锌结合脱氢酶新型变体及利用其的L-芳香族氨基酸的生产方法与流程

锌结合脱氢酶新型变体及利用其的l-芳香族氨基酸的生产方法
技术领域
1.本发明涉及锌结合脱氢酶新型变体及利用其的l-芳香族氨基酸的生产方法。


背景技术：

2.氨基酸根据侧链的性质而分为疏水性、亲水性、碱性和酸性氨基酸，将它们中具有苯环的氨基酸称为芳香族氨基酸。在芳香族氨基酸中，有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，苯丙氨酸和色氨酸是生物体内不能合成的必要氨基酸，属于在全世界每年形成着3000亿美元规模的市场的高附加值产业。
3.芳香族氨基酸的生产可以利用自然状态下获得的野生型菌株或者以提高其氨基酸生产能力的方式改变的变异株。近年来，为了改善芳香族氨基酸的生产效率，以多用于l-氨基酸之类的有用物质的生产的大肠杆菌、棒状杆菌等微生物为对象，适用基因重组技术，从而开发了具有优异的l-芳香族氨基酸生产能力的各种重组菌株或变异株及利用其的l-芳香族氨基酸的生产方法。特别是，进行了如下尝试：以参与l-芳香族氨基酸的生物合成途径的酶、转录因子、运输蛋白质等的基因为靶向、或者对调控它们的表达的启动子诱导变异，从而扩大相应氨基酸的生产量。但是，与l-芳香族氨基酸生产直接或间接相关的酶、转录因子、运输蛋白质等蛋白质的种类达到数十余种，因此关于根据这样的蛋白质的活性变化的l-芳香族氨基酸生产能力是否增加，事实上仍需要大量的研究。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.韩国授权专利第10-1830002号


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供新型的锌结合脱氢酶变体。
8.另外，本发明提供编码上述变体的多核苷酸。
9.另外，本发明提供包含上述变体或多核苷酸的转化体。
10.另外，本发明的目的在于提供利用了上述转化体的l-芳香族氨基酸的生产方法。
11.本发明的一个方式提供由seq id no:1的氨基酸序列组成的锌结合脱氢酶变体，是seq id no:3的氨基酸序列中的第102号甘氨酸被置换为精氨酸而成的。
12.本发明中所使用的“锌结合脱氢酶(zinc-binding dehydrogenase)”是一种结合有锌的氧化还原酶，在nad或nadp存在的条件下具有氧化还原活性。上述锌结合脱氢酶可以是编码锌结合脱氢酶的基因或与其具有实质同一性的序列。在这里，“实质同一性”是指在将各个基因序列，即碱基序列或核苷酸序列和任意的其它核苷酸序列以最大程度对应的方式对齐而进行分析时，上述任意的其它核苷酸序列和各个核苷酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上或98％以上的序列同源性。
13.本发明中的锌结合脱氢酶是利用yggp基因编码而成的，包含seq id no:3的氨基
酸序列。
14.根据本发明的一具体例，上述seq id no:3的氨基酸序列可以源于野生型大肠杆菌。
15.本发明中所使用的“变体”是指如下的多肽，该多肽的特定基因的氨基酸序列的n-末端、c-末端和/或内部中的一个以上的氨基酸被保守性置换(conservative substitution)和/或改变(modification)，从而与上述变体的变异前的氨基酸序列不同，但维持了功能(functions)或特性(properties)。在这里，“保守性置换”是指将一个氨基酸置换为结构和/或化学性质相似的其它氨基酸，对蛋白质或多肽的活性几乎不产生影响，或者可以完全不产生影响。此外，变体包括一个以上的n-末端前导序列或跨膜结构域(transmembrane domain)之类的部分被剔除的变体、或者一部分从成熟蛋白质(mature protein)的n-和/或c-末端被剔除的变体。与变异前的多肽相比，这样的变体其能力可以增加或不变或减少。在本发明中，变体可以与变异型、改变、变异型多肽、变异的蛋白质、变异等混用。
16.本发明中的变体是一种锌结合脱氢酶变体，是位于seq id no:3的氨基酸序列中的第102号的氨基酸即甘氨酸被置换为精氨酸而成的，可以由seq id no:1的氨基酸序列组成。
17.本发明的另一方式提供编码上述锌结合脱氢酶变体的多核苷酸。
