一种电化学发光传感器及其制备方法、烟碱的检测方法与流程

1.本发明涉及一种电化学发光传感器及其制备方法、烟碱的检测方法，属于化学检测
技术领域：
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背景技术：
：：2.烟碱(nicotine)，也被称为(s)3-[1-甲基吡咯烷基-2-基]吡啶，纯的烟碱是一种无色至淡黄色液体，相对分子质量为162.23g/mol。同时，烟碱是一种n-胆碱能受体激动剂，可以激活神经系统中的胆碱能受体，如肾上腺、肌肉、心脏和大脑，从而产生与乙酰胆碱相似的生理效应。而更多的神经科学研究报告称，小剂量的烟碱作用于中枢神经系统可以引发能量流动、欣快感和情绪提升。然而，烟碱的长期积累则会导致神经毒性，产生不同程度的记忆和感觉衰退，甚至有癌症或帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病风险。此外，烟碱被认为是卷烟产品中的主要成瘾物质，也是戒烟的主要障碍。[0003]迄今为止，尽管已经开发了基于气相色谱、质谱、分光光度法、液相色谱和表面增强拉曼散射法等各种方法用于不同基质样品中烟碱的定量检测，但由于以上方法需要技术熟练的实验员以及复杂的仪器，并且需要较长的分析时间，因此在现阶段，开发一种简单、快速、稳定检测烟碱的方法是十分迫切的。技术实现要素：[0004]本发明的目的在于提供一种电化学发光传感器，将电化学发光传感器用于检测烟碱时可以解决目前定量检测烟碱时存在检测仪器复杂和检测时间长的问题。[0005]本发明的第二个目的在于提供一种电化学发光传感器的制备方法，可以解决目前定量检测烟碱时制备的检测仪器存在检测时间长的问题。[0006]本发明的第三个目的在于提供一种烟碱的检测方法，可以解决目前定量检测烟碱时存在检测仪器复杂和检测时间长的问题。[0007]为了实现上述目的，本发明的电化学发光传感器所采用的技术方案为：[0008]一种电化学发光传感器，包括电极和固定在所述电极上的复合物，所述复合物主要由金属有机框架材料和活性物质复合而成，所述活性物质由三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌中的羧基和聚乙烯亚胺中的氨基经酰胺化反应制得。[0009]本发明的电化学发光传感器可以用于定量检测溶液中的烟碱，用于定量检测溶液中的烟碱时，具有检测时间短，操作简单的优点，并且具有较高的检测精度、良好的灵敏度和选择性。复合物中的金属有机框架材料的作用为提高电致化学发光材料的负载量，增强发光效率，活性物质的作用是作为发光材料，提供电致化学发光信号。[0010]优选地，所述聚乙烯亚胺的结构如式1所示：[0011][0012]式1中，n为大于0的整数。[0013]优选地，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为90000～100000。聚乙烯亚胺的重均分子量过大，会造成合成的活性物质的形状不均匀，聚乙烯亚胺的重均分子量过小，会造成合成的活性物质的粒径过小，发光材料负载量降低，导致电致化学发光信号减弱。[0014]优选地，所述三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和聚乙烯亚胺的质量比为(9～10):10。例如，所述三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和聚乙烯亚胺的质量比为9:10。三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌的用量过多，会造成合成的活性物质以及复合物的形貌不均匀；用量过少，会造成活性物质发光效率低下。[0015]优选地，所述酰胺化反应的方法包括以下步骤：先将三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌采用羧基活化剂进行活化，得到活化中间体，再将活化中间体与聚乙烯亚胺进行反应不少于2h。[0016]优选地，所述酰胺化反应的方法包括以下步骤：[0017](1)将三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和羧基活化剂在水中混合，以对三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌中的羧基进行活化；[0018](2)将步骤(1)中混合后的体系与聚乙烯亚胺进行混合反应，纯化。[0019]优选地，所述羧基活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺。[0020]优选地，所述三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(9～9.5):(28.8～30):(5.8～6)。例如，所述三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为9:28.8:5.8。