一种透皮肽修饰、含有Ce6和CpG的脂质体及应用

一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体及应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体及应用。


背景技术：

2.ce6(chlorine6，二氢卟吩e6)通常可由脱镁叶绿酸a合成而得，是一种良好的光敏剂，生物活性与脱镁叶绿酸a相近，ce6产生单线态氧的效率很高，因此适合开发用于肿瘤的光动力治疗，但同迄今为止的大部分光敏剂一样，ce6表现为疏水性，并在溶液中容易聚集，因此在实际应用中有一定困难。
3.而脂质体(liposomes)作为一种新兴的药物载体，其能够将亲脂性的药物包裹于磷脂双分子层之间，可以解决脂溶性光敏剂的溶解性和稳定性问题。而且，脂质体具有良好的生物相容性，具有挤压变形能力，且其结构与细胞膜相似，可以促进药物透皮。然而，虽然载药柔性纳米脂质体已实现疫苗、胰岛素、非类固醇类(比如布洛芬)和抗炎症类药物(比如双氯芬酸)等药物的透皮输运，但是由于脂质体尺寸较大，透皮效率依然不高；而且将载有光敏剂ce6和免疫佐剂的脂质体用于透皮给药尚未见文献报道。


技术实现要素：

4.本发明实施例的目的在于提供一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
5.本发明实施例是这样实现的，一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，包括以下重量份的原料：dppc8-20份、胆固醇2-5份、ddab1-3份、dspe-peg-td12-10份、ce60.1-2份、cpg0.01-0.1份。
6.优选地，包括以下重量份的原料：dppc10份、胆固醇2.5份、ddab1.5份、dspe-peg-td14份、ce60.5份、cpg0.06份。
7.本发明实施例的另一目的在于提供一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体的制备方法，包括以下步骤：
8.s1、溶解：将dppc、胆固醇、ddab、dspe-peg-td1、ce6溶于有机溶剂中，超声溶解；
9.s2、旋蒸：在预设温度下，将s1得到的物料进行缓慢旋转蒸发除去有机溶剂；
10.s3、真空干燥：将s2得到的物料进行真空干燥，除去残留的少量有机溶剂，形成干燥膜；
11.s4、水化：配制cpg去离子水溶液，cpg去离子水溶液中添加有吐温80，向s3得到的干燥膜中添加cpg去离子水溶液，进行旋转水合，得到脂质体悬浮液；
12.s5、微细化处理：将s4得到的脂质体悬浮液进行超声微细化处理，即可得到所述透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体。
13.优选地，s1中，所述有机溶剂为氯仿和甲醇的混合溶液，溶液为3:1，超声溶解时间为1-5min。
14.优选地，超声溶解时间为2min。
15.优选地，s2中，所述旋转蒸发在旋转蒸发仪中进行，旋转蒸发仪的转数为150-200rpm，旋转蒸发的温度为35-40℃。
16.优选地，旋转蒸发仪的转数为200rpm，旋转蒸发的温度为36℃。
17.优选地，s3中，所述真空干燥的时间为20～40min。
18.优选地，真空干燥的时间为30min.
19.优选地，s4中，所述旋转水合的时间为20～40min。
20.优选地，旋转水合的时间为30min。
21.优选地，s5中，所述超声微细化处理在细胞粉碎仪中进行，超声微细化处理的时间为5～10min。
22.优选地，超声微细化处理的时间为8min(超3s，停2s)。
23.本发明实施例的又一目的在于提供一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体作为药物载体在药物透皮输运上的应用，使用dspe-peg-td1修饰的阳离子脂质体作为载药载体来实现ce6的透皮给药，dspe-peg-td1通过打开皮肤细胞旁路来实现，可促使载药透皮脂质体完整、安全和高效地透过皮肤。
24.本发明实施例提供的一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，解决了现有技术中ce6水溶性差，常规脂质体透皮效率不高等问题，首次制备了透皮肽td修饰的、含有ce6和cpg的阳离子脂质体制剂，制备的透皮脂质体粒径在80-200nm之间，分散性指数(pdi)在0.1-0.3之间，ce6包封率可达到95％；
25.选用透皮肽td共轭的磷脂dspe-peg-td1，与传统的物理化学透皮方法相比，生物透皮肽td通过暂时打开细胞旁通路，促进药物通过皮肤，减少皮肤刺激和损伤；ce6包封于脂质体双分子层之间，透皮脂质体呈类球形，可通过在病变位置直接透皮给药，在生物体的药物残留更少，减少药物的毒副反应，并更容易在肿瘤部位累积；选用cpg作为免疫佐剂，可以增强光动力治疗的免疫原性反应；此外，选用阳离子脂质ddab(双十二烷基二甲基溴化铵)，使得脂质体表面带阳离子，更有利于透皮；
