一种基于CPT1A高表达的线粒体膜色谱固定相、构建方法和应用

一种基于cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相、构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于特异性靶向cpt1a活性成分的线粒体膜色谱固定相及其构建方法和应用。


背景技术：

2.肉碱酰基转移酶1a(cpt1a)是线粒体脂肪酸代谢相关的一种极为重要的膜蛋白，位于线粒体外膜，在长链脂肪酸β氧化中起关键作用，是脂肪酸β氧化的限速酶，用于转运长链脂肪酸。通过调控cpt1a，可以改善动物组织中的胰岛素信号，调节肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、癌症和心血管并发症等人类疾病。cpt1a已成为治疗代谢综合征的有吸引力的靶点，但是目前发现的cpt1a调控剂的种类和方法还较少。
3.线粒体膜色谱技术可以靶向细胞器膜及膜蛋白从而更加快速有效的从复杂成分筛选出线粒体靶向调节分子，目前尚无用于特异性识别能够调控长链脂肪酸β氧化的限速酶cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相相关报道。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供基于cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相及其构建方法和应用。本发明制备的线粒体膜固定相可用于与cpt1a有相互作用的小分子化合物的的筛选。本发明制备的线粒体膜色谱柱与载体结合牢固、生物识别准确度高，可应用于从复杂成分中高通量筛选作用于cpt1a的脂代谢调控分子。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.一方面，本发明提供了一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，所述cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相是由戊二醛修饰活化氨基丙基，硅胶键合cpt1a高表达的重组细胞的线粒体膜制成的。
7.所述的一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，所述cpt1a高表达的重组细胞以hek 293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含cpt1a全长基因的表达载体；所述cpt1a在重组细胞的线粒体外膜上表达。
8.所述的一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，所述cpt1a全长基因的核苷酸序列如seq no id.1所示。
9.所述的一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，所述包含cpt1a全长基因的表达载体为lv5-hcpt1aegfp慢病毒。
10.所述的一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，所述cpt1a在重组细胞的线粒体外膜上表达。
11.第二方面，本发明提供了一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相的构建方法，包括以下步骤：
12.(1)取cpt1a高表达的重组细胞，冲洗，离心后收集重组细胞沉淀，用低渗溶液重悬后冰上孵育，用匀浆器破碎重组细胞，然后在线粒体分离介质下通过差速离心收集线粒体沉淀，重悬后超声破碎线粒体，得线粒体膜悬液；
13.(2)将上述线粒体膜悬液加入到活化的戊二醛修饰的氨基丙基硅胶固定相中，涡旋振荡，在冰浴条件下搅拌后，孵育过夜，清洗，得到cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相。
14.所述的构建方法，步骤(1)中所述低渗溶液的加入量为3～4ml；所述冰上孵育的时间为10～30min；所述超声的条件为：在冰浴条件下，40～60w功率超声2～4s，间隔20s，重复3～5次；
15.步骤(2)中所述涡旋振荡的时间为1～2min，所述冰浴条件下搅拌的时间为0.5～1h，所述孵育过夜的温度为4℃。
16.第三方面，本发明提供了一种cpt1a高表达线的线粒体膜色谱柱，通过将所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相湿法装柱后制得。
17.第四方面，本发明提供了任一项所述的cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相，或所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱柱在筛选调节代谢综合征相关疾病的药物分子中的应用。
18.第五方面，本发明提供了任一项cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相，或cpt1a高表达的线粒体膜色谱柱在筛选靶向cpt1a的脂代谢调控分子中的应用，可用于与cpt1a有相互作用的小分子化合物的的筛选。
