油菜产量调控基因SKP1-IP15、其编码蛋白、表达载体及其应用

油菜产量调控基因skp1-ip15、其编码蛋白、表达载体及其应用
技术领域
1.本发明申请涉及分子育种技术领域，具体涉及一种油菜产量调控基因skp1-ip15、其编码蛋白、表达载体及其应用。


背景技术：

2.油菜（brassica campestris l.）是我国重要的经济作物之一，其种植面积和产量一直处于较高水平。近年来，随着人们对健康食品的需求增加，油菜籽油的市场需求也在不断增长。
3.油菜单株产量的主要构成因子主要包括有效分枝数、结实率、单荚粒重等。油菜的产量性状是由多个基因控制的复杂性状，目前对油菜产量基因的研究已经取得了一定的进展，例如一些研究已经鉴定出一些与油菜产量相关的基因，如bnflc.a10、bnga20ox2和bnspl9等；但油菜产量是复杂的数量性状，由多基因控制，目前所获得的功能基因还不足以全面阐明油菜产量形成的分子机制。因此，需进一步挖掘更多的油菜产量相关性状的基因并解析其利用途径，从而丰富产量形成的遗传基础，并为油菜新品种选育提供优良的基因资源。
4.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

5.发明人研究发现，玉米kwe2基因在油菜中存在有两个同源基因skp1-ip15（bnaa07g0241300zs和bnac06g0264200zs），基于此，发明人分别创制了这两个基因相应的敲除突变并明确了其在有效分枝、株高、叶面积等性状上的表现和对产量的调控作用，进而为利用skp1-ip15基因提高油菜产量提供了有力的技术支撑。
6.本发明的目的之一在于提供一种油菜产量调控基因skp1-ip15其核苷酸序列为下组中的至少一种：（1）如seq id no.1或seq id no.2所示；（2）在seq id no.1或seq id no.2的基础之上经过一至数个碱基替换和/或一至数个碱基的插入和/或缺失以及大片段的核苷酸序列插入/缺失/移位/倒位所形成的能影响产量相关性状表型的dna分子。
7.本发明公开的另一个方面，提供一种油菜产量调控基因skp1-ip15的编码蛋白，其氨基酸序列为下组中的至少一种：（1）由seq id no.1或seq id no.2所编码的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）如seq id no.3或seq id no.4所示；（3）由seq id no.3或seq id no.4经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有影响产量相关性状的蛋白质。
8.本发明公开的第三个方面，提供一种含所述油菜产量调控基因skp1-ip15的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或者重组菌。
9.本发明公开的第四个方面，提供一种鉴定油菜产量调控基因skp1-ip15突变的引物对，其序列如下：fbox-sg123f：5
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acccgccgcaaacgaacg
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fbox-sg123r：5
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tgagccatcgattctcgtc
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。
10.本发明公开的第五个方面，将所述基因skp1-ip15、所述引物应用在油菜产量性状改良及优势品种/品系选育当中。
11.例如，沉默/下调表达所述油菜基因skp1-ip15，以增加油菜株高、有效分枝数、果荚长度等性状。
12.本发明可转化的植物可以是单子叶和双子叶植物，包括但不限于油菜、玉米、小麦、大麦、黑麦、棉花、甘薯、向日葵、马铃薯、豆、豌豆、高粱、柳枝稷、苜蓿、拟南芥属等。
13.本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：1.对油菜产量调控基因skp1-ip15进行crispr/cas9编辑，获得纯合的crispr-cas9突变体，明确了skp1-ip15基因对油菜的株高、有效分枝数等性状表现的影响；确定了其对油菜产量的调控作用；从而为利用skp1-ip15基因提高油菜产量提供了坚强的技术支撑。
14.2.利用本技术公开的基因及方法，可方便油菜、玉米、小麦等农作物高产育种材料创制，缩短农作物新品种的选育周期，降低选育成本，提高育种效率。
附图说明
15.图1为本技术实施实例中油菜skp1-ip15基因的系统进化分析树。
16.图2为本技术实施实例中油菜的表型性状对比图，其中，左图为转基因对照，右图为油菜skp1-ip15两个基因敲除后的株系。
具体实施方式
17.相关术语定义及说明：术语“油菜产量调控基因”指一段具有编码蛋白能力的核苷酸序列，该序列特异编码具有调控株高、有效分枝数和产量功能的蛋白活性多肽。
18.所述“油菜产量调控基因”，还包括能编码具有天然的调控生物产量的基因skp1-ip15相同功能蛋白的、开放阅读框序列的变异形式；这些变异形式包括但并不限于：1个或几个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及5’或3’端添加几个（通常为60个以内，较佳的为30个以内，更佳的为10个以内，最佳的为5个以内）的核苷酸。
19.所述“油菜产量调控基因”，还包括能翻译一类具备调控油菜株高、有效分枝数和产量功能的氨基酸序列，如seq id no.2的氨基酸序列。该类氨基酸序列还包括具有天然调控油菜产量蛋白相同功能的变异形式。这些变异形式包括但并不限于：1个或几个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及c末端和/或n末端添加1个或几个（通常为20个以内，较佳的为10个以内，更佳的为5个以内）的氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代