26.将本发明实施例制备的透皮脂质体进行抗肿瘤实验，将含有ce6和cpg的透皮脂质体涂抹在患处并进行激光照射后，可以明显抑制小鼠原位肿瘤的生长并抑制其转移。
附图说明
27.图1为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg冷冻电镜形貌图；
28.图2a为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg及对照组ce6-lip-cpg的粒径表征图；图2b为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg及对照组(游离cpg、ce6-lip-td1、ce6-lip-cpg)的电势表征图；
29.图3a为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg及对照组(游离ce6、ce6-lip-cpg)在b16f10细胞中的细胞摄取效果图；图3b为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg及对照组(游离ce6、ce6-lip-cpg)在4t1细胞中的细胞摄取效果图；
30.图4a为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg及对照组(游离ce6、ce6-lip-cpg)在b16f10细胞中的体外光毒性结果图；图4b为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg及对照组(游离ce6、ce6-lip-cpg)在4t1细胞中的体外光毒性结果图；
31.图5a为体外透皮装置示意图；图5b为实施例1提供的ce6-lip-td1-cpg与ce6-lip-cpg的体外透皮效果对比图；图5c为用ce6-lip-fitc、ce6-lip-td1-fitc体外透皮后小鼠皮肤组织的共聚焦图像(绿色荧光对应fitc)；
32.图6a为不同治疗组(n＝5)的原发肿瘤生长曲线；图6b为不同治疗组的远端肿瘤生长曲线；图6c为不同治疗组小鼠的体重变化曲线；图6d为21天后从小鼠中分离出的肿瘤(a：pbs(laseron)处理组；b：lip-cpg(laseron)处理组；c：ce6-lip-td1-cpg(laseroff)处理组；d:ce6-lip-cpg(laseron)处理组；e：ce6-lip-td1(laseron)处理组；f：ce6-lip-td1-cpg(laseron)处理组)尺寸图；
33.图7a为治疗后原位肿瘤组织中cd8t细胞(红色)的免疫荧光染色检测；图7b为治疗后原位肿瘤切片中钙网蛋白(calreticulin，crt)(免疫原性细胞死亡的典型标志)(绿色)暴露的免疫荧光成像；图7c为治疗后原位肿瘤组织切片的炎症相关因子免疫荧光图像，比例尺＝50μm(蓝色：dapi，绿色：il-6-alexa fluor488，红色：tnf-α-cy3)。
具体实施方式
34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
35.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
36.实施例1、一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，其制备方法包括以下步骤：
37.准确称取10mgdppc，2.5mg胆固醇，1.5mgddab，4mgdspe-peg-td1，500μgce6于50ml烧瓶中，加入3ml氯仿和1ml甲醇，超声溶解1min后，置于36℃旋转蒸发仪下，真空条件下200rpm缓慢蒸发除去氯仿和甲醇，直至瓶壁上形成一层均匀薄膜，室温真空干燥30min后，加入1ml含0.5％吐温80的10μm的cpg去离子水溶液，旋转水合30min得到脂质体悬浮液，移至细胞粉碎仪下超声8min(超3s，停2s)，将所得的澄清溶液10000rpm离心5min后取上清液，即得均匀透明的含ce6及免疫佐剂cpg的纳米透皮脂质体ce6-lip-td1-cpg。
38.对实施例1制备得到的透皮脂质体ce6-lip-td1-cpg进行外观、微观形态、粒径/电位表征、细胞摄取试验、体外光毒性试验、体外透皮试验、体内抗肿瘤试验以及体内免疫试验等，具体如下：
39.(1)形态表征：
40.实施例1制备的透皮脂质体ce6-lip-td1-cpg，肉眼观察可见为绿色均一混悬液，以空白脂质体作为对照组，其为白色均一混悬液，两者均无分层、絮凝、沉淀等现象，图1为ce6-lip-td1-cpg的冷冻电镜形貌图，可以看出，ce6-lip-td1-cpg呈球形或近球形，粒径介于80-200nm之间；