19.所述的应用，其特征在于，所述脂代谢为脂质分解代谢。
20.第六方面，本发明提供了葛根素、大豆苷、黄芩素在作为靶向cpt1a的脂代谢调控分子中的应用，其特征在于，是通过所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱柱筛选得到。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.1、本发明将包含cpt1a全长基因的表达载体转染入hek293宿主细胞，并经过筛选，获得了稳定的cpt1a高表达的重组细胞，记为cpt1a-hek293细胞。本发明构建的包含cpt1a全长基因的重组cpt1a-hek293细胞的线粒体膜能够稳定表达cpt1a分子。
23.2、作为宿主细胞的hek293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(ad5)dna的永生化细胞，该细胞本身含有的各种受体表达量相对较低；而重组后的cpt1a-hek293细胞线粒体外膜的cpt1a的相对表达量比hek293明显增高，相对于其他细胞线粒体外膜表面分子占据表达优势地位，在结合cpt1a受体方面处于有利地位；可大大提高筛选以cpt1a为靶点药物的灵敏性及特异性；同时能为进一步研究cpt1a生物学特性提供较好的细胞模型。
24.3、本发明提供的用于特异性识别cpt1a的脂代谢调控分子的cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相，是由戊二醛修饰的活化氨基丙基硅胶键合cpt1a高表达的重组细胞的线粒体膜制成的。具有高表达特定cpt1a的膜受体，cpt1a受体为能够与cpt1a靶向脂代谢调控分子特异性结合的受体。在线粒体色谱柱中填充cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相可以提高复杂样品中cpt1a脂代谢调控分子筛选的特异性，能够针对复杂样品中的cpt1a脂代谢调控分子进行特异性识别，提升筛选效率，对阐明作用机理具有重要的意义。
25.4、本发明提供的cpt1a高表达膜色谱固定相的制备方法，将cpt1a高表达的重组细胞的线粒体分离出来，破膜后制得线粒体膜悬液，加入活化的戊二醛修饰的活化氨基丙基硅胶中，使线粒体膜被戊二醛修饰的氨基丙基硅胶发生化学键合而被固定，即得到cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相。该方法工艺简单，操作方便，稳定性好，特异性强。进一步的，将
制得的cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相湿法装柱后，还可制得用于识别作用于cpt1a的激动剂组分的线粒体膜色谱柱，便于进行复杂样品中cpt1a激动剂组分的筛选。
26.5、运用本发明构建的cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相筛选黄芩提取物，发现提取物中黄芩苷在cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相可发生保留，保留时间为12min左右，说明黄芩苷可与cpt1a结合。文献报道在体外实验黄芩苷可以特异性激活cpt1a，极大提升cpt1a酶活性。因此上述结果表明cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相可以应用于以cpt1a为靶点的药物筛选。
附图说明
27.图1为cpt1a定位在线粒体外膜的immunofluorescence检测图；
28.图2为cpt1a高表达线粒体膜色谱模型示意图；
29.图3为黄芩苷在二维cpt1a高表达线粒体膜色谱上的分析结果。
具体实施方式
30.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
31.术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
32.实施例1：
33.1、含cpt1a基因的慢病毒的构建：
34.使用含有cpt1a基因的慢病毒质粒颗粒对hek293t细胞进行感染，收集病毒液。简言之，常规培养hek293t细胞，在6cm培养皿内接种hek293t细胞，确保次日细胞密度达80％。此时取无菌1.5ml ep管，加入
△
8.9，vsvg，plv[exp]-puro-ef1a》hcpt1a:t2a:egfp质粒各2μg，加入36μl1mg/ml的pei溶液和500μl opti-培养基，充分混匀后静置15min，将混合液逐滴加入上述含3ml完全培养基的单层细胞培养皿中，轻轻摇动混匀后置于含5％co2的37℃温箱孵育，转染6～8h后更换培养基，加入3ml完全培养基，将细胞放置温箱继续孵育。收取48h、72h的上清液，1500rpm离心5min，收集含病毒上清。
[0035]
2、高表达cpt1a重组细胞的构建：
[0036]