18.本发明中所使用的“多核苷酸(polynucleotide)”是核苷酸单体(monomer)通过共价键以链状长长地连接而成的核苷酸的聚合物(polymer)，是一定长度以上的dna或rna链，更具体而言，是指编码上述变体的多核苷酸片段。
19.上述多核苷酸可以包含编码seq id no:1的氨基酸序列的碱基序列。
20.根据本发明的一具体例，上述多核苷酸可以包含由seq id no:2表示的碱基序列。
21.本发明的另一方式提供包含编码上述锌结合脱氢酶变体的多核苷酸的载体。
22.另外，本发明的另一方式提供包含上述锌结合脱氢酶变体或多核苷酸的转化体。
23.本发明中所使用的“载体(vector)”是指作为用于向宿主细胞传递、表达目标基因的手段所使用的所有类型的核酸序列转运结构体。除非另有说明，否则上述载体可以是指使担载的核酸序列插入宿主细胞基因内进行表达和/或独立进行表达。这样的载体为了表达基因插入物而包括可操作地连接的必需的调控元件，“可操作地连接的(operably linked)”是指目标基因与其调控序列彼此功能性地结合并以能够进行基因表达的方式连接，“调控元件”包括用于实施转录的启动子、用于调控转录的任意的操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列、以及调控转录和翻译的终止的序列。
24.本发明中所使用的载体只要能够在宿主细胞中进行复制就没有特别限定，可以利用该领域中已知的任意的载体。作为上述载体的一个例子，可以举出天然状态或重组状态的质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，有pwe15、m13、λmbl3、λmbl4、λixii、λashii、λapii、λt10、λt11、charon4a、charon21a等，作为质粒载体，有pbr系、puc系、pbluescriptii系、pgem系、ptz系、pcl系和pet系等，但并不限定于此。
25.上述载体可以代表性地构建为用于克隆的载体或用于表达的载体。用于表达的载体可以使用该领域中用于在植物、动物或微生物中表达外源基因或蛋白质的常规载体，并且可以通过该领域中公知的各种方法而构建。
26.重组载体可以以原核细胞或真核细胞为宿主进行构建。例如，在所使用的载体为表达载体且以原核细胞为宿主时，可以使转录进行的强启动子(例如，plλ启动子、cmv启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子)通常包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。在以真核细胞为宿主时，在载体所包含的真核细胞中启动的复制起点包括f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺病毒复制起点、aav复制起点和bbv复制起点等，但并不限定于此。此外，可以利用源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子、hsv的tk启动子)，并且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。
27.上述重组载体可以包括选择标记(selection marker)，上述选择标记用于选择利用载体转化的转化体(宿主细胞)，在经上述选择标记处理的培养基中只有表达选择标记的细胞可以生存，因此能够选择转化的细胞。作为代表性的例子，上述选择标记有卡那霉素、链霉素、氯霉素等，但并不限定于此。
28.通过将重组载体插入宿主细胞，从而可以制作转化体，上述转化体可以通过将重组载体导入合适的宿主细胞而得到。宿主细胞是可以稳定且连续地克隆或表达上述表达载体的细胞，也可以利用该领域中公知的任何宿主细胞。
29.在为了制作重组微生物而对原核细胞进行转化时，作为宿主细胞，可以利用e.coli jm109、e.coli bl21、e.coli rr1、e.coli le392、e.coli b、e.coli x 1776、e.coli w3110、e.coli xl1-blue之类的大肠杆菌属菌株；枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌之类的芽孢杆菌属菌株；鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和假单胞菌种之类的各种肠道细菌和菌株等，但并不限定于此。
