植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌在降解水果石细胞中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌在降解水果石细胞中的应用。


背景技术：

2.我国梨品质不高，石细胞含量多，果肉硬化，果皮厚，含糖量低
3.，进一步导致加工制成的梨汁口感差、易形成沉淀颗粒物，并且，梨汁久置而产生的沉淀就是因为梨果肉含有许多坚硬颗粒集合成簇的石细胞
1.，因此，石细胞数量多少已然成为了判断梨汁品质优劣的一个重要指标
2.。且改善梨汁的风味和品质均亟待提高
4.。
3.石细胞是由薄壁组织的细胞在石细胞初生壁上的次生壁不断沉积而形成的厚壁组织细胞
5.，石细胞的主要组分为木质素、纤维素和半纤维素，其中，纤维素的形成与石细胞的形成和发育有着密切的关系
6.。纤维素是一种链状高分子聚合物，由d-葡萄糖以β-1，4糖苷键结合起来的链状聚合体，多个纤维素分子平行排列成纤维束。纤维素中的三大元素含量比例约为碳44.44％、氢6.17％及氧49.39％
7.。一般，可以将纤维素按照聚集状态分成结晶区和非定形区。其中，结晶区分子排列紧密，很难降解；而非定形区分子间距较大，容易降解。但是，结晶区和非定型区之间交错分布，无明显的界限
8.。此外，纤维素之间也存在着氢键，这种键的存在严重阻碍了纤维素的水解
9.，这也是梨汁中纤维素难以降解导致果汁品质低、口感差的原因，因此，开发一种具有高效纤维素酶活的纤维素降解菌混菌体系对减少石细胞的形成，进而提高梨汁品质具有重要意义。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌在降解水果石细胞中的应用。本发明将植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌联合使用后，菌株的产纤维素酶的能力得到的显著提高，能够降低石细胞的含量，对提高梨汁品质有重要意义。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌的混合菌剂在降解水果石细胞中的应用，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。
7.本发明提供了包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌的混合菌剂在降解水果纤维素中的应用，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。
8.优选的，所述水果包括梨。
9.本发明提供了一种用于降解水果石细胞的生物降解剂，所述生物降解剂的有效成分包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌；所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。
10.本发明提供了上述技术方案所述的生物降解剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将植物乳杆菌菌悬液接种于mrs肉汤培养基中第一摇床培养，得预培养基；将马克斯克鲁维酵母菌菌悬液接种于预培养基中第二摇床培养，得生物降解剂；所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。
11.优选的，所述植物乳杆菌菌悬液的菌活为6～7lg cfu/ml；所述植物乳杆菌菌悬液的接种量为mrs肉汤培养基体积的2％。
12.优选的，所述马克思克鲁维酵母菌菌悬液的菌活为5～6lg cfu/ml；所述马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的接种量为预培养基体积的2％。
13.优选的，所述第一摇床培养的时间为24h，温度为30℃，转速为120r/min。
14.优选的，第二摇床培养的时间为72h，温度为30℃，转速为120r/min。
15.本发明提供了一种降解水果汁中石细胞或制备发酵果汁的方法，所述方法包括以下步骤：
16.将水果汁与所述生物降解剂混合发酵。
17.有益效果：本发明提供了包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌的混合菌剂在降解水果石细胞中的应用，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。本发明将植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌联合使用后，马克思克鲁维酵母菌对植物乳杆菌具有促进作用，使得两株菌的产纤维素酶的能力得到的显著提高，能够降低石细胞的含量；由此可见，植物乳杆菌jylp-326和马克思克鲁维酵母菌共发酵，达到了降解石细胞的效果。本发明具体实施例结果表明：将植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌混合使用对纤维素的降解率达到了20.35％；并且通过扫描电镜、傅里叶红外光谱证明，植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌混合使用后能够使石细胞的表观结构受到损坏，改变石细胞的化学结构，使得石细胞的降解效果更加明显。因此，本发明不仅为构建高效快捷的纤维素降解技术提供理论支撑，而且能够为我国梨及梨果制品产业提供技术指导，从而提高梨果制品的品质，推动梨和梨汁产业繁荣发展，助力果农增产增收。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