取上述方法制备得到的含病毒上清对hek293细胞进行侵染，并通过puromycin筛选获得稳定的cpt1a高表达的重组细胞，记为hek293-cpt1a细胞。简言之，在6孔板内接种hek293细胞(确保次日侵染前细胞密度约为30％～40％)，细胞贴壁后，吸去培养基，加入1.5ml完全培养基、1.5ml上述方法制备的含病毒上清液和3μl 10μg/μl polybrene。侵染24h后换新鲜培养基，侵染48～96h后在倒置荧光显微镜观察绿色荧光表达情况，估计慢病毒侵染hek293细胞的效率，在侵染效率达到60％～80％时，加入1:5000puromycin(10mg/
ml)进行药物筛选，同时设立一个hek293细胞对照皿，加入1:5000puromycin(10mg/ml)，作为puromycin是否有效的对照，每隔一天换用含puromycin的培养基，以替换含大量死细胞的培养基，直到抗性群落能被识别出，对获得的具有puromycin抗性基因的阳性cpt1a-hek293细胞进行培养，进行传代培养，鉴定成功后冻存用于后续实验。
[0037]
3、western blot检测所得细胞中cpt1a表达量：
[0038]
10cm皿培养阳性细胞，收集细胞，提取线粒体蛋白通过western blot蛋白质印迹法检测。结果表明cpt1a-hek293细胞显著高于nc-hek293的cpt1a表达量。
[0039]
4、免疫荧光法验证所得细胞中cpt1a表达在线粒体上：
[0040]
通过细胞爬片、一抗孵育、荧光二抗孵育等过程后对cpt1a-hek293细胞cpt1a蛋白进行免疫荧光定位，以线粒体外膜蛋白tom20的免疫荧光定位为对照。得到的结果如图1所示，通过共定位分析可以看出cpt1a蛋白定位于线粒体。
[0041]
实施例2：
[0042]
1、cpt1a线粒体膜色谱固定相制备
[0043]
(1)氨基硅胶戊二醛化：将在100℃干燥24h的0.5g sio
2-nh2加入500ml戊二醛(5％wt)甲醇溶液中，在室温下搅拌2小时进行氨醛缩合，所得沉淀用甲醇清洗5次，60℃烘箱过夜烘干即得到醛基化的固定相载体。
[0044]
(2)cpt1a-hek293细胞线粒体的提取及线粒体膜的制备：取对数生长期的cpt1a-hek293细胞，pbs冲洗后1000
×
g离心5min收集，细胞沉淀，加入4ml低渗缓冲溶液(含1％pmsf)混悬细胞，在冰上孵育10min后，分两次加入5ml匀浆器进行研磨，上下研磨40～50次后加入40％体积的2.5
×
等渗缓冲液至溶液为1
×
等渗液。匀浆好的样品在1300g4℃离心10min，上清在13000g 4℃离心15min后所得沉淀用1
×
等渗缓冲液重悬，10000g 4℃离心10min，所得沉淀即为线粒体，将收集到的线粒体沉淀用10mmol/l的pbs重悬后超声破碎即得线粒体膜悬液，具体超声条件为：冰浴下，60w功率超声2s，间隔20s，重复三次，所得即为线粒体膜悬液。
[0045]
(3)cpt1a线粒体膜色谱固定相制备：将上述线粒体膜悬液加入到50mg戊二醛化的固定相载体，置于磁力搅拌器上于冰水浴条件下搅拌30min，之后在4℃下孵育过夜，利用线粒体膜上的蛋白、磷脂上的氨基与固定相载体表面的醛基的氨醛缩合将线粒体膜固定，用pbs清洗三次，所得即为cpt1a线粒体膜色谱固定相。
[0046]
2、cpt1a线粒体色谱柱的制备
[0047]
将得到的cpt1a线粒体膜色谱固定相利用rpl-zd10装柱机湿法装入10mm(l)
×
2.0mm(i.d.)的柱芯中，即可得cpt1a线粒体膜色谱柱。如图2为cpt1a高表达线粒体膜色谱模型示意图。
[0048]
实施例3：
[0049]
1、cpt1a线粒体膜二维液相色谱分析系统的建立：
[0050]
采用高效液相色谱仪及配套的二元泵、单元泵、恒温箱、自动进样器、检测器为组成基础，并由工作站控制，将得到的cpt1a高表达线粒体膜色谱柱(长度10mm
×
内径2mm)作为第一维色谱柱，将c18色谱柱(长度100mm
×
内径3.0mm)作为第二维色谱柱，采用电控六通阀在线串联cpt1a高表达线粒体膜色谱柱和c18色谱柱，且第二维色谱柱的流出口与四级杆质谱仪连接，构建得到cpt1a高表达线粒体膜二维液相色谱分析系统。
[0051]
2、cpt1a高表达线粒体膜二维液相色谱分析系统的选择性考察：
[0052]
配置靶向cpt1a的阳性药物黄芩苷溶液和阴性药物卡托普利标准溶液，一维cpt1a高表达线粒体膜色谱系统以2mm na2hpo4为流动相，流速为0.2ml/min。二维c
18
色谱系统，流动相为乙腈-0.1％甲酸水体系在流速为1ml/min下等度洗脱，并以0.4ml/min进入质谱检测器。首先在上述条件下平衡色谱柱1h直到出现稳定的柱压和基线，然后将黄芩苷、卡托普利标准溶液导入二维液相色谱分析系统内，流出液被ods反相柱富集，之后切换至二维系统分析检测。分析结果表明，cpt1a阳性药物黄芩苷有很好的保留效果，阴性药物卡托普利无保留。说明所构建的cpt1a高表达线粒体膜二维液相色谱分析系统具有很好的选择性。图3为黄芩苷在此系统上的二维色谱结果，图3左为黄芩苷在一维线粒体膜色谱系统的保留情况，图3右下为黄芩苷在一维线粒体膜色谱系统保留组分在二维c
18
色谱系统的保留结果，图3右上为黄芩苷在c
18
色谱系统的保留结果。通过图3可知，线粒体膜色谱系统可以特异性保留阳性药物黄芩苷。
[0053]
3、cpt1a高表达线粒体膜二维液相色谱分析系统效果验证：
