一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法与流程

1.本发明涉及辅助生殖技术领域，具体是一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法。


背景技术：

2.胚胎植入前染色体非整倍体检测是指采用胚胎细胞进行的低深度全基因组的高通量测序法，通过对获取的单个或有限的胚胎细胞的全基因组扩增产物进行全基因组高通量大规模并行基因组测序，并将全基因组测序结果进行统计学信息分析，从而判断胚胎的染色体是否为非整倍体，或是否含有拷贝数变异(cnv，copy number variants)的片段，正常胚胎的染色体是整倍体即二倍体，非整倍体胚胎通常容易导致流产或者胎儿异常(发育问题或者疾病)，因此医院在对患者进行辅助生殖时需要对胚胎植入前染色体非整倍体进行检测。
3.由于胚胎植入前检测只能取少量约1-3个细胞，而每个胚胎细胞含有的一整套人的全基因组dna含量约6.6pg，需要对对极微量的dna进行全基因组扩增，才能进行接下来的检测，目前广泛用于胚胎植入前染色体非整倍体检测的方法主要是基于malbac(multiple annealing and looping based amplification cycles，简称malbac)，即多次退火环状循环扩增技术，是基于哈佛大学谢晓亮院士研究组的一项专利技术，是最先进的全基因组扩增技术，该技术及其在研究人类精子重组方面的独特应用，但是其缺点较为明显，操作步骤较多，人员操作容易引起人为偏差或者失误，特别是当dna扩增的模板拷贝数极低时容易引起扩增偏差，因此可能出现非特异性扩增，影响最终的非整倍体判断错误，同时，目前广泛用于胚胎植入前染色体非整倍体检测的生物信息学算法采用的是使用过滤后的干净数据进行循环二进制切割和gc校正，随后进行拷贝数变异分析，其缺点就是将其中一部分有用的数据丢掉了，造成一些信息丢失，导致最终非整倍体判断可能会出现错误。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其方法包括以下步骤，
7.s1：全基因扩增，全基因扩增包括细胞裂解、预扩增和扩增；
8.a.细胞裂解
9.此阶段需要的试剂：细胞裂解缓冲液、细胞裂解酶、te buffer。
10.1)配制裂解体系：在离心管中依次加入以下试剂，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；
[0011][0012]
2)准备样本：从-80℃冰箱中取出细胞样本后，立即置于冰盒上，短暂离心大约5秒，立即放回冰盒上,同时用2.5μl te buffer作为扩增的空白对照；向所有的样本加入te buffer，补足至5.0μl，瞬时离心，置于冰盒上；
[0013]
3)向样本管中分别加入第一步制备的裂解体系5.0μl，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；
[0014][0015]
4)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)，按照如下条件进行：
[0016][0017]
b.预扩增
[0018]
此阶段需要的试剂：预扩增缓冲液、预扩增酶；室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心。
[0019]
1)根据下表，制备全基因组预扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；
[0020][0021]
2)从pcr仪中取出细胞裂解反应结束的样本，置于冰盒上，向每管样本中加入上一步制备的全基因组预扩增反应体系10.0μl，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；
[0022][0023]
3)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)，按照如下条件进行：
[0024][0025][0026]
c.扩增
[0027]
预先取出扩增试剂和标签列(gctcttccgatctkkkkkknntggg；gctcttccgatctkkkkkknngttt)，室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心；
[0028]