19.图1为葡萄糖的标准曲线；
20.图2为不同植物乳杆菌对滤纸条的崩解情况；
21.图3为纤维素的标准曲线；
22.图4为发酵前后石细胞中纤维素含量的变化情况；
23.图5为发酵后扫描电镜500倍下的石细胞；
24.图6为发酵后扫描电镜2000倍下的石细胞；
25.图7为发酵后扫描电镜5000倍下的石细胞；
26.图8为发酵前扫描电镜500倍下的石细胞；
27.图9为发酵前扫描电镜2000倍下的石细胞；
28.图10为发酵前扫描电镜5000倍下的石细胞；
29.图11为发酵前后石细胞的傅里叶红外光谱图。
具体实施方式
30.如无特殊要求，本发明所用组分和菌株均为本领域技术人员常规购买所得即可。
31.本发明提供了植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌在降解水果石细胞中的应用，进一步本发明还提供了植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌在降解水果纤维素中的应用；所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。本发明所述水果优选包括梨。本发明对所述植物乳杆菌jylp-326和马克思克鲁维酵母菌的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买即可；在本发明具体实施例中，所述植物乳杆菌jylp-326优选购自山东中科嘉亿生物工程有限公司，所述马克思克鲁维酵母菌优选购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
32.本发明将植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌联合使用，其中马克思克鲁维酵母菌对植物乳杆菌具有促进作用；因此，两株菌的产纤维素酶的能力更强，对纤维素的降解率达到了20.35％，进而达到减少石细胞形成的效果。
33.基于上述植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌联合使用的优势，本发明提供了一种用于降解水果石细胞的生物降解剂，所述生物降解剂的有效成分包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌；所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。本发明所述水果优选包括梨。
34.本发明提供了上述技术方案所述生物降解剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
35.将植物乳杆菌菌悬液接种于mrs肉汤培养基中第一摇床培养，得预培养基；将马克斯克鲁维酵母菌菌悬液接种于预培养基中第二摇床培养，得生物降解剂。
36.本发明将植物乳杆菌菌悬液接种于mrs肉汤培养基中第一摇床培养，得预培养基。本发明所述植物乳杆菌jylp-326菌悬液的接种量优选为于mrs肉汤培养基体积的2％；植物乳杆菌jylp-326菌悬液的菌活优选为6.3lg cfu/ml；所述第一摇床培养的时间优选为24h；温度优选为30℃；转速为120r/min。本发明所述植物乳杆菌菌悬液的制备方法没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
37.得预培养基后，本发明将马克斯克鲁维酵母菌菌悬液接种于预培养基中第二摇床培养，得到生物降解剂。本发明马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的接种量优选为预培养基体积的2％；所述马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的活菌数优选为5.3lg cfu/ml；所述第二摇床培养的时间优选为72h；温度优选为30℃；转速为120r/min。本发明所述马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的制备方法没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
38.本发明提供了一种降解水果汁中石细胞或制备发酵果汁的方法，所述方法包括以下步骤：
39.将水果汁与所述生物降解剂混合发酵。
40.本发明将水果汁与所述生物降解剂混合发酵。本发明已经在前述对所述生物降解剂进行了详细的描述，因此，在此不再赘述。本发明对所述水果汁与生物降解剂的比例没有任何限定，采用任意比例即可。本发明对所述发酵的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
41.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
42.下述实施例中使用的试验菌株和部分试剂如下：
43.试验菌株：
44.植物乳杆菌jylp-326，购于山东中科嘉亿生物工程有限公司；
45.植物乳杆菌cicc 24435和植物乳杆菌cicc 24437购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；