[0021]优选地，步骤(1)中，所述混合的时间不少于15min。[0022]为了提高混合速率和混合效果，节省反应时间，优选地，步骤(2)中，所述聚乙烯亚胺以聚乙烯亚胺溶液的形式使用。[0023]优选地，所述聚乙烯亚胺溶液的质量分数为1～2％。例如，所述聚乙烯亚胺溶液的质量分数为1％。[0024]优选地，步骤(2)中，所述混合反应的时间不少于2h。[0025]为了除去未反应的游离的三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺和聚乙烯亚胺，优选地，步骤(2)中，所述纯化的方法包括以下步骤：将混合反应后的体系采用透析膜进行透析以除去体系中分子量小于2000da的物质；所述透析膜的截留分子量不小于2000da。可以理解的是，由于酰胺化反应得到的产物分子量要大于各原料的分子量，因此，将混合反应后的体系采用透析膜进行透析是为了除去体系中分子量小于2000da的物质。[0026]优选地，所述金属有机框架材料由水溶性锆盐和1,2,4-苯三甲酸在水中进行自主装后经过除杂制得。[0027]优选地，所述水溶性锆盐为水溶性四价锆盐。优选地，所述水溶性四价锆盐为卤化锆。例如，所述水溶性四价锆盐为氯化锆。[0028]优选地，所述水溶性锆盐和1,2,4-苯三甲酸的摩尔比为(0.9～1):1。例如，所述水溶性锆盐和1,2,4-苯三甲酸的摩尔比为1:1。[0029]优选地，所述自主装的温度为95～110℃，时间为40～50h。例如，所述自主装的温度为100℃，时间为48h。[0030]优选地，每1.40g的水溶性锆盐对应采用的水的质量为20～30g。例如，每1.40g的水溶性锆盐对应采用的水的质量为20g。[0031]优选地，所述自主装是将含有水溶性锆盐和1,2,4-苯三甲酸的水溶液进行静置。[0032]优选地，所述除杂的方法包括以下步骤：将自主装后的体系进行固液分离，再将固液分离所得产物进行洗涤，干燥。[0033]优选地，所述洗涤是将固液分离所得产物依次采用水、甲醇进行洗涤。优选地，所述干燥的温度为70～75℃。[0034]优选地，所述复合物由包括以下步骤的方法制得：将金属有机框架材料和活性物质在水中混合，固液分离，得到复合物。[0035]优选地，所述金属有机框架材料和活性物质的质量比为1:(0.9～1.1)。例如，所述金属有机框架材料和活性物质的质量比为5.4:5.94。金属有机框架材料和活性物质的质量比过小，会造成复合物合成包覆失败，质量比过大，会造成复合物的ecl效率低下。[0036]优选地，所述复合物的制备方法中所进行的混合的温度为室温，时间不少于24h。[0037]优选地，所述复合物的制备方法中所进行的固液分离为离心。优选地，所述离心采用的转速为7000～8000rpm，时间为5～10min。例如，所述离心采用的转速为7000rpm，时间为5min。[0038]本发明的电化学发光传感器的制备方法所采用的技术方案为：[0039]一种如上所述的电化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：将复合物的水分散液涂覆到电极上，孵育后得到电化学发光传感器。[0040]本发明的电化学发光传感器的制备方法，操作简单，制备的电化学发光传感器用于定量检测溶液中的烟碱时，具有检测时间短，操作简单的优点，并且具有较高的检测精度、良好的灵敏度和选择性。[0041]优选地，所述复合物的水分散液的浓度为0.26～0.3g/ml。复合物的水分散液的浓度过大，导致信号强度过大(超量程)，复合物的水分散液的浓度过小，导致信号强度过低。[0042]优选地，复合物的水分散液在电极上的涂覆密度为20～30μl/100mm2。例如，复合物的水分散液在电极上的涂覆密度为25μl/100mm2。[0043]优选地，所述孵育的温度为30～40℃，时间为9～14h。例如，所述孵育的温度为37℃，时间为12h。[0044]优选地，所述电极为氧化铟锡电极。优选地，所述电极的待涂覆表面含有羟基。[0045]为了使氧化铟锡电极的待涂覆表面含有羟基，优选地，将氧化铟锡电极表面进行羟基化处理。优选地，所述羟基化处理是将氧化铟锡电极在碱液中进行浸泡。优选地，所述碱液为氢氧化钠溶液。优选地，所述氢氧化钠溶液的浓度为1～2mol/l。优选地，所述浸泡的时间不少于1h。[0046]本发明的烟碱的检测方法所采用的技术方案为：[0047]一种烟碱的检测方法，采用如上所述的电化学发光传感器对待测溶液中的烟碱进行检测，根据检测得到的电化学发光信号和标准曲线，确定待测溶液中的烟碱浓度。[0048]本发明的烟碱的检测方法，具有检测时间短，操作简单的优点，并且具有较高的检测精度、良好的灵敏度和选择性，本发明的烟碱的检测方法的检出限低至1.9×10-12mol/l。[0049]优选地，对待测溶液中的烟碱进行检测时，电压扫描范围为0～-1.5v，光电倍增管的电压为500～600v。[0050]可以理解的是，所述待测溶液中含有电解质。所述电解质为过硫酸盐。