1)按下表准备扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；
[0029][0030]
2)在预扩增产物pcr管中加入20.0μl扩增反应体系；
[0031][0032]
3)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)，按照如下条件进行：
[0033][0034][0035]
s2：文库纯化；
[0036]
1)现配适量的80％乙醇；
[0037]
2)使用前将纯化磁珠平衡至室温至少30min；
[0038]
3)向每个样品中加入等体积的磁珠50μl，轻轻涡旋混合均匀；
[0039]
4)将混合物在室温下孵育5min；
[0040]
5)瞬时离心，置于磁力架上2min，小心丢弃上清；
[0041]
6)向每个样本缓慢加入200μl现配的80％乙醇，于磁力架上孵育静止30s；然后小心地丢弃上清液，注意不要吸到或扰乱磁珠；
[0042]
7)重复步骤6)，共两次乙醇洗涤；
[0043]
8)瞬时离心，将剩余管壁液体离心至管底；
[0044]
9)在磁力架上孵育2min，然后小心地吸弃上清，敞开管盖，室温晾至磁珠表面无泛光；
[0045]
10)用40μl无核酸酶水重悬磁珠，将重悬混合物在室温下孵育2min；
[0046]
11)于磁力架上静置2min，转移38μl上清至新的1.5mlep管，纯化后文库样品可保存在-20℃，1个月内可用于上机测序，冻融次数不超过3次。
[0047]
s3：文库定量；
[0048]
1)纯化后的文库使用qubit荧光计进行文库定量：单个文库浓度应大于25ng/μl；
[0049]
2)qsep100生物片段分析仪检测片段长度，文库片段为600～1000bp。
[0050]
s4：混合文库制备；
[0051]
文库混合：根据qubit的定量结果，每个样本取等质量文库进行混合，若有空白对照，则空白对照混合量为样本取样体积的平均值。
[0052]
s5：接头转换及文库变性；
[0053]
使用“mgieasy通用文库转换试剂盒”，严格按照说明书操作。
[0054]
s6：dnb制备及测序；
[0055]
使用测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)于基因测序仪(mgiseq-200)上进行测序反应，严格按照说明书操作。
[0056]
s7：数据分析；
[0057]
使用胚胎染色体异倍体分析系统，进行数据分析，严格按照说明书操作。
[0058]
1)统计质控信息
[0059]
2)gc校正
[0060]
3)标准化
[0061]
4)循环二进制切割(circular binary segmentation，简称cbs)
[0062]
常染色体cbs使用r包dnacopy进行分析，其中参数α(检测断点的p-value)设定为1e-5，每个segment至少包含两个bins，最后连续bins的平均值作为这个segement的ratio，循环二进制切割能够提高运行速度和检测效果，用阴性样本库中的突变信息对cbs和区段z-score进行权重分析，通过这个方法可以对不太精确的bins降低权值。
[0063]
5)黑名单过滤无信息位点
[0064]
人类基因组中存在大量充满问题的重复区，如微卫星、中心粒、端粒会妨碍短序列比对的正确性，这些位点会使得数据标准化变得非常复杂，因此需要建立黑名单，将这些区域进行标记过滤，以提高分析的准确性。
[0065]
6)噪音消除和降低
[0066]
观测到的中值信号方差msvo(median sigment variance)即一组方差的中位数，是对样本的噪声进行测量，其中每个方差对应于一个段的方差，预期的中位数段方差(median segment variance，简称msve)与存储单元大小和测序序列深度成反比，因为两者都定义了噪声，msvo是噪声的度量。公式如下：
[0067]
[0068]
7)判断结果
[0069]
染色体异常的计算使用log2进行度量，用观察到的拷贝数和预期拷贝数的比率(cn)表示。公式如下：
[0070]
染色体缺失：
[0071]
染色体重复：
[0072]
同时选择在与二倍体的任意1/3拷贝数偏差处构成畸变调用的边界，以得到更多真阳性的结果。其具体公式如下：
[0073]
拷贝数缺失：
[0074]
拷贝数重复：
[0075]
使z评分来判断染色体是否非整倍体，z分数的计算可以使用下面的公式：
[0076][0077]
公式z
segment(n
→
m)