46.马克思克鲁维酵母菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cicc 32015。
47.鸭梨：河北省保定市农贸市场。
48.试验试剂：
49.dns试剂：称取3,5-二硝基水杨酸3.15g，加水500ml搅拌溶解，水浴至45℃，然后逐步加入100ml浓度为200g/l的naoh溶液，同时不断搅拌，直至完全溶解，再依次加入酒石酸钾钠91g，苯酚2.5g和亚硫酸钠2.5g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至1000ml，过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避光保存后，7d后使用；
50.浓度为0.05mol/l的柠檬酸盐缓冲溶液：称取柠檬酸10.5g，加入氢氧化钠5.0g，再加入800ml水溶解，用浓度为0.1mol/l的柠檬酸溶液或浓度为0.1mol/l柠檬酸钠溶液调节ph至5.5，再用水定容至1000ml；
51.浓度为10mg/ml的葡糖糖标准溶液：称取经105℃烘至恒重的无水葡糖糖约1g，加入柠檬酸盐缓冲液溶解，定容至100ml。
52.试验培养基：
53.mrs肉汤培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母浸粉5g，牛肉浸粉10g，柠檬酸铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，吐温80 1ml，蒸馏水1000ml，ph 6.2
±
0.2，121℃灭菌15min；
54.ypd培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母浸粉10g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌15min；
55.石细胞液体发酵培养基：石细胞20g，蛋白胨10g，牛肉浸粉10g，酵母浸粉5g，柠檬酸铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1ml，蒸馏水1000ml，ph 6.7
±
0.2，121℃灭菌15min，该培养基中的石细胞为参考ny/t 1388-2007的方法提取鸭梨里的石细胞。
56.实施例1
57.采用滤纸崩解法定性鉴定菌株降解纤维素的能力，根据程鑫等人的实验方法(程鑫.乳酸菌发酵对糙米蒸煮食用品质改良效果的研究[d].江南大学,2018.)配制滤纸培养基，吸取0.2ml od值为1.0的植物乳杆菌jylp-326菌悬液加入到滤纸培养基中；
[0058]
其中，od值为1.0的植物乳杆菌jylp-326菌悬液的制备方法为：将储存于-80℃的植物乳杆菌jylp-326菌株接种到灭菌了的mrs肉汤培养基中，于37℃的生化培养箱中进行培养24h，得活化好的植物乳杆菌jylp-326；将活化好的植物乳杆菌jylp-3265000r/min离心10min，去掉上清液，将菌体重悬于pbs缓冲液中，混匀，5000r/min离心10min，取上清，重复“重悬-离心-取上清”两次，之后将菌体重悬于pbs缓冲液中，并用pbs缓冲液将菌悬液调至od值为1，该菌悬液中植物乳杆菌jylp-326菌的菌活为6.3lg cfu/ml。
[0059]
对比例1
[0060]
与实施例1步骤相同，区别在于，采用的是0.2ml od值为1.0的植物乳杆菌cicc 24435菌悬液替换植物乳杆菌jylp-326菌悬液；
[0061]
其中，od值为1.0的植物乳杆菌cicc 24435菌悬液的制备方法为：将活化好的植物乳杆菌cicc 24435菌5000r/min离心10min，去掉上清液，将菌体重悬于pbs缓冲液中，混匀，5000r/min离心10min，取上清，重复该步骤两次，之后将菌体重悬于pbs缓冲液中，并用pbs缓冲液将菌悬液调至od值为1，该菌悬液中植物乳杆菌cicc 24435菌的菌活为6.3lg cfu/ml。
[0062]
对比例2
[0063]
与实施例1步骤相同，区别在于，采用的是0.2ml od值为1.0的植物乳杆菌cicc 24437菌悬液替换植物乳杆菌jylp-326菌悬液；
[0064]
其中，od值为1.0的植物乳杆菌cicc 24437菌悬液的制备方法为：将活化好的植物乳杆菌cicc 24437菌5000r/min离心10min，去掉上清液，将菌体重悬于pbs缓冲液中，混匀，5000r/min离心10min，取上清，重复“重悬-离心-取上清”两次，之后将菌体重悬于pbs缓冲液中，并用pbs缓冲液将菌悬液调至od值为1，该菌悬液中植物乳杆菌cicc 24437菌的菌活为6.3lg cfu/ml。
[0065]
测试例1
[0066]
以未接种菌株的滤纸培养基为空白对照，将空白对照、实施例1和对比例1～2得到的滤纸培养基在37℃、120r/min条件下震荡培养72h，观察滤纸崩解效果。由于滤纸条崩解实验可以综合反映菌株分泌纤维素酶的能力，因此本实验对三株植物乳杆菌进行了滤纸崩解试验来鉴定菌株是否具有降解纤维素的能力，试验结果如图1所示，图1中的试管从左到右依次为空白对照、实施例1、对比例1、对比例2的崩解结果。
[0067]
由图1可以得出：与未接种菌株的空白对照组相比，实施例和对比例1～2的试管变得浑浊并发现滤纸条出现孔洞和断裂现象，均能降解纤维素，因此这三株植物乳杆菌可以进行下一步的研究。
[0068]
