盐肤木果实提取物及其制备方法和在制备防治痛风的药物、功能性食品中的应用与流程

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及盐肤木果实提取物及其制备方法和在制备防治痛风的药物、功能性食品中的应用。


背景技术：

2.痛风是一种由于尿酸钠晶体沉积于关节处引起的关节疾病。最初主要表现为关节滑膜炎导致的剧烈疼痛，最终引起关节损伤，畸形等危害，严重影响患者生活质量。据流行病学统计，在一些国家中成年人痛风的发病率超过10％，且发病率随着年龄的增加越来越高。目前，临床治疗痛风的药物主要有秋水仙碱和糖皮质激素等，但是这些药物通常具有明显的毒副作用，如胃肠道疾病，代谢紊乱等。研究发现，一些来源于可食用植物的天然产物具有较好的预防和治疗痛风的效果，具有价格低廉和无副作用等优点。因此，从天然可食性植物原料中开发一些价格低廉且无副作用的天然产物来防治痛风是非常必要且有意义的。
3.盐肤木(rhus chinensis mill.)，又称中国漆树，是漆树科的一种，广泛生长在中国、马来西亚等东南亚国家。民间记载，盐肤木果实通常既可以作为传统草药，预防或治疗许多疾病，包括肝病、炎症和腹泻，还可作为食品调味料和天然醋。中国国家卫生健康委员会已批准盐肤木果油作为一种新的食品资源，可作为食品生产中日常使用的食用油。但是，目前尚未有关于盐肤木果实或其提取物防治痛风的研究报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供盐肤木果实提取物及其制备方法和在制备防治痛风的药物中的应用。本发明通过向大鼠关节注射尿酸钠诱导的痛风模型，发现盐肤木果实提取物对尿酸钠诱导的大鼠痛风具有很好的预防和缓解作用；本发明为盐肤木果实提供了新的用途。
5.本发明提供了一种盐肤木果实提取物的制备方法，包括以下步骤：将盐肤木果实与质量浓度为70％～90％的乙醇水溶液混合，超声提取，收集滤液、浓缩、冷冻干燥即得。
6.优选的，所述乙醇水溶液的质量浓度为77％～83％。
7.优选的，所述盐肤木果实与乙醇水溶液的质量体积比为1g：(3～8)ml。
8.优选的，所述超声提取的温度为23～27℃，所述超声提取的次数为1～3次，每一次超声提取的时间为25～35min，所述超声提取的功率为200w。
9.本发明提供了所述的制备方法制备获得的盐肤木果实提取物。
10.本发明还提供了所述的盐肤木果实提取物在制备防治痛风的药物中的应用。
11.优选的，所述药物为口服制剂。
12.优选的，所述口服制剂中盐肤木果实提取物的含量为5％～95％。
13.本发明还提供了所述的盐肤木果实提取物在制备防治痛风的功能性食品中的应用。
14.优选的，所述功能性食品中盐肤木果实提取物的含量为1％～10％。
15.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明为盐肤木果实发掘了新的功能性食品或医疗用途，开拓了盐肤木果实新的研究领域；本发明提供的制备方法制备获得的盐肤木果实提取物在较低剂量下可以有效地预防和改善痛风疾病，且盐肤木果实提取物来自于可食用的天然植物原材料，安全性高。
附图说明
16.图1为盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物对大鼠注射尿酸钠后不同时间段踝关节肿胀率的影响；所有值都表示为均值
±
s.e.(n＝8)；同一时间柱状图的不同字母表示有显著差异(p＜0.05)；其中c为对照组；m为模型组；p为阳性组(1mg/kg b.w秋水仙碱)；yl为低剂量组(400mg/kg b.w样品)；yh为高剂量组(800mg/kg b.w样品)；