30.在为了制作重组微生物而对真核细胞进行转化时，作为宿主细胞，可以利用酵母(例如，酿酒酵母)、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞，例如，sp2/0、cho k1、cho dg44、per.c6、w138、bhk、cos7、293、hepg2、huh7、3t3、rin、mdck细胞株等，但并不限定于此。
31.本发明中所使用的“转化(transformation)”是指将外源dna导入宿主细胞内而人为引起基因改变的现象，“转化体(transformat)”是指导入有外源dna并稳定维持目标基因的表达的宿主细胞。
32.在上述转化中，根据宿主细胞而选择合适的载体导入技术，从而可以在宿主细胞内表达目标基因或包含其的重组载体。例如，载体导入可以通过电穿孔法(electroporation)、热冲击(heat-shock)、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射法(microinjection)、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-dmso法、或者它们的组合而实施，但并不限定于此。转化的基因只要可以在宿主细胞内表达，就可以被包括在内，而不限制于将其插入宿主细胞的染色体内或者位于染色体外。
33.上述转化体包括在生物体内或试管内利用根据本发明的重组载体转染、转化或感染的细胞，并且可以与重组宿主细胞、重组细胞或重组微生物作为相同的用语被使用。
34.根据本发明的一具体例，上述转化体可以为埃希菌(escherichia)属菌株。
35.作为上述埃希菌属菌株，有大肠埃希菌(escherichia coli)、艾伯特埃希菌(escherichia albertii)、蟑螂埃希菌(escherichia blattae)、弗格森埃希菌(escherichia fergusonii)、赫氏埃希菌(escherichia hermannii)、伤口埃希菌
(escherichia vulneris)等，但并不限定于此。
36.本发明中的转化体可以为包含上述锌结合脱氢酶变体或对其进行编码的多核苷酸的菌株、或者包含含有其的载体的菌株；表达上述锌结合脱氢酶变体或多核苷酸的菌株；或者具有对上述锌结合脱氢酶变体的活性的菌株，但并不限定于此。
37.根据本发明的一具体例，上述转化体可以具有l-芳香族氨基酸生产能力。
38.上述转化体可以在自然下具有l-芳香族氨基酸生产能力，或者可以在人为下被赋予l-芳香族氨基酸生产能力。
39.根据本发明的一具体例，上述转化体由于锌结合脱氢酶的活性得到改变，因此l-芳香族氨基酸生产能力可以得到提高。
40.本发明中所使用的“生产能力得到提高”是指与亲本菌株相比，l-芳香族氨基酸的生产率增加。上述亲本菌株是指成为变异对象的野生型或变异株，包括直接成为变异的对象或通过重组的载体等转化的对象。在本发明中，亲本菌株可以是野生型埃希菌属菌株或由野生型变异的埃希菌属菌株。
41.根据本发明的转化体通过导入锌结合脱氢酶变体，从而锌结合脱氢酶的活性改变，显示出与亲本菌株相比增加的l-芳香族氨基酸生产能力，特别是，与亲本菌株相比，l-芳香族氨基酸生产量增加5％以上，具体而言，增加5至60％(优选10至50％)，每1l的菌株培养液可以生产4～20g的l-芳香族氨基酸。
42.本发明的另一方式提供l-芳香族氨基酸的生产方法，其包括以下步骤：在培养基中培养上述转化体的步骤；以及从上述转化体或培养转化体的培养基中回收l-芳香族氨基酸的步骤。
43.上述培养可以根据该领域中已知的合适的培养基和培养条件而进行，只要是本领域技术人员就可以容易地调整培养基和培养条件来使用。具体而言，上述培养基可以是液体培养基，但并不限定于此。培养方法可以包括例如分批式培养(batch culture)、连续式培养(continuous culture)、补料分批式培养(fed-batch culture)或者它们的组合培养，但并不限定于此。