[0051]优选地，所述标准曲线为δecl＝-1330.138lgcnicotine+943.136，其中，δecl代表电化学发光信号强度变化值，等于电解液中不存在烟碱时测得的电化学发光信号强度和电解液中存在烟碱时测得的电化学发光信号强度的差值，cnicotine代表烟碱的浓度。附图说明[0052]图1为实施例3中在含有不同浓度的烟碱的电解液中检测得到的电化学发光光谱图；[0053]图2为实施例3中在含有不同浓度的烟碱的电解液中检测得到的电化学发光信号强度的差值与烟碱的浓度关系和拟合得到的线性方程的示意图；[0054]图3为实验例1中将裸露的ito电极作为电化学发光传感器，同时将实施例2和对比例1制备的电化学发光传感器进行电化学发光信号测试时(测试时所用的电解液中的烟碱浓度为0)得到的结果示意图；[0055]图4为实验例1中将裸露的ito电极作为电化学发光传感器，同时将实施例2和对比例1制备的电化学发光传感器进行电化学发光信号测试时(测试时所用的电解液中的烟碱浓度为5.0×10-4mol/l)得到的结果示意图；[0056]图5为实验例1中烟碱对对比例1和实施例2制备的电化学发光传感器的淬灭效果的测试结果示意图；[0057]图6为实验例2中基于猝灭反应的电化学发光传感器的原理示意图；[0058]图7为实验例3中金属有机框架材料(zr-mof)和复合物(ru-bpei@zr-mof)的tem图；[0059]图8为实验例3中聚乙烯亚胺、三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和活性物质(ru-bpei)的uv-vis吸收光谱图、傅里叶变换红外(ftir)光谱图、金属有机框架材料(zr-mof)和活性物质(ru-bpei)的zeta电位测试结果示意图、裸露的ito电极和实施例2制备的电化学发光传感器的循环伏安实验结果示意图；[0060]图9为实验例4中对实验参数进行优化的结果示意图；[0061]图10为实验例5中电化学发光传感器对不同基质样品的测试结果示意图；[0062]图11为实验例6中对实际样品中的烟碱测试所得的电化学发光光谱图。具体实施方式[0063]下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步说明。[0064]本发明实施例和实验例中所有的烟碱从中国郑州烟草研究所获得，zrcl4、三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶)钌(ii)二氯化物，又称为三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌([ru(dcbpy)32+]cl2)、聚乙烯亚胺(bpei)、1-乙基-3-[3-(二甲胺基)-丙基]碳二酰亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1,2,4-苯三羧酸均购于麦克林试剂有限公司(中国上海)。l-半胱氨酸(l-cysteine，l-cys)、葡萄糖(glucose，glu)、甘油(glycerol，gly)、谷氨酸(glutamicacid，ga)和丙二醇(1,2-propanediol，pg)购自国药集团化学试剂有限公司(中国北京)。其中，聚乙烯亚胺(bpei)的重均分子量为100000，化学式如下式所示：[0065][0066]一、本发明的电化学发光传感器的具体实施例如下：[0067]实施例1[0068]本实施例的电化学发光传感器，包括电极和固定在电极上的复合物，电极为表面含有羟基的氧化铟锡电极，复合物由金属有机框架材料和活性物质复合而成，活性物质由三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌中的羧基和聚乙烯亚胺中的氨基经酰胺化反应制得。[0069]二、本发明的电化学发光传感器的制备方法的具体实施例如下：[0070]实施例2[0071]本实施例的电化学发光传感器的制备方法为实施例1的电化学发光传感器的制备方法，具体包括以下步骤：[0072](1)制备金属有机框架材料[0073]将1.40g氯化锆(zirconiumtetrachloride，zrcl4)溶解于10ml去离子水中并超声处理10min，得到氯化锆溶液；然后将1.26g的1,2,4-苯三甲酸分散到10ml去离子水中并搅拌10min，得到1,2,4-苯三甲酸溶液；再将氯化锆溶液和1,2,4-苯三甲酸溶液混合并搅拌20min，得到混合液，之后，将混合液密封在ptfe(聚四氟乙烯，polytetrafluoroethylene)衬里的高压釜中，然后将高压釜转移到100℃的预热烘箱中，静置48h，冷却至室温后，将高压釜中的混合物离心，再将离心得到的固体分别依次用水和甲醇洗涤，水和甲醇洗涤的次数均为3次，最后将洗涤后的固体在70℃下干燥，得到金属有机框架材料(用zr-mof表示)；[0074](2)制备活性物质[0075]将9mg的三