17.图2为尿酸钠诱导的痛风大鼠踝关节形态图及滑膜组织he染色结果；其中a为大鼠鼠踝关节直观图，a中的c为对照组；m为模型组；p为阳性组(1mg/kg b.w秋水仙碱)；yl为低剂量组(400mg/kg b.w样品)；yh为高剂量组(800mg/kg b.w样品)；图2中的b和c分别为滑膜组织组织he染色切片100倍和200倍拍摄的结果；
18.图3为盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物对痛风大鼠踝关节组织中sod、gsh、mda和mpo水平的影响；所有值都表示为均值
±
s.e.(n＝8)；同一柱状图的不同字母表示有显著差异(p＜0.05)；其中sod为超氧化物歧化酶；gsh为谷胱甘肽；mda为丙二醛；mpo为髓过氧化物酶；c为对照组；m为模型组；p为阳性组(1mg/kg b.w秋水仙碱)；yl为低剂量组(400mg/kg b.w样品)；yh为高剂量组(800mg/kgb.w样品)；
19.图4为盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物对痛风大鼠血浆(a)和关节滑液(b)中il-1β、il-6和tnf-α水平的影响；所有值都表示为均值
±
s.e.(n＝8)；同一柱状图的不同字母表示有显著差异(p＜0.05)；il-1β为白介素(il)1β；il-6为白介素6；tnf-α为肿瘤坏死因子α；c为对照组；m为模型组；p为阳性组(1mg/kgb.w秋水仙碱)；yl为低剂量组(400mg/kg b.w样品)；yh为高剂量组(800mg/kg b.w样品)；
20.图5为痛风大鼠滑膜组织p-nf-κb免疫荧光结果；其中c为对照组；m为模型组；p为阳性组(1mg/kg b.w秋水仙碱)；yl为低剂量组(400mg/kg b.w样品)；yh为高剂量组(800mg/kg b.w样品)。
具体实施方式
21.本发明提供了一种盐肤木果实提取物的制备方法，包括以下步骤：将盐肤木果实与质量浓度为70％～90％的乙醇水溶液混合，超声提取，收集滤液、浓缩、冷冻干燥即得。
22.在本发明中，首先将盐肤木果实与乙醇水溶液混合，超声提取。在本发明中，所述乙醇水溶液的质量浓度优选为77％～83％，进一步优选为78～82％，更进一步优选为80％。本发明对所述盐肤木果实的来源没有特殊限定，采用本领域常规来源干燥的盐肤木果实即可。本发明在所述盐肤木果实与乙醇水溶液混合前，优选的对干燥的盐肤木果实进行粉碎、过筛，收集筛下组分。本发明对所述粉碎的方法没有特殊限定，采用本领域常规的粉碎方法即可，所述过筛的筛网孔径优选为40-60目。在本发明中，所述盐肤木果实与乙醇水溶液的质量体积比优选为1g：(3～8)ml，进一步优选为1g：(4～6)ml，更进一步优选为1g：5ml。在本
发明中，所述超声提取的温度优选为23～27℃，进一步优选为24～26℃，更进一步优选为25℃；所述超声提取的次数优选为1～3次，进一步优选为2次；每一次超声提取的时间优选为25～35min，进一步优选为28～32min，更进一步优选为30min；所述超声提取的功率优选为200w。在本发明中，第二次或第三次提取是以第一次提取后的滤渣为原料与乙醇水溶液混合进行的提取。在本发明中，所述第二次或第三次提取时的参数条件优选的与第一次提取时保持一致。
23.本发明在所述超声提取结束后，收集滤液；所述收集滤液的方式优选为过滤；在本发明中，所述过滤优选的采用布氏漏斗滤纸负压抽滤进行；在本发明中，当提取次数大于1时，所述收集滤液在过滤后，优选的还包括合并多次提取的滤液。
24.本发明在收集滤液后，对滤液进行浓缩和冷冻干燥即获得盐肤木果实提取物。在本发明中，所述浓缩的方法优选旋转蒸发仪45℃蒸发浓缩，所述浓缩的倍数优选为5倍；所述冷冻干燥的温度优选为-52℃，所述冷冻干燥的时间优选为48小时。
25.本发明还提供了所述的制备方法制备获得的盐肤木果实提取物。
