一种化学修饰吡喃糖氧化酶的方法与流程

1.本发明属体外诊断领域，具体来说是一种化学修饰吡喃糖氧化酶的方法，能用于制造1,5-脱水-山梨醇的定量检测试剂盒。


背景技术：

2.吡喃糖氧化酶(pyranose oxidase，ec 1.1.3.10) 能催化吡喃糖在2号碳原子上发生氧化反应，并生成2-酮基类衍生物和过氧化氢。使得吡喃糖氧化酶可直接可测定血清中的葡萄糖。
3.目前，测定血清中1,5-脱水-山梨醇(1,5-ag)是吡喃糖氧化酶在诊断领域最主要的应用方向，1,5-ag是一个用于糖尿病诊断和血糖监控指标，1,5-ag水平的下降与血液中葡萄糖浓度存在密切关系，并能反应患者在一定时间内的血糖波动情况。该指标能应用于糖尿病早期筛查和血糖监控，并能指导临床用药，具有广阔的市场前景。
4.1,5-ag在血清中的含量为umol/l级，其测定结果在69umol/l以下时报告为异常，所以低值样本的测定准确性非常重要，将直接决定检测试剂的质量；另外由于吡喃糖氧化酶能同时反应血清中的葡萄糖和1,5-ag，在测试时需要预先利用己糖激酶将样本中的葡萄糖进行“消除”，再使样本中的1,5-ag在吡喃糖氧化酶的作用下进行下一步反应。而通常糖尿病人的血糖较高，有时试剂盒的抗干扰能力不能完全“消除”葡萄糖的干扰，上述两项原因给1,5-ag低值样本的测定准确性带来困难，通常表现为测定低值样本时cv值偏高，结果重复性差。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种化学修饰吡喃糖氧化酶的方法，经本方法修饰的吡喃糖氧化酶，能应用于血清1,5-脱水-山梨醇的定量检测，有增加低值样本检测准确性和稳定性的能力。
6.本发明的具体内容如下：一种化学修饰吡喃糖氧化酶的方法，其特征是，以叔丁基甲基醚作为溶剂，使用丁二酸酐、甲基琥珀酸酐或马来酸酐对吡喃糖氧化酶进行化学修饰；所述的修饰方法包括以下步骤：（1）用叔丁基甲基醚作为溶剂将固体吡喃糖氧化酶溶解为0.2mg/ml的溶液,于4℃保存；（2）用无水叔丁基甲基醚作为溶剂将丁二酸酐、甲基琥珀酸酐或马来酸酐中的一种配制为1mg/ml的溶液，于-20℃保存；（3）将吡喃糖氧化酶溶液与酸酐溶液按50:1至100:1的体积比混合，在25℃孵育2小时；（4）用旋转蒸发仪除去溶剂叔丁基甲基醚，再将固体重新溶解于ph 8.0的50mm tris-hcl溶液中。
具体实施方式
7.需要说明的是，以下实施例中所述内容并不限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所做等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。若无特殊说明，以下实施例中所使用的化学品均购自萨恩化学技术(上海)有限公司；酶原料采购自深圳市迈博生物科技有限公司。
8.实施例一：吡喃糖氧化酶活性测定方法按以下步骤测定吡喃糖氧化酶活性：（1）按以下配方配制反应溶液50 mm tris-hcl ph 8.04 mm 葡萄糖1mm toos1mm 4-氨基安替比林20u/ml hrp（2）按以下配方配制酶稀释液10 mm tris-hcl ph 8.00.9 wt% nacl0.01% tween-200.03% 牛血清白蛋白；（3）用步骤（2）中配制的酶稀释液将吡喃糖氧化酶冻干粉溶解，并稀释至200ug/ml；（4）取两份3ml步骤（1）中配制的反应溶液分别加入至2个石英比色皿中，在25℃孵育3min，一份加入50ul步骤（3）中配制的己糖激酶酶溶液，另一份加入50ul步骤（2）所配制的酶稀释液作为空白对照；（5）将2个比色皿在25℃孵育300s，并记录540 nm吸光度变化，按以下公式计算己糖激酶酶活性：15.6：toos~4-aa在550nm波长的摩尔消光系数（cm2/micromole）t：反应时间（min）3.05：总反应体积（ml）0.05：样本体积（ml）x：酶浓度（mg/ml）实施例二：吡喃糖氧化酶km值测定方法用lineweaver-burk双倒数图法测定吡喃糖氧化酶km值，具体步骤如下：（1）按以下配方配制km值反应溶液50 mm tris-hcl ph 8.01mm toos1mm 4-氨基安替比林20u/ml hrp
（2）将反应液分为6份，分别加入1,5-脱水-d-山梨醇固体，使1,5-脱水-d-山梨醇的终浓度为200umol、100umol、50umol、25umol、10umol和1umol；（3）按以下配方配制酶溶液10 mm tris-hcl ph 8.00.9 wt% nacl0.01% tween-200.03% 牛血清白蛋白0.1mg/ml 吡喃糖氧化酶（4）用步骤（2）中配制的6个km值反应溶液和步骤（3）配制的酶溶液中按2ml:0.05ml在石英比色皿中混合，在37℃孵育300s，在到达反应时间后立即加入1ml 2m naoh终止反应，并记录546nm的吸光度；（5）将六个实验结果以“1/吸光度”对“1/底物浓度”作图，直线与x轴交点即为-1/km。
9.实施例三：化学修饰吡喃糖氧化酶按以下步骤对吡喃糖氧化酶进行化学修饰：（1）用无水叔丁基甲基醚作为溶剂将固体吡喃糖氧化酶溶解为0.2mg/ml的溶液；（2）用无水叔丁基甲基醚作为溶剂将丁二酸酐、甲基琥珀酸酐或马来酸酐中的一种配制为1mg/ml的溶液，于-20℃保存；（3）将吡喃糖氧化酶溶液与酸酐溶液种的一种，按50:1至100:1的体积比混合，在25℃静置2小时；（4）用旋转蒸发仪除去溶剂叔丁基甲基醚，再将固体重新溶解于ph 8.0的50mm tris-hcl溶液中。
10.得到3种化学修饰的吡喃糖氧化酶，用实施例一和实施例二的方法吡喃糖氧化酶的酶活性和km值进行测定，结果如表1所示。
11.可以看出，经过化学修饰后，吡喃糖氧化酶的酶活力有小幅下降，单其对底物1,5-脱水-d-山梨醇的km值明显变小，表明吡喃糖氧化酶对底物的亲和力大幅提高；其中，经过甲基琥珀酸酐修饰后，酶活力降低最少，km值最低，修饰效果最好。
12.表1 经过化学修饰后吡喃糖氧化酶的酶活力和km值。
[0013][0014]
（1）按以下配方配制1,5-脱水-山梨醇测定r1试剂100 mm hepes ph 7.8
75mm kcl0.9% nacl5 mm mgcl20.2 wt% peg 20000.5 wt% tween-207.5mm atp5 mm 磷酸烯醇式丙酮酸25 u/ml 己糖激酶40 u/ml 丙酮酸激酶2 mm toos（2）按以下配方配制1,5-脱水-山梨醇测定r2试剂150 mm hepes ph 7.80.9% nacl0.2wt% peg 20000.5wt% tween-2010 u/ml 过氧化氢酶hrp45 u/ml 吡喃糖氧化酶15 mm 4-氨基安替比林用4种不同的吡喃糖氧化酶配制1,5-脱水-山梨醇检测试剂盒，按r1:r2:s=180:60:10在全自动生化仪上进行测定，测定10个临床血清样本，每个样本测定10次，并对试剂盒性能进行验证，10次测定的平均结果和cv值如表2所示。
[0015]
结果表明，使用未经过化学修饰的吡喃糖氧化酶，在测定低值样本（＜70 umol/l）时，测定结果不准确，重复性较差，cv%值超过5%；而使用经过化学修饰的吡喃糖氧化酶，测定结果明显准确，重复性好，其中，使用甲基琥珀酸酐修饰的吡喃糖氧化酶，效果最佳，所有样本cv＜2%。
[0016]
表2 经过不同化学修饰的吡喃糖氧化酶用于1,5-ag检测试剂效果。
[0017]