表示bins从n到m所组成的segment的z-score，μw()利用参考构建时bins的差异程度得到的权重值来计数bins的均值，μ()和std(()计算一般的均值和标准差，rn代表所检测样本在bins n处的reads ratio，r2,n表示参考集中第二例样本在同一位点的reads ratio，总共有p个健康参考样本。
[0078]
根据现有阴性样本库，当z评分小于-0.5,可以判断该染色体是缺失结果，当z评分大于0.5，可以判断该染色体是重复结果。
[0079]
s8：查看报告
[0080]
a)若检测样本中的某条染色体的z评分值≥0.5或≤-0.5，则表示该样本的该染色体存在非整倍体异常，否则表示该次检测未发现非整倍体异常。
[0081]
b)若某条染色体的z评分值为0，应判定为此样本未检测出该染色体，同时对于常染色体而言，此种检测结果为阳性纯合缺失，对于性染色体而言，此种检测结果应将x、y检测结果共同判断；
[0082]
c)对于x、y染色体检测结果应共同判断，若x染色体检测结果为单体同时y染色体检测结果为单体，则此样本x、y染色体检测结果应判定为未发现非整倍体异常，不能分别判定为单体阳性(非整倍体异常)；
[0083]
作为本发明进一步的方案：所述s1中细胞裂解时配制裂解体系中考虑到移液过程中的损耗，需额外多准备5％的细胞裂解缓冲液、细胞裂解酶和te buffer试剂。
[0084]
作为本发明再进一步的方案：所述s2中第9条在操作过程中应注意避免过度干燥，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖。
[0085]
作为本发明再进一步的方案：所述s7中统计质控信息包括统计测序序列数(reads
数)、碱基数、q20(质量值》20)、q30(质量值)30)、n比例、gc含量、比对率、基因组覆盖度(coverage)、冗余度(duplication)等信息。
[0086]
作为本发明再进一步的方案：所述s7中gc校正使用bwa软件将测序序列比对到参考基因组(版本号grch38)，将比对上参考基因组的有效序列分配到事先划分好的200kb片段大小的基因组(窗口)中，然后进行gc校正，详细步骤为：首先计算每个窗口区域的基因组gc含量；然后以样本所有窗口的序列数平均数与该gc含量水平内窗口序列平均数的比值作为窗口gc校正权重，重新计算窗口序列含量(reads count，rc)。
[0087]
作为本发明再进一步的方案：所述s7中标准化实施步骤为收集一组约100人相同实验流程的健康人样本作为阴性样本库，来自这组样本的bins可以作为正常的二倍体对照，确定样本内部的bins参考对应以用于标准化，使用200kb的bin，用于检测的异常大小在4mb以上拷贝数变异，在准备阴性样本库时，使用y染色体片段，在高斯混合模型下训练数据，将男性和女性样本进行区分，所有样本都使用常染色体作为阴性参考，不同的性别组用于产生性染色体阴性参考，当检测一个新样本时，就会自动预测性别，并选择正确的阴性参考库，以提高检测的准确性。
[0088]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0089]
为了解决现有的多次退火环状循环扩增技术由于操作步骤太多，人为操作的比例过高，dna扩增的模板拷贝数极低时容易引起扩增偏差，可能出现非特异性扩增等问题，本发明应用简并引物(degenerate oligonucleotide-primed，dop)pcr法，结合自主设计的随机引物，建立一种特异性的极微量全基因组dna扩增方法，该技术使用部分简并寡核苷酸引物进行pcr反应(引物中间含6个随机碱基)，首先使用较低的温度(～25℃)进行退火，随后再缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度(～55℃)进行多循环常规pcr反应，从而实现对全基因组的扩增，以消除现有全基因组扩增方法引入的扩增偏差和可能出现非特异性扩增，同时引入机器学习模型
‑‑
高斯混合模型，对扩增后的基因组dna数据进行建模分析，同时使用gc校正、循环二进制切割等分析方法，进而准确判断出胚胎染色体的核型，可以使用不过滤和清洗的数据进行分析，大大提高了分析速度，以及大大提高了数据利用率，在显著提高分析结果准确度的同时，可以大大降低检测成本，此方法不仅仅提高了胚胎植入前染色体的拷贝数准确分析，同时相比传统的分析方法可以节省20％左右的数据量，即节省20％左右的数据产出成本。
附图说明
[0090]
图1为本发明的具体流程图。
[0091]
图2为最终的分析结果可视化图。
具体实施方式