实施例2
[0069]
将实施例1制备得到的植物乳杆菌jylp-326菌悬液接种于mrs肉汤培养基中，接种量为于mrs肉汤培养基体积的2％，植物乳杆菌jylp-326菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，30℃摇床培养24h，转速为120r/min，得到预培养基，再将马克斯克鲁维酵母菌菌悬液接种于预培养基中，接种量为预培养基体积的2％，马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的活菌数为5.3lg cfu/ml，30℃摇床培养，转速为120r/min，每24h取一次样，共取3次，即发酵48h、72h和96h取样，将不同发酵时间的样品分别在8000rpm、4℃离心10min，取上清液，即为粗酶液，将粗酶液储存于-20℃，备用，记为326m；
[0070]
其中，马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的制备方法为：将储存于-80℃的马克斯克鲁维酵母菌菌株接种到灭菌了的ypd培养基中，于28℃的生化培养箱中进行培养24h，得活化好的马克斯克鲁维酵母；将活化好的马克斯克鲁维酵母5000r/min离心10min，去掉上清液，将菌体重悬于pbs缓冲液中，混匀，5000r/min离心10min，取上清，重复“重悬-离心-取上清”两次，之后将菌体重悬于pbs缓冲液中，并用pbs缓冲液将菌悬液调至od值为1，马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc 32015。
[0071]
对比例3
[0072]
将实施例1制备得到的植物乳杆菌jylp-326菌悬液接种于mrs肉汤培养基中，接种量为于mrs肉汤培养基体积的2％，植物乳杆菌jylp-326菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，30℃摇床培养96h，培养24h后，每24h取样，共取3次，即发酵48h、72h和96h取样，将不同发酵时间的样品分别在8000rpm、4℃离心10min，取上清液，得到粗酶液，备用，记为326。
[0073]
对比例4
[0074]
与对比例3步骤相同，区别在于，采用的是对比例1制备得到的植物乳杆菌cicc 24435菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc24435菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为435。
[0075]
对比例5
[0076]
与实施例2步骤相同，区别在于，采用对比例1制备得到的植物乳杆菌cicc 24435菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc 24435菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为435m。
[0077]
对比例6
[0078]
与对比例3步骤相同，区别在于，采用的是对比例2制备得到的植物乳杆菌cicc 24437菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc24437菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为437。
[0079]
对比例7
[0080]
与实施例2步骤相同，区别在于，采用对比例2制备得到的植物乳杆菌cicc 24437菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc 24437菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为437m。
[0081]
测试例2
[0082]
对实施例2和对比例3～7制备的粗酶液的纤维素酶活进行测定，具体测定方法如下：
[0083]
1、葡萄糖标准曲线的制作：
[0084]
取7支试管，分别向其中加入0、2、3、4、6、8、10ml浓度为10mg/ml的标准葡萄糖溶液，然后分别用柠檬酸盐缓冲溶液定容至50ml，配成浓度为0～2mg/ml的葡萄糖溶液；
[0085]
分别吸取已配置好的不同浓度的葡糖糖标准溶液1.0ml于25ml容量瓶中，各加2ml水和2ml dns试剂，沸水浴5min，冷却至室温，用水定容至25ml，在540nm波长处测定吸光度，以葡糖糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制作葡萄糖标准曲线，获得线性回归方程，如图1所示，回归方程具体为：y＝1.0954x+0.0082，r2＝0.9984。
[0086]
2、纤维素酶活力测定，纤维素酶测定的指标包括滤纸酶活、内切葡聚糖酶活力、外切葡聚糖酶活力和β-葡萄糖苷酶活力，酶活力单位定义：在1min内每毫升酶液催化底物生成1μmol萄糖所需要的酶量，即1u/ml；
[0087]
采用滤纸酶活力的测定方法进行测定：参考gb/t 23881-2009测定滤纸酶活，即向试管中加入50mg whatman no.1滤纸，加入1.0ml柠檬酸盐缓冲液浸润纸片作为底物，37℃平衡10min，再依次加入0.5ml粗酶液和5ml蒸馏水，震荡3s～5s，50℃恒温水浴50min，取出后加入2ml dns试剂，对照组则先在粗酶液中加入2.0mldns试剂再进行恒温水浴，摇匀后在沸水浴中煮沸10min，冷却至室温，用蒸馏水定容至25ml，以对照组调零，在540nm波长下测定吸光值，从葡糖糖标准曲线上查出相对应的葡萄糖含量，再结合酶活力公式得出相应酶