26.本发明还提供了所述的盐肤木果实提取物在制备防治痛风的药物中的应用。
27.在本发明中，所述药物优选为口服制剂；所述口服制剂中盐肤木果实提取物的含量优选为5％～95％，进一步优选为10％～80％。在本发明中，所述药物优选的包括所述盐肤木果实提取物和其药学上可接受的辅料，本发明所述辅料优选的包括蜂蜜、葡萄糖、有机微量元素锌、有机微量元素铁、硬脂酸镁和环糊精中的一种或几种；在本发明中，所述药物中蜂蜜的质量百分含量优选为0.5％～1.5％，更优选为1％，所述药物中葡萄糖的含量优选为4％～6％，更优选为5％；所述药物中有机微量元素锌的含量为每100g提取物添加70～80mg，所述药物中有机微量元素铁的含量为100g提取物添加14～18mg；所述药物中硬脂酸镁的质量百分含量优选为0.1％～1％，进一步优选为0.2％～0.8％；所述药物中环糊精的质量百分含量优选为5～10％，进一步优选为6％～9％。
28.本发明还提供了所述的盐肤木果实提取物在制备防治痛风的功能性食品中的应用。在本发明中，所述功能性食品中盐肤木果实提取物的含量优选为1％～50％。在本发明中，所述功能性食品优选为咀嚼片，所述咀嚼片的辅料优选糖粉、甘露醇、聚维酮、硬脂酸镁和可压性淀粉中的一种或几种；在本发明中，所述咀嚼片中糖粉的质量百分含量优选为30％～40％，进一步优选为32％～38％；所述咀嚼片中甘露醇的含量优选为10％～15％，进一步优选为11％～14％，所述咀嚼片中聚维酮的含量优选3％～5％，更优选为4％；所述咀嚼片中硬脂酸镁的含量优选0.1％～1％，进一步优选为0.2％～0.8％；所述咀嚼片中可压性淀粉的含量优选为10％～15％，进一步优选为11％～14％。
29.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1
31.盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物的制备
32.具体方法如下：将质量浓度80％的乙醇水溶液1l与盐肤木果实200g混合进行超声提取；提取温度为25℃，提取时间为30min，超声功率为200w，第一次提取结束后，室温4000r离心15min收集上清液和底部沉渣，并采用布氏漏斗滤纸负压抽滤上清液，收集滤液和滤渣。将沉渣和滤渣与1l质量浓度80％的乙醇水溶液混合复提一次，复提的温度、时间和功率
与第一次提取时保持一致；过滤后，将两次提取的滤液合并，再进行使用旋转蒸发仪45℃浓缩约5倍至水溶液。并于-30℃冷冻后使用冷冻干燥机温度为-52℃真空度为《0.1mpa冷冻干燥48小时制得。
33.实施例2
34.通过踝关节腔注射尿酸钠溶液的方法建立大鼠痛风模型，通过动物模型试验观察盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物对尿酸钠诱导的痛风的防治作用。
35.试验材料
36.动物
37.spf雄性sd大鼠(180～220g)，购买自湖南斯莱克景达试验动物有限公司。
38.盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物，制备方法参见实施例1记载。
39.造模与检测
40.雄性sd大鼠都是体重为180～220g的spf级。具体是把40只大鼠分成5组(每组8只)，各组分别为：对照组(c组)、模型组(m组)、阳性对照组(p组，1mg/kg b.w.秋水仙碱)、低剂量组(yl组，400mg/kg b.w.提取物)、高剂量组(yh组，800mg/kg b.w.提取物)。试验开始后，c组和m组每天给予灌胃生理盐水，p组每天给予灌胃秋水仙碱，灌胃剂量为1mg/kg b.w.