[0092]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0093]
请参阅图1-2，本发明实施例中，一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方
法，其方法包括以下步骤，
[0094]
s1：全基因扩增，全基因扩增包括细胞裂解、预扩增和扩增；
[0095]
a.细胞裂解
[0096]
此阶段需要的试剂：细胞裂解缓冲液、细胞裂解酶、te buffer。
[0097]
1)配制裂解体系：在离心管中依次加入以下试剂(考虑到移液过程中的损耗，额外多准备5％)，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；
[0098][0099]
2)准备样本：从-80℃冰箱中取出细胞样本后，立即置于冰盒上，短暂离心大约5秒，立即放回冰盒上,同时用2.5μl te buffer作为扩增的空白对照；向所有的样本加入te buffer，补足至5.0μl，瞬时离心，置于冰盒上；
[0100]
3)向样本管中分别加入第一步制备的裂解体系5.0μl，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；
[0101][0102]
4)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)，按照如下条件进行：
[0103][0104]
b.预扩增
[0105]
此阶段需要的试剂：预扩增缓冲液、预扩增酶；室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心。
[0106]
1)根据下表，制备全基因组预扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰
盒待使用；
[0107][0108]
2)从pcr仪中取出细胞裂解反应结束的样本，置于冰盒上，向每管样本中加入上一步制备的全基因组预扩增反应体系10.0μl，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；
[0109][0110]
3)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)，按照如下条件进行：
[0111][0112]
c.扩增
[0113]
预先取出扩增试剂和标签列(gctcttccgatctkkkkkknntggg；gctcttccgatctkkkkkknngttt)，室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心；
[0114]
1)按下表准备扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；
[0115][0116]
2)在预扩增产物pcr管中加入20.0μl扩增反应体系；
[0117][0118]
3)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)，按照如下条件进行：
[0119][0120]
s2：文库纯化；
[0121]
1)现配适量的80％乙醇；
[0122]
2)使用前将纯化磁珠平衡至室温至少30min；
[0123]
3)向每个样品中加入等体积的磁珠50μl，轻轻涡旋混合均匀；
[0124]
4)将混合物在室温下孵育5min；
[0125]
5)瞬时离心，置于磁力架上2min，小心丢弃上清；
[0126]
6)向每个样本缓慢加入200μl现配的80％乙醇，于磁力架上孵育静止30s；然后小心地丢弃上清液，注意不要吸到或扰乱磁珠；
[0127]
7)重复步骤6)，共两次乙醇洗涤；
[0128]
8)瞬时离心，将剩余管壁液体离心至管底；
[0129]
9)在磁力架上孵育2min，然后小心地吸弃上清，敞开管盖，室温晾至磁珠表面无泛光(注意避免过度干燥，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖)；
[0130]
10)用40μl无核酸酶水重悬磁珠，将重悬混合物在室温下孵育2min；
[0131]
11)于磁力架上静置2min，转移38μl上清至新的1.5mlep管，纯化后文库样品可保存在-20℃，1个月内可用于上机测序，冻融次数不超过3次。
[0132]
s3：文库定量；
[0133]
1)纯化后的文库使用qubit荧光计进行文库定量：单个文库浓度应大于25ng/μl；