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌溶解于2ml超纯水中并超声处理5min，得到三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌溶液，然后将28.8mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和5.8mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)加入到三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌溶液中，采用磁力搅拌混合15min，对羧基进行活化，得到含有活化中间体的混合液，然后向含有活化中间体的混合液中加入1g质量分数为1％的聚乙烯亚胺溶液，搅拌2h，使聚乙烯亚胺和活化中间体进行反应，然后采用截留分子量为2000da的透析膜对反应后的体系进行透析(透析时间为60h)纯化，除去体系中分子量小于2000da的物质，得到截留液，截留液即为含有活性物质的分散液，通过化学分析仪器检测截留液中的活性物质，结果显示，活性物质的浓度为5.94mg/ml，并且实验结果表明，未反应的聚乙烯亚胺或者三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌对制备的电化学发光传感器的测试性能无影响，将制备的活性物质在4℃下储存备用；[0076](3)制备复合物[0077]将5.4mg步骤(1)制得的金属有机框架材料分散于1ml去离子水中，得到金属有机框架材料分散液，然后向金属有机框架材料分散液中加入1ml步骤(2)制得的含有活性物质的分散液(浓度为5.94mg/ml)，搅拌24h，得到含有复合物的分散液，然后将含有复合物的分散液进行离心(离心采用的转速为7000rpm，时间为5min)，离心所得固体即为复合物，然后将复合物分散于5ml去离子水中，得到浓度为0.26g/ml的复合物分散液，将复合物分散液在4℃下储存备用；[0078](4)制备电化学发光传感器[0079]将长度为100mm，宽度为100mm，厚度为1.1mm的氧化铟锡(ito)电极片先用乙醇超声清洗3次，再用水超声清洗3次，再将清洗后的氧化铟锡(ito)电极片进行干燥，然后在室温下浸泡于浓度为1mol/l的naoh溶液中，浸泡时间为1h，再将浸泡后的氧化铟锡电极片依次进行洗涤、干燥，得到表面含有羟基的氧化铟锡电极片，然后将25μl步骤(3)制得的复合物分散液滴到表面含有羟基的氧化铟锡电极片的一个表面(面积为100mm×100mm)上，在37℃下孵育12h，此时复合物完全吸附在氧化铟锡电极片上，得到电化学发光传感器。[0080]对比例1[0081]本对比例的电化学发光传感器的制备方法，具体包括以下步骤：[0082](1)按照实施例1的步骤(2)的方法制备得到含有活性物质的分散液(浓度为5.94mg/ml)；[0083](2)将长度为100mm，宽度为100mm，厚度为1.1mm的氧化铟锡(ito)电极片先用乙醇超声清洗3次，再用水超声清洗3次，再将清洗后的氧化铟锡(ito)电极片进行干燥，然后浸泡于浓度为1mol/l的naoh溶液中，浸泡时间为1h，再将浸泡后的氧化铟锡电极片依次进行洗涤、干燥，得到表面含有羟基的氧化铟锡电极片，然后将25μl步骤(1)制得的含有活性物质的分散液(浓度为5.94mg/ml)滴到表面含有羟基的氧化铟锡电极片的一个表面(面积为100mm×100mm)上，在37℃下孵育12h，此时活性物质完全吸附在氧化铟锡电极片上，得到电化学发光传感器。[0084]三、本发明的烟碱的检测方法的具体实施例如下：[0085]实施例3[0086]本实施例的烟碱的检测方法，具体包括以下步骤：[0087](1)建立标准曲线[0088]将实施例2制得的电化学发光传感器使用mpi-e型电化学发光分析仪进行电化学发光信号测试，测试时所用的电解液为含有烟碱和过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液，电压扫描范围为0至-1.5v，光电倍增管(pmt，programmaptable)的电压设置为500v，以实施例2制得的电化学发光传感器作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl(饱和kcl)作为参比电极；电解液由烟碱、过硫酸钾和磷酸盐缓冲溶液混合制得，磷酸盐缓冲溶液由nacl、nah2po4、kcl、kh2po4和水混合制得，nacl、nah2po4、kcl、kh2po4的浓度分别依次为0.137、0.01、0.0027和0.002mol/l，磷酸盐缓冲溶液的ph为7.4，电解液中过硫酸钾的浓度为0.1mol/l，电解液中烟碱的浓度为1.0×10-12mol/l～5.0×10-4mol/l；通过测试含有不同浓度烟碱的电解液，建立烟碱的浓度和电化学发光信号之间的关系，可以用线性方程式表示为：δecl＝-1330.138lgcnicotine+943