，yl组每天给予灌胃盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物，灌胃剂量为400mg/kg b.w，yh组每天给予灌胃盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物，灌胃剂量为800mg/kgb.w.，连续灌胃28天。将尿酸钠超声溶于无菌生理盐水中，浓度为25mg/ml。m组、p组、yl组以及yh组大鼠试验第28天，异氟烷麻醉后每只大鼠踝关节腔注射100μl尿酸钠溶液，c组注射相同剂量的无菌生理盐水，并于注射后4h，8h，12h，24h和48h记录后右踝周径，计算关节肿胀率。注射48h后所有小鼠禁食12h，用异氟烷麻醉后，用含肝素锂的采血管腹腔静脉取血，离心后取血浆-80℃保存用于后续血液指标的测定。采集关节腔滑液和踝关节上下0.5cm关节组织，并取大鼠右踝关节组织用4％多聚甲醛固定后用做踝关节滑膜组织切片，其余关节组织于-80℃保存用于后续生化指标和蛋白免疫印记的测定。
41.苏木精-伊红(h&e)切片的制作和观察
42.采用苏木精-伊红(h&e)染色对关节滑膜组织进行组织病理学评价，具体方法如下:用4％多聚甲醛固定滑膜组织，石蜡包埋，切片5μm。然后，对每个切片进行脱蜡、染色并使用olympus ix83显微镜在100和200倍的放大倍数下和观察。
43.血浆和关节滑液炎症因子的评价
44.采用相应的酶联免疫吸附测定试剂盒按说明书检测血浆和关节滑液中炎症因子(il-1β、il-6、tnf-α)水平。
45.滑膜组织p-nf-κb免疫荧光分析
46.免疫荧光法检测滑膜组织中p-nf-κβ蛋白的表达。滑膜组织切片用5％牛血清白蛋白(bsa)溶液封闭30min,4℃一抗孵育过夜，然后用pbs洗涤3次，与含青蓝染料兔抗性的二抗结合。细胞核用6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)染色。最后使用olympus ix83显微镜对所有切片进行评价。
47.试验结果
48.踝关节肿胀率
49.图1为大鼠踝关节注射尿酸钠后不同时间段踝关节肿胀率。由图1可以看出，注射
4h，除c组其余组关节均出现肿胀，但m组显著高于秋水仙碱组(p组)和样品预处理组(yl组和yh组)(p＜0.05)。8h后，模型组关节肿胀率上升，且m组远远高于秋水仙碱组(p组)和样品预处理组(yl组和yh组)。12h时各组关节肿胀率达到峰值，且m组远远高于秋水仙碱组(p组)和样品预处理组(yl组和yh组)，但p组和yh显著低于yl组，24h各组肿胀率有所下降，但m组仍显著高于其余组(p＜0.05)，p组显著低yl组和yh组，而yh组显著低于yl组(p＜0.05)。48h后m组仍显著高于其余组，yh组显著低于p组和yl组，p组显著低于yl组(p＜0.05)。上述结果表明盐肤木果实80％乙醇水溶液能够有效的抑制尿酸钠引发的踝关节局部组织肿大，且其高剂量改善效果与阳性药物相当。
50.滑膜组织病理学分析
51.图2为尿酸钠诱导痛风的大鼠踝关节直观图和滑膜组织病理学分析结果。通过关节直观图(图2中的a)可以清晰显示c组踝关节无明显肿胀，而m组踝关节组织肿胀明显，p组、yl组和yh组肿胀有不同程度的改善。从he组织病理学切片(图2中的b和c)可以看出，c组滑膜组织形态结构正常，而m组(痛风组)滑膜组织中出现大量炎症细胞浸润，而秋水仙碱组(p组)和样品预处理组(yl组和yh组)均有显著改善了尿酸钠诱导痛风的滑膜组织炎症性损伤，尤其高剂量组，滑膜组织未出现炎症细胞浸润现象。
52.组织生化指标
53.图3为尿酸钠诱导痛风的大鼠关节组织生化指标结果。在关节组织中，与c组相比，m组sod、gsh、mda和mpo水平均发生了显著变化(p＜0.05)。但与m组相比，p组和yl组、yh组所有指标均有显著改善(p＜0.05)。yh组和p组mda和mpo水平均显著低于m组和yl组(p＜0.05)，且yh组两个指标均与c组无显著差异(p＞0.05)。