[0054]
通过重复3根cpt1a高表达色谱柱在二维色谱系统的效果，结果发现柱内重复性5次的rsd≤2％，柱间rsd≤5％，单根柱保留活性半衰期为6天。这说明此线粒体膜色谱系统的重复性良好，满足分析需求，且戊二醛固定化后生物活性保持时间较长。
[0055]
4、cpt1a高表达线粒体膜二维液相色谱分析系统应用：
[0056]
利用此系统在黄芩和葛根提取物中筛选出了靶向cpt1a的脂代谢调控分子，如葛根素、大豆苷、黄芩素等。
[0057]
因此，由cpt1a-hek293细胞制备得cpt1a高表达线粒体膜二维液相色谱分析系统可应用于靶向线粒体膜上cpt1a靶点的可调控脂质代谢的效应分子药物的筛选。
[0058]
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

技术特征：
1.一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，其特征在于，所述cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相是由戊二醛修饰活化氨基丙基，硅胶键合cpt1a高表达的重组细胞的线粒体膜制成的。2.如权利要求1所述的一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，其特征在于，所述cpt1a高表达的重组细胞以hek293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含cpt1a全长基因的表达载体；所述cpt1a在重组细胞的线粒体外膜上表达。3.如权利要求2所述的一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，其特征在于，所述cpt1a全长基因的核苷酸序列如seqnoid.1所示；所述包含cpt1a全长基因的表达载体为lv5-hcpt1aegfp慢病毒。4.如权利要求1所述的一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相，其特征在于，一种如权利要求1-3任一项所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取cpt1a高表达的重组细胞，冲洗，离心后收集重组细胞沉淀，用低渗溶液重悬后冰上孵育，用匀浆器破碎重组细胞，然后通过差速离心收集线粒体沉淀，重悬后超声破碎线粒体，得线粒体膜悬液；(2)将上述线粒体膜悬液加入到活化的戊二醛修饰的氨基丙基硅胶固定相中，在冰浴条件下搅拌后，孵育过夜，清洗，得到cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述低渗溶液的加入量为3～4ml；所述冰上孵育的时间为10～30min；所述超声的条件为：在冰浴条件下，40～60w功率超声2～4s，间隔20s，重复3～5次；步骤(2)中所述涡旋振荡的时间为1～2min，所述冰浴条件下搅拌的时间为0.5～1h，所述孵育过夜的温度为4℃。6.一种cpt1a高表达的线粒体膜色谱柱，其特征在于，通过将如权利要求1-3任一项所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱固定相湿法装柱后制得。7.如权利要求1-3任一项所述的cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相，或如权利要求6所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱柱在筛选调节代谢综合征相关疾病的药物分子中的应用。8.如权利要求1-3任一项所述的cpt1a高表达线粒体膜色谱固定相，或如权利要求6所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱柱在筛选靶向cpt1a的脂代谢调控分子中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脂代谢为脂质分解代谢。10.葛根素、大豆苷、黄芩素在作为靶向cpt1a的脂代谢调控分子中的应用，其特征在于，是通过如权利要求6所述的cpt1a高表达的线粒体膜色谱柱筛选得到。

技术总结
本发明一种基于CPT1A高表达的线粒体膜色谱固定相、构建方法和应用，属于生物技术领域。一种CPT1A高表达的线粒体膜色谱固定相，CPT1A高表达的线粒体膜色谱固定相是由戊二醛修饰活化氨基丙基，硅胶键合CPT1A高表达的重组细胞的线粒体膜制成的。CPT1A高表达的重组细胞以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含CPT1A全长基因的表达载体。本发明制备的线粒体膜固定相可用于与CPT1A有相互作用的小分子化合物的的筛选。本发明制备的线粒体膜色谱柱与载体结合牢固、生物识别准确度高，可应用于从复杂成分中高通量筛选作用于CPT1A的脂代谢调控分子。于CPT1A的脂代谢调控分子。于CPT1A的脂代谢调控分子。


技术研发人员：龙建纲 苏武 赵壮 孔宇
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/8/21