时，通常不会改变蛋白质的功能；在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
20.另外，所述“油菜产量调控基因”的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr 扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本实施例公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计对应引物，并用市售的cdna文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna文库作为模板，扩增到有关序列。当序列较长时，通常需要两次或者多次的巢式pcr扩增，然后将各次pcr扩增产物按正确的顺序拼接在一起。
21.特别优选在高等植物中表达的至少一种本技术公开的油菜产量调控基因skp1-ip15的蛋白，一旦将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中，可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种（特别包括商业品种）中。可将本技术公开的各油菜产量调控基因skp1-ip15的核苷酸序列插入到表达盒中，或将其包含在非致病自我复制的病毒中，然后优选地，将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。本技术转化的受体可以是单子叶和双子叶植物，包括但不限于油菜、玉米、小麦、大麦、黑麦、水稻、棉花、向日葵、马铃薯、大豆、豌豆、柳枝稷、拟南芥属等。通过在转基因植物中表达本发明公开的核苷酸序列，由此在转基因植物中促进能够增强相应杂种优势表现的功能蛋白的生物合成。以这种方式，可产生增强杂种优势表现的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明公开的核苷酸序列可能需要修饰和优化，可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，从有至少约35%，优选多于约45%，更优选多于50%，最优选多于约60%gc含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。
22.下面对本发明的一些具体实施方式进行详细描述，以下的实施例更便于更好的理解本发明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
23.本技术各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；本领域技术人员应该理解，下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外，均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。材料、方法和实施例仅作阐述用，而非加以限制。
24.实施例一、油菜skp1-ip15基因的功能验证基于长期科学研究发现油菜中存在2个与玉米kwe2基因的亲缘关系较近的同源基因bnaa07g0241300zs和bnac06g0264200zs（分别如seq id no.1、seq id no.2所示），将其命名为skp1-ip15（见图1）。进一步研究验证表明，skp1-ip15基因与玉米kwe2基因具有类似的基因调控功能特性：负调控产量和杂种优势。
25.为进一步验证skp1-ip15基因对油菜产量相关的调控作用，对油菜bnaa07g0241300zs和bnac06g0264200zs基因的特异性位点进行了crispr-cas9编辑，获得两个基因的双突材料。
26.具体操作如下：（一）载体构建两个油菜同源基因bnaa07g0241300zs、bnac06g0264200z，分别位于a07染色体和c06染色体，针对每个基因设计了3个靶点，a07染色体的突变是靶点2插入pam上游第3、第4
碱基间插入a，c06染色体的突变是靶点1插入pam上游第3、第4碱基间插入c。
27.sgrna的具体信息如表1。
28.表1 sgrna相关信息。
29.（二）载体的遗传转化（1）用无菌镊子和解剖刀切取播种6天后的油菜幼苗的下胚轴，每个长度为0.8～1cm，在dm液体培养基中切取效果更佳，切取外植体时尽量一刀垂直切下。
30.（2）测菌的od值（lb中0.8左右较好，一般16 h即可），将培养好的菌株在离心机6000 rpm离心，10min。倒掉上清，用与菌液相同体积的dm重悬（20ml dm稀释，在灭菌的培养基皿中进行）。
31.（3）将切好的外植体放到已经配好浓度的皿中，侵染15～30min（时间不能长，否则外植体易死亡）。隔段时间摇晃一次，4～5次即可，侵染以每皿150～200个外植体/20ml菌液较合适。
32.注意：可以先配菌液，等外植体全部切完后，将其一起转到配好的菌液中，此时开始计时。
33.（4）转到m1培养基中，每皿20～25个外植体，暗光24℃放置。
34.（5）36～48h后转到m2中，并转到光中培养（24℃，昼16h/夜8h）。
35.（6）三周后转到m3中，每2～3周继代一次，直至出现绿芽。
36.（7）转入m4生根，需2～4周。
37.（三）对应突变位点的鉴定对转基因植株中bnaa07g0241300zs和bnac06g0264200zs基因的编辑情况进行检测，检测引物序列如下：fbox-sg123f acccgccgcaaacgaacg；fbox-sg123r tgagccatcgattctcgtc。
38.pcr扩增后的序列进行测序分析，使用hi-tom方法分析基因编辑突变，结果表明，a07染色体的突变是靶点2插入pam上游第3、第4碱基间插入a，c06染色体的突变是靶点1插入pam上游第3、第4碱基间插入c。
39.实施例二、油菜skp1-ip15基因敲除系的表型分析基于同样的栽培条件，对由上例所得crispr-cas9材料及其转基因对照进行田间表型观察和鉴定，发现bnaa07g0241300zs和bnac06g0264200zs的双突敲除系油菜株高、有
效分枝数和结实率均显著高于转基因对照材料（见图2）。说明skp1-ip15对油菜的有效分枝数和产量起负调控作用，与玉米kwe2基因有相对保守的功能。