活力值；
[0088]
内切葡聚糖酶活力的测定：参考黄春凯的方法(黄春凯.一株产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及产酶特性的研究[d].长春工业大学,2015.)测定内切葡聚糖酶活并稍作修改，即向试管中加入1.5ml浓度为0.05mol/l、ph为6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配置质量百分含量为1％的cmc-na底物溶液，37℃平衡10min，再向试管中加入0.5ml粗酶液，50℃恒温水浴50min后，取出后加入2mldns试剂，对照组先在粗酶液加入2ml dns试剂再进行恒温水浴，摇匀后在沸水浴中煮沸10min，冷却至室温，用蒸馏水定容至20ml，以对照组调零，在540nm波长下测定吸光值，从葡糖糖标准曲线上查出相对应的葡萄糖含量，计算酶活力；
[0089]
外切葡聚糖酶活力的测定：参考吴静的方法(吴静.高产纤维素酶霉菌的筛选及纤维素酶系的分离纯化[d].贵州大学,2020.)测定外切葡聚糖酶活并稍作修改，即向试管内加入1.5ml浓度为0.05mol/l、ph为6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配置质量百分含量为1％的微晶纤维素底物溶液，37℃平衡10min，再向试管中加入0.5ml粗酶液，50℃很温水浴50min后，取出后加入2ml dns试剂对照组先在粗酶液中加入2ml dns试剂再进行恒温水浴，摇匀后在沸水浴中煮沸10min，冷却至室温，用蒸馏水定容至20ml以对照组调零，在540nm波长下测定吸光值，从葡糖糖标准曲线上查出相对应的葡萄糖含量，计算酶活力；
[0090]
β-葡萄糖苷酶活力的测定：参考吴静的方法(吴静.高产纤维素酶霉菌的筛选及纤维素酶系的分离纯化[d].贵州大学,2020.)测定β-葡萄糖苷酶活并稍作修改，即向试管内加入1.5ml浓度为0.05mol/l、ph为6.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，配置质量百分含量为1％的水杨苷底物溶液，37℃平衡10min，再向试管中加入0.5ml粗酶液，50℃很温水浴50min后，取出后加入2ml dns试剂，对照组先在粗酶液中加入2ml dns试剂再进行恒温水浴，摇匀后在沸水浴中煮沸10min，冷却至室温，用蒸馏水定容至20ml，以对照组调零，在540nm波长下测定吸光值，从葡糖糖标准曲线上查出相对应的葡萄糖含量，计算酶活力；
[0091]
酶活力计算公式：
[0092][0093]
式中：u为纤维素酶酶活力；m为葡萄糖质量，mg；n为粗酶液稀释倍数；180.2为葡萄糖分子量；t为反应时间，min；v为酶液体积，ml。
[0094]
发酵48h、72h和96h后，实施例2和对比例3～7得到的粗酶液对应的葡萄糖含量检测结果见表1，纤维素酶活的检测结果见表2。
[0095]
表1实施例2、对比例3～7的粗酶液在不同时间段相对应的葡萄糖含量
[0096]
[0097][0098]
表2实施例2、对比例3～7的粗酶液在不同时间段产生纤维素酶的情况
[0099]
[0100][0101]
注：cmcase为内切葡聚糖酶，pnpcase为外切葡聚糖酶，pnpgase为β葡萄糖苷酶，fpase为滤纸酶，*＝p＜0.05，具体为：表格中cmcase、pnpcase、pnpgase、fpase的数据分别与cmcase：2.08u/ml、pnpcase：4.58u/ml、pnpgase：2.40u/ml、fpase：2.04u/ml比较。
[0102]
由表1和表2可以得出，在发酵96h时，复配组合除了在内切葡聚糖酶方面会与单独植物乳杆菌的组合没有显著性的提高，在另外三种酶的酶活方面均出现了显著性的提高；但相较于其他复配组合，326m的酶活力是最高的。纤维素酶即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的酶活力较高的组合都是植物乳杆菌jylp-326和马克思克鲁维酵母cicc 32015的组合，其次就是植物乳杆菌cicc 24435和马克思克鲁维酵母cicc 32015组合，并且，我们发现326m这一组别的外切葡聚糖酶和滤纸酶活均显著高于其他组别。
[0103]
由于纤维素降解是由纤维素酶系共同作用的结果，因此我们不能通过外切葡聚糖酶的酶活性来片面的判断其对于纤维素的降解效果。因此，为了进一步筛选出降解石细胞中纤维素最理想的菌株组合，我们对发酵前后的石细胞中纤维素含量进行了检测。
[0104]
实施例3
[0105]
将实施例1制备得到的植物乳杆菌jylp-326菌悬液接种于石细胞液体发酵培养基，接种量为于石细胞液体发酵培养基体积的2％，植物乳杆菌jylp-326菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，30℃摇床培养24h，转速为120r/min，得到预培养基，再将实施例2制备得到的马克斯克鲁维酵母菌菌悬液接种于预培养基中，接种量为预培养基体积的2％，马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的活菌数为5.3lg cfu/ml，30℃摇床培养至96h，转速为120r/min，发酵96h，取样，即将发酵完的石细胞提取出来，具体的步骤为：将发酵96h后所得的培养液8000r/min、4℃离心15min，然后将上清液倒掉，留沉淀，之后再用0.1m的稀盐酸冲洗沉淀已取出石细胞表面的菌体，随后再用蒸馏水冲洗2遍，过滤，得样品。将样品在50℃的烘箱中烘干至恒重，记为326m。