54.血浆和关节滑液炎症因子水平评估
55.图4为血浆和关节滑液中炎症因子il-1β，il-6以及tnf-α水平。与c组比较，m组血浆和关节滑液中il-1β、il-6、tnf-α显著升高(p＜0.05)。与m组比较，p组和yh组显著改善了所有指标(p＜0.05)，yl组显著降低了血液中tnf-α水平以及滑液中il-1β和il-6水平(p＜0.05)。另外，yh组的血浆il-6和tnf-α与c组无明显差异(p＞0.05)。
56.滑膜组织p-nf-κb免疫荧光
57.图5为尿酸钠诱导痛风的大鼠滑膜组织p-nf-κb免疫荧光。p-nf-κb是组织炎症调节蛋白，当表达升高时，会促进组织炎症反应。由免疫荧光结果显示可以看出，m组滑膜组织细胞核中出现大量p-nf-κb阳性信号，而yh组和c组只有少量的p-nf-κb阳性信号在细胞核中，而p组和yl组虽有部分阳性信号但明显少于m组。
58.实施例3
59.含有盐肤木果实提取物的咀嚼片
60.以质量份数计，组成如下：实施例1制备的盐肤木果实80％乙醇水溶液提取物33.5份、糖粉35份、甘露醇的含量12份、聚维酮4份、硬脂酸镁0.5份、可压性淀粉15份。
61.按照常规的咀嚼片的制备方法制备获得含有盐肤木果实提取物的咀嚼片。
62.由上述实施例可知，本发明提供的盐肤木果实提取物能够有效地预防和/或缓解尿酸钠引起的大鼠痛风。因此，盐肤木果实提取物能够用来开发防治痛风的药物或功能性食品，具有非常好的应用前景。
63.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种盐肤木果实提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将盐肤木果实与体积浓度为70％～90％的乙醇水溶液混合，超声提取，收集滤液、浓缩、冷冻干燥即得。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的质量浓度为77％～83％。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述盐肤木果实与乙醇水溶液的质量体积比为1g：(3～8)ml。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述超声提取的温度为23～27℃，所述超声提取的次数为1～3次，每一次超声提取的时间为25～35min，所述超声提取的功率为200w。5.权利要求1～4任意一项所述的制备方法制备获得的盐肤木果实提取物。6.权利要求5所述的盐肤木果实提取物在制备防治痛风的药物中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述口服制剂中盐肤木果实提取物的含量为5％～95％。9.权利要求5所述的盐肤木果实提取物在制备防治痛风的功能性食品中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述功能性食品中盐肤木果实提取物的含量为1％～10％。

技术总结
本发明提供了盐肤木果实提取物在制备防治痛风的药物或功能性食品中的应用，属于食品医药技术领域，本发明通过动物试验对盐肤木果实提取物防治痛风进行了检测；试验结果表明盐肤木果实的80％乙醇水溶液提取物对痛风有显著的预防和改善作用。盐肤木果实是食用植物调味料，同时属于常规粮油经济作物，安全性高，分布广泛、原料易得；综合上述原因，盐肤木果实提取物对于痛风的防治效果好，在药物和功能性食品方面拥有非常好的开发利用前景。品方面拥有非常好的开发利用前景。品方面拥有非常好的开发利用前景。


技术研发人员：蔡圣宝 马楠 李铁 王春丽
受保护的技术使用者：李铁
技术研发日：2022.02.09
技术公布日：2023/8/21