技术特征：
1.一种油菜产量调控基因skp1-ip15，其核苷酸序列为下组中的至少一种：（1）如seq id no.1或seq id no.2所示；（2）在seq id no.1或seq id no.2的基础之上经过一至数个碱基替换和/或一至数个碱基的插入和/或缺失以及大片段的核苷酸序列插入/缺失/移位/倒位所形成的能影响产量相关性状表型的dna分子。2.一种油菜产量调控基因skp1-ip15的编码蛋白，其氨基酸序列为下组中的至少一种：（1）由seq id no.1或seq id no.2所编码的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）如seq id no.3或seq id no.4所示；（3）由seq id no.3或seq id no.4经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有影响产量相关性状的蛋白质。3.一种含有权利要求1所述油菜产量调控基因skp1-ip15的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或者重组菌。4.一种鉴定油菜产量调控基因skp1-ip15突变的引物对，其序列如下：fbox-sg123f：5
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tgagccatcgattctcgtc
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。5.权利要求1所述油菜产量调控基因skp1-ip15、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述引物对在调控油菜株高、有效分枝数或/和叶面积中的应用。6.权利要求1所述油菜产量调控基因skp1-ip15、、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述引物对在油菜产量性状改良及优势品种/品系选育中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，沉默/下调表达所述油菜基因skp1-ip15，以增加油菜株高、有效分枝数或/和叶面积。

技术总结
本申请公开了一种油菜产量调控基因SKP1-IP15、其编码蛋白、表达载体及其应用；本申请对油菜同源基因SKP1-IP15（BnaA07G0241300ZS和BnaC06G0264200ZS）进行CRISPR/Cas9编辑，明确了该基因对油菜株高、有效分枝数等性状表现的影响，验证确定了其对油菜产量的调控作用，从而为利用所述基因提高油菜产量奠定了坚实的技术基础。技术基础。技术基础。


技术研发人员：汤继华 付志远 杨慧丽 王雅菲 宗军 陈晓阳 杨瑞华
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/21