一种改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法与流程

1.本发明涉及护理技术领域，特别是一种改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法。


背景技术：

2.母乳是产后女性乳房产生的用作哺育婴儿的汁液，母乳内含有乳铁蛋白、碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、脂肪酸和牛磺酸等营养物质。母乳喂养是新生儿降生初期最主要的营养物质来源。
3.目前，主要通过饮食对孕妇肠道微生物及母乳中的营养物质进行影响和调节，但是孕妇作为特殊人群，存在诸多的饮食禁忌，稍有不慎不仅对孕妇产生危害还会影响腹中胎儿。目前急需一种通过饮食以外的因素改善孕妇肠道微生物和母乳成分的方法。
4.因鉴于此，特提出此发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种通过饮食以外的因素改善孕妇肠道微生物和母乳成分的方法。
6.为了实现上述目的，本发明提供了一种改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，所述方法为使孕产妇作为主养人饲养宠物从孕前持续到产后，且每天与宠物接触。
7.优选或可选地，所述宠物为带毛宠物。
8.优选或可选地，其特征在于，所述带毛宠物为猫科宠物和/或犬科宠物。
9.优选或可选地，其特征在于，所述与宠物接触的方式为和宠物处于同一房间内。
10.优选或可选地，其特征在于，所述接触的时间为12-16h。
11.优选或可选地，其特征在于，所述接触还包括对宠物进行抚摸和/或拥抱。
12.有益效果
13.本发明提供的方法可以有效的改善孕产妇肠道微生物和提高母乳磷脂、赖氨酸浓度，有利于婴儿早期大脑发育和认知能力，促进婴儿生长发育。
附图说明
14.图1为p-nf组和np-nf组肠道微生物群线性判别效应量分析结果图；
15.图2为在otu水平上，p-nf组和np-nf组肠道微生物β多样性分析结果图；
16.图3为差异脂质、蛋白和氨基酸与孕产妇肠道差异菌spearman相关性分析结果图；
17.图4为在otu水平上，p-nf组和np-nf组肠道微生物在门水平分布差异对比图；
18.图5为在otu水平上，p-nf组和np-nf组肠道微生物在科水平分布差异对比图；
19.图6为在otu水平上，p-nf组和np-nf组肠道微生物在属水平分布差异对比图。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将结合说明书附图和较佳实验例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
21.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
22.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
23.实施例1
24.招募22名处于孕前期的孕妇作为实验组，本组中各孕妇均作为主养人饲养有至少一只的猫科宠物和/或犬科宠物，且本组中各孕妇保证均每天与所饲养的宠物与同一房间内进行长时间的共同生活以保证与宠物的接触时间，在最后统计时，实验组中各孕妇平均每天与宠物的接触市场为14.72h。
25.招募32名处于孕前期的孕妇作为对照组，本组中各孕妇在孕产期期间在生活环境内均未有宠物生活。
26.实验组和对照组的纳入标准均为：年龄18～35岁；单胎妊娠；入组孕周8～12周零6天(根据末次月经或b超监测)；在京居住至少5年，无孕前高血压、糖尿病、高脂血症、肝炎、肾炎、消化道疾病(慢性胃炎、肠炎、胃溃疡及十二指肠溃疡等)及感染性疾病史(肝炎、肺结核等)。孕期及孕期一个月范围内无服用抗生素记录，不抽烟或饮酒，非以辅助生育技术受孕。
27.实验组中的17人和对照组中的22人从入组至产后第42天，每日饮用一瓶相同的200ml发酵乳以补充益生菌和益生元，从而将实验组进一步的分为接触宠物+摄入发酵乳组(p-f)和接触宠物+不摄入发酵乳组(p-nf)，对照组分为不接触宠物+发酵乳组(np-f)和不接触宠物+不摄入发酵乳组(np-nf)。