41.(2)粒径及zeta电位的测定：
42.利用动态光散射仪(malvern，英国)对ce6-lip-td1-cpg进行分析，结果如图2所示，根据图2a可以看出，ce6-lip-td1-cpg的平均水合粒径为130.1
±
4.06nm，根据图2b可以看出，平均zeta电位为25
±
0.88mv；
43.(3)细胞摄取试验：
44.将b16f10细胞、4t1细胞分别按照1
×
104细胞/孔接种于含有新鲜细胞培养基(含
有10％胎牛血清和1％抗生素的dmem)的共聚焦小皿中，并在一定条件(37℃；5％的二氧化碳)下将其在细胞培养箱中培养24h，然后将含有10μm游离ce6等效物的ce6、ce6-lip-td1-cpg和ce6-lip-cpg溶液加入皿中，细胞和样品共同培养2h后用pbs洗涤细胞两次，并用4％多聚甲醛溶液固定，20min后将固定液洗去，细胞用dapi染料染色10min，然后用pbs洗3次，最后，在共聚焦显微镜下对处理后的b16f10细胞和4t1细胞进行观察和拍照记录，得到结果分别为如图3a、图3b所示，根据图3可以看出，相较于游离的ce6，包封在脂质体的ce6更易被细胞摄取；
45.(4)体外光毒性试验：
46.在试验(3)的基础上，对处理后的b16f10细胞和4t1细胞进行激光照射，得到结果分别为如图4a、图4b所示，根据图4可以看出，游离的ce6由于未能被细胞摄取，在激光照射下不存在细胞杀伤效果，而同样浓度下包封在脂质体的ce6在激光照射下具有很好的肿瘤细胞杀伤效果；
47.(5)体外透皮试验：
48.体外透皮装置如图5a所示；ce6-lip-td1-cpg与ce6-lip-cpg的体外透皮效果对比如图5b所示，可以看出，ce6-lip-td1-cpg与ce6-lip-cpg都随着时间逐渐穿透皮肤，但前者的穿透效率明显高于后者，表明共轭的td肽可以增强脂质体的皮肤渗透性；24小时后，制备皮肤切片并通过荧光显微镜观察，结果如图5c所示，可以看出，ce6-lip-td1-fitc和ce6-lip-fitc处理的皮肤组织均显示fitc荧光，这可能归因于阳离子柔性脂质体本身具有一定的透皮能力；然而，在ce6-lip-td1-fitc处理组中观察到的荧光强度显著强于ce6-lip-fitc处理组，这进一步证实了td肽的皮肤渗透增强，这些结果表明，具有td功能化的ce6-lip-td1-cpg脂质体显示出高的经皮渗透性；
49.(6)体内抗肿瘤试验：
50.采用双侧皮下肿瘤模型进行小鼠体内抗肿瘤研究：
51.双侧皮下肿瘤模型的建立：通过将b16f10细胞(1
×
106)皮下注射入c57bl/6小鼠的左背部来建立原发性肿瘤，在第6天，将b16f10细胞(2
×
105)皮下注入同一只小鼠的右背部建立远端肿瘤，肿瘤体积根据下式计算：宽度2×
长度
×
0.5；
52.将b16f10荷瘤小鼠随机分为六组(n＝5)，一组660nm激光照射的pbs，二组660nm激光照射的空脂质体，三组660nm激光照射的ce6-lip-cpg，四组660nm激光照射的ce6-lip-td1，五组无光照射的ce6-lip-td1-cpg，六组660nm激光照射的ce6-lip-td1-cpg，然后，将等分试样的治疗剂涂抹于小鼠肿瘤表面，在治疗期间每两天记录一次肿瘤大小和体重，并且当肿瘤体积超过伦理体积时对小鼠实施安乐死；
53.记录结果如图6所示，可以看出，两周后，660nm激光照射ce6-lip-td1和660nm激光照射ce6-lip-td1-cpg组原位皮下肿瘤的大小和重量要明显小于660nm激光照射pbs组、660nm激光照射空脂质体组、660nm激光照射ce6-lip-cpg组和无光照射ce6-lip-td1-cpg组，而660nm激光照射ce6-lip-td1-cpg组对远端肿瘤的抑制效果又要好于660nm激光照射ce6-lip-td1组，表明免疫佐剂cpg增强了免疫反应效果；
54.(7)体内免疫相关试验：
55.对试验(6)治疗后的小组进行原位肿瘤组织切片与免疫荧光染色，得到结果如图7所示，可以看出，660nm激光照射ce6-lip-td1和ce6-lip-td1-cpg组的淋巴细胞浸润、crt暴
露及肿瘤相关炎症因子的增加均强于其他对照组，且后者的增强效果优于前者，表明光动力治疗本身可以诱导免疫原性细胞死亡，且cpg的存在增强了这一免疫反应。
56.实施例2、一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，其制备方法包括以下步骤：
57.准确称取8mgdppc，2mg胆固醇，1mgddab，2mgdspe-peg-td1，100μgce6于50ml烧瓶中，加入3ml氯仿和1ml甲醇，超声溶解2min后，置于35℃旋转蒸发仪下，真空条件下150rpm缓慢蒸发除去氯仿和甲醇，直至瓶壁上形成一层均匀薄膜，室温真空干燥20min后，加入1ml含0.5％吐温80的10μm的cpg去离子水溶液，旋转水合20min得到脂质体悬浮液，移至细胞粉碎仪下超声5min(超3s，停2s)，将所得的澄清溶液10000rpm离心5min后取上清液，即得均匀透明的含ce6及免疫佐剂cpg的纳米透皮脂质体ce6-lip-td1-cpg。
