来源：dmem培养基(gibco)、胎牛血清、pbs(中杉金桥)、0.25%胰酶(gibco)、poly-hema (sigma)、洛匹那韦 (mce)、annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒(bd biosciences)、d-虫荧光素钾盐(solaribio)、玉米油(碧云天)。
[0015] 人胃癌ags细胞购自atcc，裸鼠购自集萃药康生物科技股份有限公司并饲养于陆军军医大学实验动物中心(spf级)。
[0016] 实施例1 体外实验检测洛匹那韦对胃癌细胞失巢凋亡的影响1.1 实验方法：(1)洛匹那韦药物配制：购自mce公司的50mg洛匹那韦，加入1.6ml dmso，充分溶解后浓度为50mm，分装为100ul/支，于-80℃中保存。
[0017] (2)细胞培养平板包被：称取1g poly-hema，加入100ml 95%乙醇，震荡溶解至溶液澄清后，于6孔板中每孔加入1ml配制好的溶液，置于65℃培养箱中待其风干，风干后置于超净工作台中紫外照射除菌备用，使用前采用pbs润洗孔板一次。
[0018] (3)细胞接种及处理：取对数生长期细胞，采用胰酶消化制备单细胞悬液，经细胞计数后每孔接种5x104个细胞，培养孔中液体采用完全培养基补足至2ml，同时以25μm或50μm洛匹那韦处理培养孔中细胞48小时(对照组加入等体积dmso)。
[0019] (4)流式细胞术检测细胞凋亡情况：收集孔板中细胞悬液并离心获得细胞沉淀，pbs漂洗沉淀后，加入100ul含2ulannexinv-fitc及2ul pi的1xbinding buffer重悬沉淀，避光孵育15min后，上机检测。
[0020] 1.2 实验结果：计算annexinv-fitc单阳性及annexinv-fitc/pi双阳性细胞比例以反映细胞凋亡率，结果显示，dmso组悬浮培养细胞凋亡率为13.2%，25μm洛匹那韦处理组细胞凋亡率为
29.55%，50μm洛匹那韦处理组细胞凋亡率为60.09%，表明洛匹那韦可显著促进胃癌细胞失巢凋亡。
[0021]
实施例2：体内实验检测洛匹那韦对胃癌转移的影响2.1 实验方法：(1)洛匹那韦药物配制：购自mce公司的10mg洛匹那韦，加入5ml玉米油，充分溶解后浓度为2mg/ml，每次动物给药前现用现配。
[0022] (2)裸鼠尾静脉肺转移模型构建及药物干预：取稳定表达萤火虫荧光素酶基因的对数生长期胃癌细胞，胰酶消化制备成单细胞悬液，离心获得细胞沉淀，pbs漂洗一次后，再次用pbs重悬沉淀并细胞计数，最终稀释成浓度为5x107个/ml的单细胞悬液，于spf环境下每只裸鼠经尾静脉注射100ul上述细胞悬液，注射完成后随机分为两组，对照组腹腔注射150ul玉米油，洛匹那韦处理组腹腔注射150ul (1)中配制好的药物(约10mg/kg体重)。
[0023]
隔天给药一次，连续给药6周后，每只裸鼠以150mg/kg体重腹腔注射d-虫荧光素钾盐，10分钟后采用小动物活体成像仪进行检测。
[0024] 2.2 实验结果：与对照组相比，洛匹那韦处理组的裸鼠，在小动物活体成像仪下显示荧光强度及面积均显著降低。


技术特征：
1.洛匹那韦在制备预防胃癌转移药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物促进ags胃癌细胞失巢凋亡。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物抑制胃癌细胞转移。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物采用腹腔注射给药。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的给药剂量10mg/kg/次。

技术总结
本发明涉及洛匹那韦在制备预防胃癌转移药物中的应用，所述洛匹那韦可抑制胃癌细胞转移，在目前临床上缺乏有效防治胃癌转移手段的情况下，应用前景良好。应用前景良好。应用前景良好。


技术研发人员：吴亚冉 连继勤
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/21