28.分别在在孕早期，孕中期，孕晚期和产后42d收集实验组和对照组的母便，具体的采集方法为：从便盆中收集粪便样本，立即放入带有粪便dna稳定剂的粪便收集管中(stratec,germany)，并在-20℃保存，直到将其运送到-80℃冰箱后分析。
29.分别在产后1-5d，42
±
3d，3-6m，6-12m采集实验组和对照组的母乳，采集方法为：用香皂或洗手液洗净双手，并用干净的湿巾轻轻擦拭乳头及乳晕，上午9：00-11：00用消毒后的吸奶器吸空一侧乳房乳汁，将前乳和后乳混匀后取10毫升于无菌的离心管中，采集后暂时存放在-20℃冰箱中，24h内低温转移到-80℃冰箱。
30.上述过程获得首都医科大学附属北京地坛医院医学伦理委员会批准(2017-ky-015-02)，所有实验组和对照组孕妇均签署知情同意书。
31.实施例2
32.对于实施例1中获得的母便样品，采用ctab法提取dna，琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，并用无菌水稀释至浓度为1ng/μl。使用位于16s v4区带barcode的特异引物515f-806r和new england biolabs公司的high-fidelity pcr master mix with gc buffer酶和缓冲液，对粪便菌群16s rrna v3—v4区进行聚合酶链式反应扩增。pcr扩增包括98℃预变性；30个循环包括(98℃，10sec；50℃，30sec)；72℃，5min。根据pcr产
物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1
×
tae浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化pcr产物，选择主带大小在400-450bp之间的序列，然后使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒进行纯化，利用illumina公司truseq r dna pcr-free sample preparation kit建库试剂盒进行文库构建，文库构建完成后，通过qubit和q-pcr定量，最后通过novaseq6000进行上机测序得到母便样品菌群数据。
33.实施例3
34.对于实施例1中获得的母乳样品，采用sds法提取dna，琼脂糖凝胶电泳检测dna的纯度和浓度，并用无菌水稀释至浓度为1ng/μl。使用位于16s v4区带barcode的特异引物515f-806r和new england biolabs公司的high-fidelity pcr master mix with gc buffer酶和缓冲液，对母乳菌群16s rrna v3—v4区进行聚合酶链式反应扩增。pcr扩增包括98℃预变性；30个循环包括(98℃，10sec；50℃，30sec)；72℃，5min。根据pcr产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1
×
tae浓度2％的琼脂糖胶电泳纯化pcr产物，选择主带大小在400-450bp之间的序列，然后使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒进行纯化，利用illumina公司truseq r dna pcr-free sample preparation kit建库试剂盒进行文库构建，文库构建完成后，通过qubit和q-pcr定量，最后通过novaseq6000进行上机测序得到母乳样品菌群数据。
35.实施例4
36.配制浓度为1mm醋酸铵的甲醇：二氯甲烷(1:1,v/v)溶液为重建液。在200μl实施例1中获得的母乳样品中添加20μl 10.38mg/l pc17:0-14:1、20μl 9.64mg/l pe17:0-14:1、20μl 10.00mg/l sm35:1、8μl 10.22mg/l pi17:0-14:1、4μl 9.81mg/l pg17:0-14:1、4μl 10.00mg/l cer42:2、20μl 4000mg/l d5-tag54:3内标。第一次用超纯水200μl、甲醇2ml、二氯甲烷900μl提取，第二次用超纯水200μl、二氯甲烷900μl提取。混合物在6000rpm下离心15min，然后分离有机相和水相。有机相与超纯水1ml、甲醇2.2ml、二氯甲烷600μl混合，3000