技术特征：
1.一种化学修饰吡喃糖氧化酶的方法，其特征是，以叔丁基甲基醚作为溶剂，使用丁二酸酐、甲基琥珀酸酐或马来酸酐对吡喃糖氧化酶进行化学修饰。2.如权利要求1所述的化学修饰吡喃糖氧化酶的方法，其特征是，修饰的过程包括以下步骤：（1）用叔丁基甲基醚作为溶剂将固体吡喃糖氧化酶溶解为0.2mg/ml的溶液；（2）用无水叔丁基甲基醚作为溶剂将丁二酸酐、甲基琥珀酸酐或马来酸酐中的一种配制为1mg/ml的溶液；（3）将吡喃糖氧化酶溶液与酸酐溶液按50:1至100:1的体积比混合，在25℃孵育2小时；（4）用旋转蒸发仪除去溶剂，再将固体酶重新溶解于ph 8.0的50mm tris-hcl溶液中。

技术总结
本发明属体外诊断技术领域，具体来说是提供了一种化学修饰吡喃糖氧化酶的方法，能应用于血清1,5-脱水-山梨醇的定量检测，其特征是，以叔丁基甲基醚作为溶剂，使用丁二酸酐、甲基琥珀酸酐或马来酸酐对吡喃糖氧化酶进行化学修饰。相比于未经化学修饰的吡喃糖氧化酶，经过化学修饰的吡喃糖氧化酶对1,5-脱水-山梨醇的亲和力更强，Km值更低。使用经过化学修饰的吡喃糖氧化酶制造的1,5-脱水-山梨醇测定试剂盒，在测定低值样本时的稳定性更强，CV值大幅降低。降低。


技术研发人员：刘佳龙 张伯平 张远 徐雪婷
受保护的技术使用者：深圳市安帝宝科技有限公司
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/8/21