.136(r2＝0.9953)，其中，δecl代表电化学发光信号强度变化值(δecl，δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时的电化学发光信号强度)，cnicotine代表烟碱的浓度，线性方程式的线性范围为1.0×10-11～5.0×10-4mol/l，检出限为1.9×10-12mol/l；在含有不同浓度的烟碱的电解液中检测得到的电化学发光光谱图如图1所示，将在不含烟碱的电解液中检测到的电化学发光信号强度与含有不同浓度的烟碱的电解液中检测到的电化学发光信号强度的差值(δecl，δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时的电化学发光信号强度)与烟碱的浓度作图，并将拟合得到的线性方程作图，结果如图2所示；[0089](2)检测待测溶液中的烟碱浓度[0090]将1根黄山卷烟上剥下的卷烟叶浸入10ml蒸馏水中，浸泡时间为12h，粗滤，再将滤液以13000rpm的转速离心10min，以去除大颗粒物质，然后采用含有过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液将滤液中的1ml上清液稀释25倍，得到待测溶液；含有过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液由过硫酸钾和磷酸盐缓冲溶液混合制得，磷酸盐缓冲溶液由nacl、nah2po4、kcl、kh2po4和水混合制得，nacl、nah2po4、kcl、kh2po4的浓度分别依次为0.137、0.01、0.0027和0.002mol/l，磷酸盐缓冲溶液的ph为7.4，含有过硫酸钾的磷酸盐缓冲溶液中的过硫酸钾的浓度为0.1mol/l；[0091]然后将待测溶液作为电解液，按照步骤(1)中的方法进行电化学发光信号测试，将测试得到的电化学发光信号(δecl)带入步骤(1)中的标准曲线中，计算得到待测溶液中的烟碱浓度，结果为1.69×10-6mol/l。[0092]实验例1[0093]为了评价裸露的ito电极、实施例2和对比例1制备的电化学发光传感器的性能，将裸露的ito电极作为电化学发光传感器，同时将实施例2和对比例1制备的电化学发光传感器按照实施例3的步骤(1)中的方法进行电化学发光信号测试，测试时所用的电解液中的烟碱浓度为0mmol/l，结果如图3所示。由图2可知，裸露的ito电极显示出极弱的信号，对比例1制备的电化学发光传感器检测得到的信号明显增强，而实施例2制备的电化学发光传感器检测得到的信号进一步增强，证实了实施例2中制备的金属有机框架材料对活性物质具有优异的负载能力。而当烟碱存在时(电解液中的烟碱浓度为5.0×10-4mol/l)，对比例1和实施例2制备的电化学发光传感器检测得到的信号有所减弱(图4所示)。[0094]可以根据电化学发光信号强度的差值来评价烟碱对对比例1和实施例2制备的电化学发光传感器的淬灭效果，将对比例1和实施例2制备的电化学发光传感器在不含烟碱和含有烟碱时测试所得的电化学发光信号强度的差值(δecl)进行作图，结果如图5所示，其中，δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时的电化学发光信号强度。结果显示，烟碱对实施例2制备的电化学发光传感器的淬灭效果更优，说明实施例2制备的电化学发光传感器可用于烟碱分析。[0095]实验例2[0096]基于实验例1，对基于猝灭反应的电化学发光传感器的原理进行了简单分析，如图6所示。由图6可知，实施例2制备的电化学发光传感器与含有烟碱的溶液接触时，固定在电极上的复合物(ru(ⅱ)-bpei@zr-mof)中的二价钌转化为一价钌复合物(ru(ⅰ)-bpei@zr-mof)，而过硫酸根(s2o82-)被还原为硫酸根自由基阴离子(so4·-)，烟碱(c10h14n2)中的吡咯基团被硫酸根自由基阴离子(so4·-)氧化，发生竞争性氧化作用，导致一价钌复合物(ru(i)-bpei@zr-mof)与强氧化剂so4·-转化为自由基复合物(ru(ii)*-bpei@zr-mof)的反应减弱，由此激发态返回基态并伴随的发光现象减弱。图6中的nicotinicacid代表烟酸，products代表含碳化合物。[0097]实验例3[0098]为了对实施例2中制备的金属有机框架材料(zr-mof)和复合物(ru-bpei@zr-mof)的结构进行表征，采用透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope，tem)对金属有机框架材料(zr-mof)和复合物(ru-bpei@zr-mof)的形貌进行了表征，结果如图7所示，其中，图7a为金属有机框架材料(zr-mof)的tem图，图7b为复合物(ru-bpei@zr-mof)的tem图。由图7可知，水热合成的zr-mof具有立方形状结构，平均直径约为132nm，复合物(ru-bpei@zr-mof)为圆形结构，具有约232nm的较高平均直径。