[0106]
对比例8
[0107]
将实施例1制备得到的植物乳杆菌jylp-326菌悬液接种于石细胞液体发酵培养基，接种量为于石细胞液体发酵培养基体积的2％，植物乳杆菌jylp-326菌悬液的菌活为
6.3lg cfu/ml，30℃摇床培养，转速为120r/min，发酵96h，取样，在50℃的烘箱中烘干至恒重，记为326。
[0108]
对比例9
[0109]
与对比例8步骤相同，区别在于，采用的是对比例1制备得到的植物乳杆菌cicc 24435菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc24435菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为435。
[0110]
对比例10
[0111]
与实施例3步骤相同，区别在于，采用的是对比例1制备得到的植物乳杆菌cicc 24435菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc24435菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为435m。
[0112]
对比例11
[0113]
与对比例8步骤相同，区别在于，采用的是对比例2制备得到植物乳杆菌cicc 24437菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc 24437菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为437。
[0114]
对比例12
[0115]
与实施例3步骤相同，区别在于，采用的是对比例2制备得到的植物乳杆菌cicc 24437菌悬液替代植物乳杆菌jylp-326菌悬液，植物乳杆菌cicc24437菌悬液的菌活为6.3lg cfu/ml，记为437m。
[0116]
测试例3
[0117]
纤维素标准曲线的制作：
[0118]
选择纤维素(cll)含量检测试剂盒进行纤维素含量的测定，标准曲线按照试剂盒说明书进行操作，具体过程为将10mg/ml标准液用蒸馏水稀释为0.09、0.08、0.07、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml的标准溶液备用。将稀释好的300ul的标准品和300ul的蒸馏水分别加入到1.5ml的离心管中，然后向离心管中加入70ul的工作液和630ul的浓硫酸，混匀，置95℃水浴10min(盖紧，防止水分散失)，取出后冷却至室温，测定620nm处吸光值a，分别记为a标准管，a空白管。计算δa标准＝a标准管-a空白管。根据标准管的浓度(x，mg/ml)和吸光度δa标准(y，δa标准)，建立标准曲线，获得线性回归方程，见图3，回归方程具体为：y＝13.093x+0.0416，r2＝0.9965。
[0119]
以未接入菌株的石细胞液体发酵培养基为对照组，对对照组、实施例3和对比例8～12发酵前的样品和发酵96h烘干后的样品采用纤维素含量检测试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，货号为：bc 4280)测定发酵前后石细胞中纤维素含量的变化情况，结果见表3和图4，图4中的24435为435，24437为437，24435m为435m，24437m为437m。
[0120]
表3发酵前后石细胞中纤维素含量的变化情况
[0121][0122]
石细胞经过植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌发酵前后的纤维素含量变化如表3和图3所示，未接入菌株的石细胞在培养96h后纤维素含量为28.49％。无论经过植物乳杆菌单独发酵还是经过植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌混合发酵96h后，石细胞中纤维素含量均有所下降，其中经过植物乳杆菌jylp-326和马克思克鲁维酵母菌cicc 32015这一组合发酵的石细胞中纤维素含量最低，纤维素含量降至5.80％，降解率达到了20.35％。这一结果说明植物乳杆菌jylp-326和马克思克鲁维酵母菌cicc 32015这一组合可以提高石细胞中纤维素的降解率，对于石细胞的降解起到了一定的作用。因此将这一组合的菌株确定为降解石细胞中纤维素的理想菌株组合。
[0123]
同时对实施例3发酵前后的石细胞的表观结构进行了进一步的观察，具体步骤如下：
[0124]
(1)石细胞发酵前后表观结构的变化
[0125]
对实施例3取样，取发酵前的样品和发酵96h的样品；对发酵前后的样品进行过滤并去除菌体(去除菌体的方法为稀盐酸去除菌体，具体步骤参考《水稻秸秆降解微生物菌群的构建及其高效率降解机制探究》)，随后在50℃烘箱内烘干至恒重，采用扫描电子显微镜(sem)对其表观结构进行观察。由图5～图10可知，降解前的石细胞表面较为平整、光滑、结构较完整，孔隙较少，通过发酵的石细胞的表面变成了蜂窝状，表面变得粗糙，并且出现了较为明显的孔洞，这一结果表明石细胞中的纤维素结构遭到了菌株的蚕食，这也进一步的说明了植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌对石细胞的结构造成了损害，使得石细胞的降解效果更加明显。