×
g离心10min，分离并移液。将水相与1.8ml二氯甲烷混合，以6000转/分的速度离心15分钟，分离并移液所有有机相。合并所有有机相，氮气吹干，然后用1ml重建液复溶，即得脂质样品。
37.取50μl脂质样品用重建液稀释1000倍后直接用于通过uplc-q-tof测定样品中的甘油酯。
38.将1ml脂质样品倒入到已通过3ml正己烷活化并弃去洗脱液的硅胶柱(proelut silica(1g/6ml cat no:63006))中，静置5min进行吸附，吸附完成后，先依次加入3ml正己烷/二乙醚(8:2,v/v)和3ml正己烷/二乙醚(1:1,v/v)混合液，并弃去洗脱液，然后再依次加入4ml甲醇、2ml甲醇和2ml二氯甲烷/甲醇/水(3:5:2,v/v/v)混合液，收集合并洗脱液，氮气吹干后，用200μl重建液复溶，即可通过uplc-q-tof测定样品中的磷脂。
39.后续uplc-q-tof检测，使用的液相色谱柱为phenomenex,2.6um c18并以规格为150
×
4.6mm的液相色谱柱分离磷脂，以规格为50
×
3mm的液相色谱柱分离甘油。色谱条件为进样量2μl，流速0.8ml/min，柱温30℃。以5mm醋酸铵在水/甲醇/乙腈(1:1:1,v/v/v)溶液为流动相a,5mm醋酸铵在异丙醇溶液为流动相b。
40.磷脂的梯度洗脱条件
[0041][0042]
甘油酯的梯度洗脱条件
[0043][0044]
实施例5
[0045]
采用盐酸-甲醇法使实施例1中获得的母乳样品中的脂肪酸甲酯化，然后于-20℃下保存以便进行gc-ms检测。
[0046]
采用hp-88气相色谱柱(100m
×
0.25mm，0.20μm)，初始温度60℃，保持5min，以8℃/min升至160℃，然后以4℃/min升至200℃，保持5min，最后以3℃/min升至240℃，保持5min。用thermo scientific triplus rsh自动进样器，条件为进样口温度200℃，1ml/min流速，进样量1μl，分流比10:1，n2载气。采用电子轰击离子源，条件为离子源温度280℃，传输线温度240℃，四级杆温度150℃，四级杆质量扫描范围为m/z 35-400。根据脂肪酸甲酯的质谱特征离子和保留时间进行定性分析，根据已知质量的脂肪酸甲酯混标进行定量分析，得到母乳样品的脂肪酸组成数据。
[0047]
实施例6
[0048]
将实施例1中获得的母乳样品300μl与10％磺基水杨酸20μl混合于1.5ml试管中，在4℃、9408g下离心15min，经0.22μm超滤膜过滤。滤液10μl与70μl硼酸缓冲液(0.4m)、20μl accq-fluor混合在uplc管中，在55℃孵育10分钟，然后冷却到环境温度进行超高效液相色谱法(uplc)分析，取1μl注入uplc系统，在260nm处用光电二极管阵列(pda)检测器检测，流动级使用的溶剂是制造商提供的accq-tag ultra eluent a和accq-tag ultra eluent b。uplc梯度程序(a＝accq-tag ultra eluent a,b＝10％accq-tag ultra eluent b,c＝水，d＝accq-tag ultra eluent b)。
[0049]
效果实施例1
[0050]
使用r语言(4.0.5)进行数据分析。其中，多样性指数使用r包vegan对otu矩阵进行抽平，并计算物种α多样性指数，包括ace指数、chao1指数、shannon指数。使用r包microeco将otu矩阵转换成相对丰度矩阵并计算lefse。为评估样本间物种多样性差异，使用r语言计算了样本间otu矩阵的集合距离，基于此进行柱坐标分析(pcoa)获取主坐标。通过非参数kruskal-wallis(kw)检验比较优势分类群的中位数丰富度、多样性和相对丰富度，然后通过mann-whitney u检验对实验组和对照组菌群进行比较。结果图1-2所示。
[0051]
由图1-2可知，在otu水平上，β多样性分析显示p-nf的微生物组与np-nf有显著差异，p-f组相较于np-f组显著增加了barnesiellaceae、ruminococcaceae和sutterellaceae(在科水平上)以及barnesiella(在属水平上)的相对丰度。
[0052]