[0134]
2)qsep100生物片段分析仪检测片段长度，文库片段为600～1000bp。
[0135]
s4：混合文库制备；
[0136]
文库混合：根据qubit的定量结果，每个样本取等质量文库进行混合，若有空白对照，则空白对照混合量为样本取样体积的平均值。
[0137]
s5：接头转换及文库变性；
[0138]
使用“mgieasy通用文库转换试剂盒”，严格按照说明书操作。
[0139]
s6：dnb制备及测序；
[0140]
使用测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)于基因测序仪(mgiseq-200)上进行测序反应，严格按照说明书操作。
[0141]
s7：数据分析；
[0142]
使用胚胎染色体异倍体分析系统，进行数据分析，严格按照说明书操作。
[0143]
1)统计质控信息
[0144]
统计测序序列数(reads数)、碱基数、q20(质量值》20)、q30(质量值)30)、n比例、gc含量、比对率、基因组覆盖度(coverage)、冗余度(duplication)等信息。
[0145]
2)gc校正
[0146]
使用bwa软件将测序序列比对到参考基因组(版本号grch38)，将比对上参考基因组的有效序列分配到事先划分好的200kb片段大小的基因组(窗口)中，然后进行gc校正，详细步骤为：首先计算每个窗口区域的基因组gc含量；然后以样本所有窗口的序列数平均数与该gc含量水平内窗口序列平均数的比值作为窗口gc校正权重，重新计算窗口序列含量(reads count，rc)。
[0147]
3)标准化
[0148]
收集一组约100人相同实验流程的健康人样本作为阴性样本库，来自这组样本的bins可以作为正常的二倍体对照，确定样本内部的bins参考对应以用于标准化，使用200kb的bin，用于检测的异常大小在4mb以上拷贝数变异。
[0149]
在准备阴性样本库时，使用y染色体片段，在高斯混合模型下训练数据，将男性和女性样本进行区分，所有样本都使用常染色体作为阴性参考，不同的性别组用于产生性染色体阴性参考，当检测一个新样本时，就会自动预测性别，并选择正确的阴性参考库，以提高检测的准确性。
[0150]
4)循环二进制切割(circular binary segmentation，简称cbs)
[0151]
常染色体cbs使用r包dnacopy进行分析，其中参数α(检测断点的p-value)设定为
1e-5，每个segment至少包含两个bins，最后连续bins的平均值作为这个segement的ratio，循环二进制切割能够提高运行速度和检测效果，用阴性样本库中的突变信息对cbs和区段z-score进行权重分析，通过这个方法可以对不太精确的bins降低权值。
[0152]
5)黑名单过滤无信息位点
[0153]
人类基因组中存在大量充满问题的重复区，如微卫星、中心粒、端粒会妨碍短序列比对的正确性，这些位点会使得数据标准化变得非常复杂，因此需要建立黑名单，将这些区域进行标记过滤，以提高分析的准确性。
[0154]
6)噪音消除和降低
[0155]
观测到的中值信号方差msvo(median sigment variance)即一组方差的中位数，是对样本的噪声进行测量，其中每个方差对应于一个段的方差，预期的中位数段方差(mediansegment variance，简称msve)与存储单元大小和测序序列深度成反比，因为两者都定义了噪声，msvo是噪声的度量。公式如下：
[0156][0157]
7)判断结果
[0158]
染色体异常的计算使用log2进行度量，用观察到的拷贝数和预期拷贝数的比率(cn)表示。公式如下：
[0159]
染色体缺失：
[0160]
染色体重复：
[0161]
同时选择在与二倍体的任意1/3拷贝数偏差处构成畸变调用的边界，以得到更多真阳性的结果。其具体公式如下：
[0162]
拷贝数缺失：
[0163]
拷贝数重复：
[0164]
使z评分来判断染色体是否非整倍体，z分数的计算可以使用下面的公式：
[0165][0166]
公式z
segment(n
→
m)
表示bins从n到m所组成的segment的z-score，μw()利用参考构建时bins的差异程度得到的权重值来计数bins的均值，μ()和std(()计算一般的均值和标准差，rn代表所检测样本在bins n处的reads ratio，r2,n表示参考集中第二例样本在同一位点的reads ratio，总共有p个健康参考样本。
[0167]