[0126]
(2)石细胞发酵前后化学结构的变化
[0127]
采用傅里叶红外光谱仪(ftir)对石细胞的化学基团对步骤(1)中烘干后的样品进行分析，光谱吸收峰范围为4000-500cm-1
。
[0128]
傅里叶红外光谱是从分子水平上说明结构变化引起的振动，可以定性和半定量地揭示官能团的转变，发酵前后石细胞的傅里叶红外光谱如图11所示，两个组别的谱图非常相似，没有出现或者消失峰，然而，几个特征谱带的峰强度或者峰宽发生了变化，其中3000-3700cm-1
左右的峰通常代表了分子内或分子间氢键的伸缩振动，发酵前的样品在这一范围内峰强度高于发酵后的样品的峰强度，表明氢键力减弱，从而增加了羟基的o-h伸缩振动，而氢键力的减弱有利于纤维素的降解。另外，在890-1100cm-1
处发酵后的样品的吸收带同样呈现了略微的增强现象，该处为纤维素和糖类如半乳糖、甘露糖等多糖的振动环，这说明纤维素被降解为糖类物质，发酵后的样品在2900cm-1
附近吸收带呈现增强趋势，这一现象是由木质素聚合物之间的酯键、芳基和醚键与阿拉伯糖基键连接断裂后的甲基化引起的。以上一系列结果说明，经过植物乳杆菌jylp-326和马克思克鲁维酵母菌cicc 32015混合发酵的
石细胞的纤维素和木质素化学结构均受到了一定的破坏，有利于石细胞的降解。
[0129]
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[0139]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌的混合菌剂在降解水果石细胞中的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc32015。2.包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌的混合菌剂在降解水果纤维素中的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc32015。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述水果包括梨。4.一种用于降解水果石细胞的生物降解剂，其特征在于，所述生物降解剂的有效成分包括植物乳杆菌和马克思克鲁维酵母菌；所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc32015。5.权利要求4所述的生物降解剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将植物乳杆菌菌悬液接种于mrs肉汤培养基中第一摇床培养，得预培养基；将马克斯克鲁维酵母菌菌悬液接种于预培养基中第二摇床培养，得生物降解剂；所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌jylp-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为cicc32015。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌菌悬液的菌活为6～7lgcfu/ml；所述植物乳杆菌菌悬液的接种量为mrs肉汤培养基体积的2％。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述马克思克鲁维酵母菌菌悬液的菌活为5～6lgcfu/ml；所述马克斯克鲁维酵母菌菌悬液的接种量为预培养基体积的2％。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第一摇床培养的时间为24h，温度为30℃，转速为120r/min。9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，第二摇床培养的时间为72h，温度为30℃，转速为120r/min。10.一种降解水果汁中石细胞或制备发酵果汁的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将水果汁与所述生物降解剂混合发酵。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及植物乳杆菌JYLP-326和马克思克鲁维酵母菌在降解水果石细胞中的应用。本发明提供了包括植物乳杆菌JYLP-326和马克思克鲁维酵母菌的混合菌剂在降解水果石细胞中的应用，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌JYLP-326；所述马克思克鲁维酵母菌的保藏编号为CICC32015。本发明将植物乳杆菌JYLP-326和马克思克鲁维酵母菌联合使用后，菌株的产纤维素酶的能力得到的显著提高，能够降低石细胞的含量，对提高梨汁品质有重要意义。重要意义。重要意义。


技术研发人员：高洁 桑亚新 杨兵 许超 田桂芳 纪月洪
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2023.02.27
技术公布日：2023/8/21