58.实施例3、一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，其制备方法包括以下步骤：
59.准确称取20mgdppc，5mg胆固醇，3mgddab，10mgdspe-peg-td1，2mgce6于50ml烧瓶中，加入3ml氯仿和1ml甲醇，超声溶解5min后，置于40℃旋转蒸发仪下，真空条件下150rpm缓慢蒸发除去氯仿和甲醇，直至瓶壁上形成一层均匀薄膜，室温真空干燥40min后，加入1ml含0.5％吐温80的10μm的cpg去离子水溶液，旋转水合40min得到脂质体悬浮液，移至细胞粉碎仪下超声10min(超3s，停2s)，将所得的澄清溶液10000rpm离心5min后取上清液，即得均匀透明的含ce6及免疫佐剂cpg的纳米透皮脂质体ce6-lip-td1-cpg。
60.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，其特征在于，包括以下重量份的原料：dppc8-20份、胆固醇2-5份、ddab1-3份、dspe-peg-td12-10份、ce60.1-2份、cpg0.01-0.1份。2.根据权利要求1所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体，其特征在于，包括以下重量份的原料：dppc10份、胆固醇2.5份、ddab1.5份、dspe-peg-td14份、ce60.5份、cpg0.06份。3.一种如权利要求1或2所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、溶解：将dppc、胆固醇、ddab、dspe-peg-td1、ce6溶于有机溶剂中，超声溶解；s2、旋蒸：在预设温度下，将s1得到的物料进行缓慢旋转蒸发除去有机溶剂；s3、真空干燥：将s2得到的物料进行真空干燥，除去残留的少量有机溶剂，形成干燥膜；s4、水化：配制cpg去离子水溶液，cpg去离子水溶液中添加有吐温80，向s3得到的干燥膜中添加cpg去离子水溶液，进行旋转水合，得到脂质体悬浮液；s5、微细化处理：将s4得到的脂质体悬浮液进行超声微细化处理，即可得到所述透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体。4.根据权利要求3所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体的制备方法，其特征在于，s1中，所述有机溶剂为氯仿和甲醇的混合溶液，溶液为3:1，超声溶解时间为1-5min。5.根据权利要求3所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体的制备方法，其特征在于，s2中，所述旋转蒸发在旋转蒸发仪中进行，旋转蒸发仪的转数为150-200rpm，旋转蒸发的温度为35-40℃。6.根据权利要求3所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体的制备方法，其特征在于，s3中，所述真空干燥的时间为20～40min。7.根据权利要求3所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体的制备方法，其特征在于，s4中，所述旋转水合的时间为20～40min。8.根据权利要求3所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体的制备方法，其特征在于，s5中，所述超声微细化处理在细胞粉碎仪中进行，超声微细化处理的时间为5～10min。9.一种如权利要求1或2所述的透皮肽修饰、含有ce6和cpg的脂质体作为药物载体在药物透皮输运上的应用。

技术总结
本发明适用于生物医药技术领域，提供了一种透皮肽修饰、含有Ce6和CpG的脂质体，包括以下原料：DPPC、胆固醇、DDAB、DSPE-PEG-TD1、Ce6、CpG。本发明还提供了一种透皮肽修饰、含有Ce6和CpG的脂质体的制备方法、及其作为药物载体在药物透皮输运上的应用。本发明选用DDAB使得脂质体表面带阳离子，更有利于透皮，Ce6经脂质体包封后可通过在病变位置直接透皮给药，在生物体的药物残留更少，更容易在肿瘤部位累积，选用CpG可以增强光动力治疗的免疫原性反应，选用透皮肽TD共轭的磷脂DSPE-PEG-TD1，打开细胞旁通路，完全促进药物通过皮肤，减少皮肤刺激和损伤。激和损伤。激和损伤。


技术研发人员：李芬芬 汪绍珍 邱本胜 丁卫平
受保护的技术使用者：中国科学技术大学
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/21