44.根据本发明的一具体例，上述培养基必须以合适的方式满足特定菌株的要求，可以由本领域技术人员适当地进行变形。关于埃希菌属菌株的培养基，可以参考公知的文献(manual of methods for general bacteriology.american society for bacteriology.washington d.c.,usa,1981)，但并不限定于此。
45.根据本发明的一具体例，培养基中可以包含各种碳源、氮源和微量元素成分。作为可以使用的碳源，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素之类的糖及碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻籽油、椰子油等油及脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸之类的脂肪酸；甘油、乙醇之类的醇；乙酸之类的有机酸。这些物质可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的氮源，可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素或者无机化合物，例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源同样可以单独使用或以混合物的形式使用，但并不限定于此。作为可以使用的磷的供应源，可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐，但并不限定于此。此外，培养基可以含有生长所需要的硫酸镁或硫酸铁之类的金属盐，但并不限定于此。除此以外，可以包含氨基酸和维生素之类的必要生长物质。此外，可以使用适合培养基的前体。上述培养基
或单个成分可以在培养过程中通过适当的方式分批或连续添加到培养液中，但并不限定于此。
46.根据本发明的一具体例，在培养过程中，可以将氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸之类的化合物以适当的方式添加到微生物培养液中来调整培养液的ph。此外，在培养过程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯之类的消泡剂来抑制气泡产生。进一步而言，为了维持培养液的有氧状态，可以向培养液内注入氧气或者含氧气的气体(例如空气)。培养液的温度通常可以为20℃至45℃，例如，可以为25℃至40℃。培养时间可以持续到有用物质获得期望的生产量为止，例如，可以为10至160小时。
47.根据本发明的一具体例，在从上述培养的转化体或培养转化体的培养基中回收l-芳香族氨基酸的步骤中，可以根据培养方法并利用该领域中公知的合适的方法，从培养基中收集或回收所生产的l-芳香族氨基酸。例如，可以使用离心分离、过滤、提取、喷雾、干燥、蒸发、沉淀、结晶化、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)、色谱法(例如，离子交换、亲和性、疏水性和尺寸排阻)等方法，但并不限定于此。
48.根据本发明的一具体例，在上述回收l-芳香族氨基酸的步骤中，可以将培养基低速离心分离而去除生物质，可以将得到的上清液通过离子交换色谱法而分离。
49.根据本发明的一具体例，在上述回收l-芳香族氨基酸的步骤中，可以包括纯化l-芳香族氨基酸的工序。
50.根据本发明的一具体例，上述l-芳香族氨基酸可以为选自l-色氨酸、l-苯丙氨酸和l-酪氨酸中的1种以上。
51.根据本发明的锌结合脱氢酶变体通过置换构成锌结合脱氢酶的氨基酸序列中的一个以上的氨基酸来改变酶活性，从而包含其的重组微生物可以有效地生产l-芳香族氨基酸。
附图说明
52.图1表示根据本发明的一实施例的质粒pdsg的结构。
53.图2表示根据本发明的一实施例的质粒pds9的结构。
具体实施方式
54.下面，对本发明更详细地进行说明。但是，这样的说明只是为了帮助理解本发明而例示性地提出的，本发明的范围并不限定于这样的例示性的说明。
55.实施例1.表达锌结合脱氢酶变体的菌株的制作
56.为了确认位于锌结合脱氢酶的氨基酸序列(seq id no:3)中第102号的甘氨酸被置换为精氨酸的变体对l-芳香族氨基酸的生产造成的影响，制作了表达上述锌结合脱氢酶变体的载体和导入有上述载体的菌株。为了菌株内锌结合脱氢酶变体的基因插入，使用质粒pdsg和pds9，并如下所示进行了制作。