[0099]另外，采用紫外可见光分析仪测试了实施例2中的聚乙烯亚胺、三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和活性物质(ru-bpei)的uv-vis吸收光谱，结果如图8a所示，图8a中的bpei表示聚乙烯亚胺，ru(ii)表示三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌，ru(ii)+bpei表示由三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和聚乙烯亚胺组成的混合物，ru-bpei表示活性物质。由图8a可知，聚乙烯亚胺的uv-vis曲线中没有明显的吸收峰，而三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌在296nm和465nm处显示出两个特征峰，属于基于配体的π→π*跃迁和金属-配体电荷转移(mlct)(dπ(ru)→π*(dcbpy))。并且，三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌的uv-vis曲线与由三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和聚乙烯亚胺组成的混合物的uv-vis曲线相同。然而，与三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌相比，活性物质(ru-bpei)的特征峰由于三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌的联吡啶环与聚乙烯亚胺的-nh2之间的共轭效应而呈现出偏移。[0100]同时，采用perkinelmergx光谱仪(perkinelmerco.，waltham，ma)测定了实施例2中的聚乙烯亚胺(bpei)、三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌(ru(ii))和活性物质(ru-bpei)的傅里叶变换红外(ftir)光谱，结果如图8b所示。由图8b可知，对于三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌来说，-cooh的o-h和c＝o的拉伸振动在3380和1720cm-1处可以观察到两个峰值。与三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌相比，聚乙烯亚胺和活性物质(ru-bpei)均在3371、3266、2934和2830cm-1处出现峰值，这归因于聚乙烯亚胺链中n-h和c-h的拉伸振动。对于活性物质(ru-bpei)样品，在1598cm-1处出现了酰胺键，并且在1720cm-1处的-cooh振动峰消失，证实了聚乙烯亚胺和三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌通过酰胺键成功合成了活性物质(ru-bpei)。[0101]然后，采用zeta电位分析仪(zetasizernano-zs系统，英国马尔文)测试了金属有机框架材料(zr-mof)和活性物质(ru-bpei)的zeta电位，结果如图8c所示。由图8c可知，金属有机框架材料(zr-mof)和活性物质(ru-bpei)的zeta电位分别为-38.24mv和10.99mv，说明金属有机框架材料(zr-mof)通过静电相互作用可吸附带正电的活性物质(ru-bpei)。[0102]最后，对裸露的ito电极和实施例2制备的电化学发光传感器进行了循环伏安实验(采用ec实验室仪器进行实验)，循环伏安实验在含有0.1mol/l的kcl和5.0×10-3mol/l的[fe(cn)6]3-/4-的磷酸盐缓冲溶液(0.1mol/l，ph＝7.4)中进行，扫描速率为50mv/s，结果如图8d所示，图8d中的ito表示裸露的ito电极，ru-bpei@zr-mof/ito表示实施例2制备的电化学发光传感器。由图8d可知，裸露的ito电极显示出[fe(cn)6]3-/4-的两个可逆氧化还原峰。与裸露的ito电极对应的氧化还原峰电流相比，实施例2制备的电化学发光传感器对应的氧化还原峰电流明显增强，说明zr-mof具有良好的导电性，能够促进电子的转移，同时也证实了电化学发光传感器的成功制备。[0103]实验例4[0104]为了获得最佳的烟碱检测性能，对实验参数进行了优化。按照实施例2的电化学发光传感器的制备方法制备电化学发光传感器，区别在于调整步骤(3)中的金属有机框架材料的质量，使金属有机框架材料和活性物质的质量比为0.2:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1，分别得到对应的电化学发光传感器。