在otu水平上，如图4-6所示，β多样性分析显示p-nf的微生物组与np-nf有显著差异，且p-nf组与np-nf组比较，在proteobacteria和verrucomicrobia(门水平)和lostridiaceae、sutterellaceae、enterobacteriaceae和akkermansiaceae(科水平)以及parabacteroides、clostridium和akkermansia(属水平)的相对丰度显著增加，而
megamonas、ruminococcus和veillonella的相对丰度显著降低。
[0053]
效果实施例2
[0054]
对实施例1提供的实验组和对照组的初乳、过渡乳、成熟乳和晚乳脂质进行定量分析，结果如表1至3所示。由表1-3可知，在p-f组中16种差异磷脂的浓度均显著高于np-f组。在过渡乳中定量了20种氨基酸，其中p-f组中赖氨酸浓度显著高于np-f组。在初乳和过渡乳中定量了8种蛋白，其中p-f组中cns2浓度显著高于np-f组(p《0.05)。
[0055]
[0056][0057]
表1p-f组和np-f组磷脂分析结果表
[0058]
[0059][0060]
表2p-f组和np-f组氨基酸分析结果表
[0061][0062]
表3p-f组和np-f组蛋白质分析结果表
[0063]
效果实施例3
[0064]
如图3所示，将母乳中差异脂质、蛋白和氨基酸与孕产妇肠道差异菌做spearman相关性分析。发现sutterellaceae与pe34:1、pe38:3正相关，且p-f组中sutterellaceae丰度、pe34:1、pe38:3浓度均显著高于np-f组。
[0065]
综上所述，采用本发明所述的方法，可以显著的增加孕产妇肠道中的有益菌菌群种类和丰度，同时提高母乳中磷脂、氨基酸、蛋白质的含量。根据现有的文献，本发明所述方法提高的孕妇肠道中verrucomicrobiota菌群的丰度可以有效的降低婴幼儿的超重肥胖率；而降低孕妇肠道中megamonas菌群的丰度，可以有效的降低婴幼儿发生神经发育障碍相关疾病的风险；进一步的，本发明所述的方法还可以显著提高母乳中磷脂pe34:1、pe38:3的含量以及氨基酸lys的含量，高pe34:1、pe38:3的含量有助于促进婴幼儿中枢神经系统的生长发育，而lys则可以促进婴幼儿的生长发育；即本发明所述的方法有利于婴儿早期大脑发育和认知能力，促进婴儿生长发育。因此，本发明所述的方法具备良好的应用前景。
[0066]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，其特征在于，所述方法为使孕产妇作为主养人饲养宠物从孕前持续到产后，且每天与宠物接触。2.根据权利要求1所述的改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，其特征在于，所述宠物为带毛宠物。3.根据权利要求2所述的改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，其特征在于，所述带毛宠物为猫科宠物和/或犬科宠物。4.根据权利要求1所述的改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，其特征在于，所述与宠物接触的方式为和宠物处于同一房间内。5.根据权利要求4所述的改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，其特征在于，所述接触的时间为12-16h。6.根据权利要求4所述的改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，其特征在于，所述接触还包括对宠物进行抚摸和/或拥抱。

技术总结
本发明提供了一种改善孕产妇肠道微生物和提高母乳中磷脂、赖氨酸浓度的方法，所述方法为使孕产妇作为主养人饲养宠物从孕前持续到产后，且每天与宠物接触。发明提供的方法可以有效的改善孕产妇肠道微生物和提高母乳磷脂、赖氨酸浓度，有利于婴儿早期大脑发育和认知能力，促进婴儿生长发育。促进婴儿生长发育。


技术研发人员：陈历俊 杨迪 赵军英 刘彦品 刘茜 乔为仓
受保护的技术使用者：北京三元食品股份有限公司
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/21