57.在这里，质粒pdsg具有只在大肠杆菌中发挥作用的复制起点，具有氨苄青霉素抗性基因和前导rna(grna)表达机制。质粒pds9具有只在大肠杆菌中发挥作用的复制起点，具有卡那霉素抗性基因、λred基因(exo、bet和gam)和源自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9表达机制。
58.1-1.转化用载体pdsg-yggp(gly102arg)的制作
59.将大肠杆菌(escherichia coli)mg1655(kctc14419bp)gdna作为模板，分别通过实施pcr，利用引物7和引物9的引物对以及引物8和引物10的引物对，从而获得了编码锌结合脱氢酶的大肠杆菌yggp基因的第102号氨基酸变异的上游(upstream)片段，利用引物11和引物13的引物对以及引物12和引物14的引物对，从而获得了大肠杆菌yggp基因的第102号氨基酸变异的下游(downstream)片段。这时，使各上游(upstream)和下游(downstream)片段包含了将作为yggp基因的第102号氨基酸残基的甘氨酸(gly)变更为精氨酸(arg)的序列。在这里，聚合酶使用了takara primestar max dnapolymerase，pcr扩增条件是将在95℃变性10秒、在57℃退火15秒以及在72℃聚合10秒反复30次而实施的。
60.将质粒pdsg作为模板，分别利用引物3和引物5的引物对、引物4和引物6的引物对、引物15和引物1的引物对以及引物16和引物2的引物对，通过实施pcr，从而获得了4个pdsg基因片段。这时，使各基因片段包含了以yggp基因的第102号gly为靶向的grna序列。grna选择了待诱导变异的序列的ngg前20mer。在这里，聚合酶使用了takara primestarmax dnapolymerase，pcr扩增条件是将在95℃变性10秒、在57℃退火15秒以及在72℃聚合15秒反复30次而实施的。
61.利用自组装克隆(self-assembly cloning)方法(biotechniques 51:55-56(july 2011))，将获得的yggp基因的第102号氨基酸的上游(upstream)和下游(downstream)、以及4个pdsg基因片段进行克隆，从而获得了重组质粒，将其命名为pdsg-yggp(gly102arg)。
62.1-2.导入有锌结合脱氢酶变体yggp(gly102arg)的l-色氨酸或l-苯丙氨酸生产菌株的制作
63.为了制作l-色氨酸生产菌株和l-苯丙氨酸生产菌株而利用了大肠杆菌kfcc11660p和kccm10016作为亲本菌株。
64.将质粒pds9向kfcc11660p菌株或kccm10016菌株进行1次转化，在lb-km(含有25g/l的lb液体培养基和50mg/l的卡那霉素)固体培养基中培养后，选择了具有卡那霉素抗性的菌落。将将pdsg-yggp(gly102arg)质粒向所选择的菌落进行2次转化，在lb-amp&km(含有25g/l的lb液体培养基、100mg/l的氨苄青霉素和50mg/l的卡那霉素)固体培养基中培养，选择了具有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的菌落后，利用引物17和引物18的引物对，通过实施pcr，从而获得了基因片段。聚合酶使用了takara primestar max dnapolymerase，pcr扩增条件是将在95℃变性10秒、在57℃退火10秒以及在72℃聚合15秒反复30次而实施的。委托macrogen确认了利用引物17和引物18的引物对而获得的基因片段的序列。
65.选择的2次转化体在lb液体培养基中进行7次传代培养，在lb固体培养基中选择了菌落。将各菌落分别选择性地在lb、lb-amp和lb-km固体培养基中进行了培养。选择了在lb固体培养基中生长且在lb-amp合lb-km固体培养基中不生长的菌落。将通过如上所述的方法制作的菌株分别命名为kfcc11660p_yggp(gly102arg)和kccm10016_yggp(gly102arg)。
66.实施例1中所使用的引物序列如下述表1所示。