然后将制得的电化学发光传感器按照实施例3的步骤(1)中的方法进行电化学发光信号测试，测试时所用的电解液中的烟碱浓度为0和5.0×10-4mol/l，将金属有机框架材料和活性物质的质量比(横坐标)以及测试所得的电化学发光信号强度变化值δecl(纵坐标)进行作图，结果如图9a所示，其中，δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时的电化学发光信号强度。由图9a可知，当金属有机框架材料和活性物质的质量比为1:1时，测试得到的电化学发光信号的强度最大。[0105]另外，按照实施例2的电化学发光传感器的制备方法制备电化学发光传感器，区别在于调整步骤(4)中的孵育时间，孵育时间分别调整为2h、6h、12h、16h、24h，分别得到对应的电化学发光传感器。然后将制得的电化学发光传感器按照实施例3的步骤(1)中的方法进行电化学发光信号测试，测试时所用的电解液中的烟碱浓度为0和5.0×10-4mol/l，将孵育时间(横坐标)以及测试所得的电化学发光信号强度变化值δecl(纵坐标)进行作图，结果如图9b所示，其中，δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时测得的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时测得的电化学发光信号强度。由图9b可知，当孵育时间增加时，δecl值随之增加，并在12h获得最佳性能。之后，δecl开始持续下降。因此，最佳孵育时间选择为12h。[0106]最后，将实施例2制备的电化学发光传感器按照实施例3的步骤(1)中的方法进行电化学发光信号测试，区别在于，调整磷酸盐缓冲溶液的ph，磷酸盐缓冲溶液的ph分别为5、6、7、7.4、8，测试时所用的电解液中的烟碱浓度为0和5.0×10-4mol/l，将电解液的ph(横坐标)以及测试所得的电化学发光信号强度变化值δecl(纵坐标)进行作图，结果如图9c所示，其中，δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时的电化学发光信号强度。由图9c可知，随着磷酸盐缓冲溶液的ph逐渐增大，δecl的强度逐渐增加，并在7.4时达到最高，故磷酸盐缓冲溶液的最佳ph为7.4。[0107]实验例5[0108]为了评价实施例2制备的电化学发光传感器的基质效应，将实施例2制备的电化学发光传感器按照实施例3的步骤(1)中的方法进行电化学发光信号测试，区别在于，将电解液中的烟碱(nicotine)分别依次替换为以下基质样品：l-半胱氨酸(l-cys)、葡萄糖(glu)、甘油(gly)、谷氨酸(ga)和丙二醇(pg)，且电解液中的l-半胱氨酸(l-cys)、葡萄糖(glu)、甘油(gly)、谷氨酸(ga)和丙二醇(pg)的浓度均为0.1mol/l，电解液中的烟碱浓度为5.0×10-4mol/l。将各类物质对应测试所得的电化学发光信号强度变化值δecl(纵坐标)和物质类型(横坐标)进行作图，如图10所示，其中，δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时的电化学发光信号强度。由图10可知，实施例2制备的电化学发光传感器对烟碱进行检测时不受基质影响。[0109]实验例6[0110]为了评价实施例2制备的电化学发光传感器对实际样品中的烟碱的检测效果，采用实施例3的方法中的步骤(2)测试从超市购买的卷烟(配料中含有烟碱约0.9mg/根)中的烟碱含量(测试时采用三个样品进行平行测试)，测试所得的电化学发光光谱图如图11所示，同时将测试所得的电化学发光信号强度差值(δecl＝ecl0-ecl，ecl和ecl0分别表示电解液中存在烟碱时的电化学发光信号强度和电解液中不存在烟碱时的电化学发光信号强度)带入标准曲线计算烟碱含量，计算结果显示，1支香烟的烟碱含量为0.688±0.09mg。香烟盒上标记的1支香烟参考烟碱含量为～0.900mg。因此，采用实施例2制备的电化学发光传感器对实际样品中的烟碱含量检测结果与理论值接近，说明采用实施例3的方法可以检测烟草样品中的烟碱含量。[0111]同时，采用实施例3的方法中的步骤(2)分别依次测试含有浓度为1.0×10-11、1.0×10-8、5.0×10-4mol/l的烟碱待测溶液，烟碱待测溶液中的烟碱浓度的实际值、检测值、回收率和相对标准偏差如表1所示。[0112]表1检测不同浓度的烟碱待测溶液时的检测结果[0113]实际值(mol/l)检测值(mol/l)回收率(％)相对标准偏差(％)1.0×10-119.82×10-1298.204.141.0×10-89.63×10-996.302.955.0×10-44.95×10-499.007.27[0114]由表1可知，检测值与理论值相差不超过7.27％，说明实施例3的方法具有较好的检测精度。