根据现有阴性样本库，当z评分小于-0.5,可以判断该染色体是缺失结果，当z评分大于0.5，可以判断该染色体是重复结果。
[0168]
s8：查看报告
[0169]
a)若检测样本中的某条染色体的z评分值≥0.5或≤-0.5，则表示该样本的该染色体存在非整倍体异常，否则表示该次检测未发现非整倍体异常。
[0170]
b)若某条染色体的z评分值为0，应判定为此样本未检测出该染色体，同时对于常染色体而言，此种检测结果为阳性纯合缺失，对于性染色体而言，此种检测结果应将x、y检测结果共同判断；
[0171]
c)对于x、y染色体检测结果应共同判断，若x染色体检测结果为单体同时y染色体检测结果为单体，则此样本x、y染色体检测结果应判定为未发现非整倍体异常，不能分别判定为单体阳性(非整倍体异常)。
[0172]
本发明引入了简并寡核苷酸引物pcr(degenerate oligonucleotide primed pcr，dop-pcr)技术，该技术使用部分简并寡核苷酸引物进行pcr反应(引物中间含6个随机碱基)，首先使用较低的温度(～25℃)进行退火，随后再缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度(～55℃)进行多循环常规pcr反应，从而实现对全基因组的扩增，本本发明操作简单，人为接入的步骤相对malbac少很多，同时dna产物的产量也较高，数据分析方面引入了通过覆盖深度的方法来检测拷贝数变异，同时不对数据进行过滤和清洗，使用高斯混合模型下训练数据，利用低质量的数据进行信息分箱，提高分析结果的准确性，同时应用gc校正、循环二进制切割等分析方法，不仅数据利用率高，显著降低检测成本，同时相比传染分析方法其准确度更高。
[0173]
本发明的工作原理是：
[0174]
对从囊胚期胚胎获得的细胞进行扩增及建库，利用联合探针锚定聚合测序法对扩增产物进行全基因组水平上的测序，通过生物信息软件对测序结果进行分析，以此判断胚胎是否存在染色体非整倍体数量异常；
[0175]
胚胎细胞全基因组扩增通过低扩增偏好的方式进行，以尽可能无偏倚地保持样本原始dna信息。扩增分三步进行：裂解、预扩增和扩增。对胚胎细胞裂解后，使用具有特殊结构的随机引物及配套组分对基因组进行预扩增，形成结构相对稳定的预扩增产物。最后使用与预扩增引物的非随机部分的序列匹配的扩增引物及配套组分对基因组进行指数扩增，同时加上测序接头和样本识别标签序列；
[0176]
通过基于联合探针锚定聚合测序法仪(mgiseq-200)进行全基因组测序，利用生物信息学软件对测序结果进行分析，得到匹配到每条染色体上的有效序列数量，计算有效序列数量，与参考数据库中相应染色体序列数量的比值；若该比值过高，则该染色体可判断为三体或重复；若该比值过低，则该染色体可判断为单体或缺失，实现对染色体非整体异常的检测。
[0177]
下表为主要产品组分
[0178]
[0179][0180]
样本要求
[0181]
1.样本类型：
[0182]
囊胚期滋养层细胞活检样本。
[0183]
2.样本采集：
[0184]
将受精卵体外培养至囊胚期，按照常规胚胎活检技术对囊胚期胚胎进行取样，至少取3个细胞作为待检样本，将活检后的胚胎细胞使用1
×
pbs缓冲液(不含ca2+、mg2+)洗涤3次，然后将洗涤后的细胞(约含0.5μl 1
×
pbs缓冲液)小心转移至装有2.0μl 1
×
pbs缓冲液的pcr管中，体积不超过2.5μl。
[0185]
3.样本运输：
[0186]
干冰条件下运输；须确保样本送达时有足够的剩余干冰，且有缓冲装置，避免样本
管在运输过程中被干冰冰块挤破。采用干冰运输，运输时间不超过3天，如超出，需重新投放冷冻品(干冰)。
[0187]
4.样本保存
[0188]
采集的细胞样本应保存于-80℃冰箱中，保存时间不超过12个月，冻融次数不超过3次。
[0189]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其特征在于：其方法包括以下步骤，s1：全基因扩增，全基因扩增包括细胞裂解、预扩增和扩增；a.细胞裂解此阶段需要的试剂：细胞裂解缓冲液、细胞裂解酶、te buffer。1)配制裂解体系：在离心管中依次加入以下试剂，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；2)准备样本：从-80℃冰箱中取出细胞样本后，立即置于冰盒上，短暂离心大约5秒，立即放回冰盒上,同时用2.5μl te buffer作为扩增的空白对照；向所有的样本加入te buffer，补足至5.0μl，瞬时离心，置于冰盒上；3)向样本管中分别加入第一步制备的裂解体系5.0μl，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；4)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)；b.