67.【表1】
68.引物名称seq id no:引物序列(5
’‑3’
)引物15caattttattatagtaattgactattatac引物26gcttggtaaccaattttattatagtaattgactattatac
引物37gttaccaagcggatattcaggttttagagctagaaatagc引物48ggatattcaggttttagagctagaaatagc引物59gagcctgtcggcctacctgct引物610cggccggcatgagcctgtcg引物711atgccggccggctgctatttatggcaagcg引物812gctgctatttatggcaagcg引物913cccatcgccggttgcaatac引物1014gcttggtaaccccatcgccg引物1115gttaccaagcagatattcagcgggctacag引物1216agatattcagcgggctacag引物1317tgctcataaacatattgcgt引物1418gcccatgcgatgctcataaa引物1519tcgcatgggcgagctcctgaaaatctcgataac引物1620gagctcctgaaaatctcgataac引物1721acgtgtgacggataaaccac引物1822ttcacatacaccagctcaat
69.实验例1.导入有锌结合脱氢酶变体的变异株的l-芳香族氨基酸生产能力评价
70.比较了亲本菌株(kfcc11660p和kccm10016)和导入有锌结合脱氢酶变体的变异株(kfcc11660p_yggp(gly102arg)和kccm10016_yggp(gly102arg))的l-色氨酸或l-苯丙氨酸生产能力。
71.在装有10ml的下述表2的色氨酸生产用培养基或苯丙氨酸生产用培养基的100ml的烧瓶中，将各菌株(亲本菌株或变异株)以体积基准各接种1％，以37℃、200rpm的条件震荡培养72小时。培养结束后，使用hplc(agilent)测定了培养基中l-色氨酸或l-苯丙氨酸的浓度，将其结果分别示于下述表3和4。
72.【表2】
[0073][0074]
【表3】
[0075][0076]
【表4】
[0077][0078]
如上述表3和4所示的那样，确认了导入有锌结合脱氢酶变体的变异株kfcc11660p_yggp(gly102arg)和kccm10016_yggp(gly102ar g)与亲本菌株kfcc11660p和kccm10016相比，l-色氨酸和l-苯丙氨酸生产量分别提高了约19％和23％。
[0079]
到目前为止，对本发明围绕其优选实施例进行了研究。本发明所属技术领域的技术人员可以理解本发明在不脱离本发明的本质性的特性的范围内可以以变形的形态实现。因此，公开的实施例应从说明性的角度进行考虑而不是从限制性的角度进行考虑。本发明的范围显示在权利要求书中而不是上述的说明中，并且应被解释为在与其等同范围内的所有的差异包括在本发明中。

技术特征：
1.一种由seq id no:1的氨基酸序列组成的锌结合脱氢酶变体，是seq id no:3的氨基酸序列中的第102号甘氨酸被置换为精氨酸而成的。2.一种多核苷酸，编码权利要求1的变体。3.一种转化体，包含权利要求1的变体或权利要求2的多核苷酸。4.根据权利要求3所述的转化体，其中，所述转化体为埃希菌(escherichia)属菌株。5.根据权利要求3所述的转化体，其中，所述转化体具有l-芳香族氨基酸生产能力。6.一种l-芳香族氨基酸的生产方法，其包括以下步骤：在培养基中培养权利要求3的转化体的步骤；以及从所述转化体或培养转化体的培养基中回收l-芳香族氨基酸的步骤。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述l-芳香族氨基酸为选自l-色氨酸、l-苯丙氨酸和l-酪氨酸中的1种以上。

技术总结
本发明涉及锌结合脱氢酶新型变体及利用其的L-芳香族氨基酸的生产方法，上述锌结合脱氢酶变体通过置换构成锌结合脱氢酶的氨基酸序列中的一个以上的氨基酸来改变酶活性，从而包含其的重组微生物可以有效地生产L-芳香族氨基酸。氨基酸。氨基酸。


技术研发人员：申沅株 朴栽恩 金容秀 曹永一
受保护的技术使用者：大象株式会社
技术研发日：2022.09.26
技术公布日：2023/8/21