[0115]为了评价金属有机框架材料对电化学发光传感器的影响，按照实施例2的电化学发光传感器的制备方法制备电化学发光传感器，区别在于，将步骤(1)中的氯化锆替换为硝酸铜、硝酸锌、硝酸镁或硝酸铁，或者将1,2,4-苯三甲酸替换为对苯二甲酸、1,3,5-苯三甲酸或者2,5-二羟基-对苯二甲酸，然后将制备的电化学发光传感器按照实施例3的步骤(1)中的方法进行电化学发光信号测试，测试时所用的电解液中的烟碱浓度为0mmol/l和5.0×10-4mol/l，然后计算各电化学发光传感器在不含烟碱和含有烟碱时测试所得的电化学发光信号强度的差值(δecl)，结果显示，各电化学发光传感器测试所得的电化学发光信号强度的差值(δecl)均明显小于实施例2制备的电化学发光传感器在相同条件下测试所得的电化学发光信号强度的差值(δecl)。经计算可知，改变金属有机框架材料的结构时，各电化学发光传感器测试所得的电化学发光信号强度的差值(δecl)均不大于实施例2制备的电化学发光传感器在相同条件下测试所得的电化学发光信号强度的差值(δecl)的25％。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种电化学发光传感器，其特征在于，包括电极和固定在所述电极上的复合物，所述复合物主要由金属有机框架材料和活性物质复合而成，所述活性物质由三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌中的羧基和聚乙烯亚胺中的氨基经酰胺化反应制得。2.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的结构如式1所示：式1中，n为大于0的整数。3.如权利要求2所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的重均分子量为90000～100000。4.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌和聚乙烯亚胺的质量比为(9～10):10。5.如权利要求1-4中任一项所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述酰胺化反应的方法包括以下步骤：先将三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌采用羧基活化剂进行活化，得到活化中间体，再将活化中间体与聚乙烯亚胺进行反应不少于2h。6.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述金属有机框架材料由水溶性锆盐和1,2,4-苯三甲酸在水中进行自主装后经过除杂制得。7.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述水溶性锆盐和1,2,4-苯三甲酸的摩尔比为(0.9～1):1；所述自主装的温度为95～110℃，时间为40～50h。8.如权利要求6或7所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述自主装是将含有水溶性锆盐和1,2,4-苯三甲酸的水溶液进行静置。9.如权利要求1所述的电化学发光传感器，其特征在于，所述复合物由包括以下步骤的方法制得：将金属有机框架材料和活性物质在水中混合，固液分离，得到复合物；所述金属有机框架材料和活性物质的质量比为1:(0.9～1.1)。10.一种如权利要求1-9中任一项所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将复合物的水分散液涂覆到电极上，孵育后得到电化学发光传感器。11.如权利要求10所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述复合物的水分散液的浓度为0.26～0.3g/ml；复合物的水分散液在电极上的涂覆密度为20～30μl/100mm2。12.如权利要求10或11所述的电化学发光传感器的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为30～40℃，时间为9～14h。13.一种烟碱的检测方法，包括以下步骤：采用如权利要求1-9中任一项所述的电化学
发光传感器对待测溶液中的烟碱进行检测，根据检测得到的电化学发光信号和标准曲线，确定待测溶液中的烟碱浓度。

技术总结
本发明涉及一种电化学发光传感器及其制备方法、烟碱的检测方法，属于化学检测技术领域。本发明的电化学发光传感器包括电极和固定在所述电极上的复合物，所述复合物主要由金属有机框架材料和活性物质复合而成，所述活性物质由三(4,4-二羧基联吡啶)氯化钌中的羧基和聚乙烯亚胺中的氨基经酰胺化反应制得。本发明的电化学发光传感器可以用于定量检测溶液中的烟碱，用于定量检测溶液中的烟碱时，具有检测时间短，操作简单的优点，并且具有较高的检测精度、良好的灵敏度和选择性。良好的灵敏度和选择性。良好的灵敏度和选择性。


技术研发人员：李鹏 周健 王丁众 秦瑞琳 徐秀娟 付英杰 孙世豪 宗永立 张炜宸 孙文倩 周梦莎
受保护的技术使用者：中国烟草总公司郑州烟草研究院
技术研发日：2023.04.10
技术公布日：2023/8/21