预扩增此阶段需要的试剂：预扩增缓冲液、预扩增酶；室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心。1)制备全基因组预扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；2)从pcr仪中取出细胞裂解反应结束的样本，置于冰盒上，向每管样本中加入上一步制备的全基因组预扩增反应体系10.0μl，请勿振荡，轻微地瞬时离心即可；3)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)；c.扩增预先取出扩增试剂和标签列(gctcttccgatctkkkkkknntggg；gctcttccgatctkkkkkknngttt)，室温融化后充分振荡混匀，瞬时离心；1)准备扩增反应体系，轻轻涡旋混合，短暂离心，并放入冰盒待使用；2)在预扩增产物pcr管中加入20.0μl扩增反应体系；3)设置pcr仪反应程序(热盖保持105℃)；s2：文库纯化；1)现配适量的80％乙醇；2)使用前将纯化磁珠平衡至室温至少30min；3)向每个样品中加入等体积的磁珠50μl，轻轻涡旋混合均匀；4)将混合物在室温下孵育5min；5)瞬时离心，置于磁力架上2min，小心丢弃上清；6)向每个样本缓慢加入200μl现配的80％乙醇，于磁力架上孵育静止30s；然后小心地丢弃上清液，注意不要吸到或扰乱磁珠；7)重复步骤6)，共两次乙醇洗涤；8)瞬时离心，将剩余管壁液体离心至管底；9)在磁力架上孵育2min，然后小心地吸弃上清，敞开管盖，室温晾至磁珠表面无泛光；10)用40μl无核酸酶水重悬磁珠，将重悬混合物在室温下孵育2min；11)于磁力架上静置2min，转移38μl上清至新的1.5mlep管，纯化后文库样品可保存在-20℃，1个月内可用于上机测序，冻融次数不超过3次。
s3：文库定量；1)纯化后的文库使用qubit荧光计进行文库定量：单个文库浓度应大于25ng/μl；2)qsep100生物片段分析仪检测片段长度，文库片段为600～1000bp。s4：混合文库制备；文库混合：根据qubit的定量结果，每个样本取等质量文库进行混合，若有空白对照，则空白对照混合量为样本取样体积的平均值。s5：接头转换及文库变性；使用“mgieasy通用文库转换试剂盒”，严格按照说明书操作。s6：dnb制备及测序；使用测序反应通用试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)于基因测序仪(mgiseq-200)上进行测序反应，严格按照说明书操作。s7：数据分析；使用胚胎染色体异倍体分析系统，进行数据分析，严格按照说明书操作。1)统计质控信息2)gc校正3)标准化4)循环二进制切割(circular binary segmentation，简称cbs)常染色体cbs使用r包dnacopy进行分析，其中参数α(检测断点的p-value)设定为1e-5，每个segment至少包含两个bins，最后连续bins的平均值作为这个segement的ratio，循环二进制切割能够提高运行速度和检测效果，用阴性样本库中的突变信息对cbs和区段z-score进行权重分析，通过这个方法可以对不太精确的bins降低权值。5)黑名单过滤无信息位点人类基因组中存在大量充满问题的重复区，如微卫星、中心粒、端粒会妨碍短序列比对的正确性，这些位点会使得数据标准化变得非常复杂，因此需要建立黑名单，将这些区域进行标记过滤，以提高分析的准确性。6)噪音消除和降低观测到的中值信号方差msvo(median sigment variance)即一组方差的中位数，是对样本的噪声进行测量，其中每个方差对应于一个段的方差，预期的中位数段方差(median segment variance，简称msve)与存储单元大小和测序序列深度成反比，因为两者都定义了噪声，msvo是噪声的度量。公式如下：7)判断结果染色体异常的计算使用log2进行度量，用观察到的拷贝数和预期拷贝数的比率(cn)表示。公式如下：染色体缺失：
染色体重复：同时选择在与二倍体的任意1/3拷贝数偏差处构成畸变调用的边界，以得到更多真阳性的结果。其具体公式如下：拷贝数缺失：拷贝数重复：使z评分来判断染色体是否非整倍体，z分数的计算可以使用下面的公式：公式z
segment(n
→
m)
表示bins从n到m所组成的segment的z-score，μw()利用参考构建时bins的差异程度得到的权重值来计数bins的均值，m()和std(()计算一般的均值和标准差，rn代表所检测样本在bins n处的reads ratio，r2,n表示参考集中第二例样本在同一位点的reads ratio，总共有p个健康参考样本。根据现有阴性样本库，当z评分小于-0.5,可以判断该染色体是缺失结果，当z评分大于0.5，可以判断该染色体是重复结果。s8：查看报告a)若检测样本中的某条染色体的z评分值≥0.5或≤-0.5，则表示该样本的该染色体存在非整倍体异常，否则表示该次检测未发现非整倍体异常。b)若某条染色体的z评分值为0，应判定为此样本未检测出该染色体，同时对于常染色体而言，此种检测结果为阳性纯合缺失，对于性染色体而言，此种检测结果应将x、y检测结果共同判断；c)对于x、y染色体检测结果应共同判断，若x染色体检测结果为单体同时y染色体检测结果为单体，则此样本x、y染色体检测结果应判定为未发现非整倍体异常，不能分别判定为单体阳性(非整倍体异常)；d)如图所示为最终的分析结果可视化图形。2.根据权利要求1所述的一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其特征在于：所述s1中细胞裂解时配制裂解体系中考虑到移液过程中的损耗，需额外多准备5％的细胞裂解缓冲液、细胞裂解酶和te buffer试剂。3.根据权利要求1所述的一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其特征在于：所述s2中第9条在操作过程中应注意避免过度干燥，如磁珠有裂纹出现须盖好管盖。4.根据权利要求1所述的一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其特征在于：所述s7中统计质控信息包括统计测序序列数(reads数)、碱基数、q20(质量值>20)、q30(质量值)30)、n比例、gc含量、比对率、基因组覆盖度(coverage)、冗余度(duplication)等信息。5.根据权利要求1所述的一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其特征在
于：所述s7中gc校正使用bwa软件将测序序列比对到参考基因组(版本号grch38)，将比对上参考基因组的有效序列分配到事先划分好的200kb片段大小的基因组(窗口)中，然后进行gc校正，详细步骤为：首先计算每个窗口区域的基因组gc含量；然后以样本所有窗口的序列数平均数与该gc含量水平内窗口序列平均数的比值作为窗口gc校正权重，重新计算窗口序列含量(reads count，rc)。6.根据权利要求1所述的一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，其特征在于：所述s7中标准化实施步骤为收集一组约100人相同实验流程的健康人样本作为阴性样本库，来自这组样本的bins可以作为正常的二倍体对照，确定样本内部的bins参考对应以用于标准化，使用200kb的bin，用于检测的异常大小在4mb以上拷贝数变异，在准备阴性样本库时，使用y染色体片段，在高斯混合模型下训练数据，将男性和女性样本进行区分，所有样本都使用常染色体作为阴性参考，不同的性别组用于产生性染色体阴性参考，当检测一个新样本时，就会自动预测性别，并选择正确的阴性参考库，以提高检测的准确性。

技术总结
本发明公开了一种用于检测胚胎植入前染色体非整倍体的方法，本发明使用部分简并寡核苷酸引物进行PCR反应(引物中间含6个随机碱基)，首先使用较低的温度(～25℃)进行退火，随后再缓慢升温至引物延伸温度进行引物延伸，完成最初几个循环后，再使用较高的退火温度(～55℃)进行多循环常规PCR反应，从而实现对全基因组的扩增，本发明操作简单，人为接入的步骤相对MALBAC少，同时DNA产物的产量较高，引入了通过覆盖深度的方法来检测拷贝数变异，同时不对数据进行过滤和清洗，使用高斯混合模型下训练数据，利用低质量的数据进行信息分箱，提高分析结果的准确性，不仅数据利用率高，显著降低检测成本，同时相比传染分析方法其准确度更高。高。高。


技术研发人员：胡晶晶 李彩娜 崔茜
受保护的技术使用者：上海品峰医疗科技有限公司
技术研发日：2022.09.09
技术公布日：2023/8/21