一种产聚基因工程菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物采油及生物工程领域，具体涉及一种产聚基因工程菌及其应用。


背景技术：

2.在油田开发过程中，聚合物驱是化学驱的主体，在油田开发后期维持稳产的过程中具有重要支撑作用。微生物采油技术作为油田开发的新型技术，相比化学驱油技术，开发的产品具有绿色环保、无毒性污染，可促进能源生产、发展环保产业、推动能源的清洁安全高效利用。通过生物聚合物逐步取代化学聚合物，减少碳排放，可广泛应用于取代化学聚合物驱的油田、聚驱后的油藏，以及进行选择性封堵的强化水驱油藏。
3.微生物胞外聚合物就是一种可以用于取代化学聚合物的生物聚合物，微生物胞外聚合物一般是通过筛选优良菌株、优化发酵培养基及发酵条件等方式，产量均得到了一定的优化，但如何从分子水平提升产量还具有一定的难度。胞外聚合物属于微生物的次生代谢产物，在分子生物学层面，其相关基因涉及到磷酸糖的合成、核糖前体物二磷酸核苷糖的合成、五糖重复单元的合成组装及分泌。分子调控的关键基因覆盖了前体物合成阶段的基因调控、信号分子调控、以及其它因子的调控。整个基因表达和代谢途径复杂而冗长，现有技术中存在的菌株对于微生物胞外聚合物产量和功能的提升具有局限性。因此，亟需提供一种实现微生物胞外聚合物产量和功能均提升的菌株。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的在于：提供一种产聚基因工程菌及其应用，该菌株产生的胞外聚合物在产量和黏度都较野生菌株更高，代谢产生的胞外聚合物具有耐高温的特性。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明公开了一种产聚基因工程菌，所述的产聚基因工程菌用于制备胞外聚合物。
7.优选地，所述的胞外聚合物用于石油开采。
8.优选地，所述的产聚基因工程菌采用发酵的方法制备胞外聚合物，发酵的具体条件如下：发酵温度28-32℃，发酵时间6-12天，发酵培养基的成分如下：碳源40g/l、氮源4g/l、caco33g/l、kh2po45g/l、mgso40.5g/l、feso40.25g/l、一水柠檬酸1.0g/l、发酵培养基的ph 7.0；
9.其中，所述氮源为氯化铵，碳源为葡萄糖。
10.优选地，在相同发酵条件下，所述产聚基因工程菌和野生菌相比，产聚基因工程菌的胞外聚合物产量提高了23.9-25％，黏度提高了17-35.7％；
11.其中，所述野生菌为产聚基因工程菌的出发菌株，野生菌命名为xanthomonas campestris，gdm编号为gim1.857。
12.优选地，所述产聚基因工程菌，名称为xanthomonas campestris wl，于2022年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24297。
13.本发明还公开了一种产聚基因工程菌的应用，用于制备胞外聚合物。
14.优选地，所述的胞外聚合物用于石油开采。
15.优选地，所述的产聚基因工程菌采用发酵的方法制备胞外聚合物，发酵的具体条件如下：发酵温度28-32℃，发酵时间6-12天，发酵培养基的成分如下：碳源40g/l、氮源4g/l、caco33g/l、kh2po45g/l、mgso40.5g/l、feso40.25g/l、一水柠檬酸1.0g/l、发酵培养基的ph 7.0；
16.其中，所述氮源为氯化铵，碳源为葡萄糖。
17.优选地，在相同发酵条件下，所述产聚基因工程菌和野生菌相比，产聚基因工程菌的胞外聚合物产量提高了23.9-25％，黏度提高了17-35.7％；
18.其中，所述野生菌为产聚基因工程菌的出发菌株，野生菌命名为xanthomonas campestris，gdm编号为gim1.857。
19.优选地，所述产聚基因工程菌，名称为xanthomonas campestris wl，于2022年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24297。
20.本发明的有益效果在于：
21.1、本发明提供的产聚基因工程菌产生的胞外聚合物在产量和黏度都较野生菌株更高，代谢产生的胞外聚合物具有耐高温的特性。
22.2、本发明提供的碳源和氮源种类优化的发酵基础无机盐培养基配方，以提高菌株的胞外聚合物产量。通过无机盐培养基配方取代传统的富营养培养基配方，降低油田开发的成本。
23.3、本发明提供所述的产聚基因工程菌在取代化学聚合物驱的油藏、聚驱后油藏，以及进行选择性封堵的强化水驱油藏中应用，在提高采收率方面具有广泛的应用价值。
24.本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1氮源种类对菌株生长的影响；
27.图2碳源种类对菌株生长和胞外聚合物产量的影响；
28.图3xanthomonas campestris全基因组系统发育树；
29.图4xanthomonas campestris合成胞外聚合物的关键基因解析；
30.图5等离子体诱变后菌株的初筛培养结果；
31.图6等离子体诱变后复筛的wl菌培养结果；
32.图7产聚基因工程菌的黏温曲线。
具体实施方式
33.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.本发明公开了一种产聚基因工程菌，用于制备胞外聚合物。
35.优选地，所述的胞外聚合物用于石油开采。
36.优选地，所述的产聚基因工程菌采用发酵的方法制备胞外聚合物，发酵的具体条件如下：发酵温度28-32℃(最佳发酵温度为30℃)，发酵时间6-12天，发酵培养基的成分如下：碳源40g/l、氮源4g/l、caco33g/l、kh2po45g/l、mgso40.5g/l、feso40.25g/l、一水柠檬酸1.0g/l，发酵培养基的ph 7.0。
37.优选地，所述氮源为氯化铵，碳源为葡萄糖。
38.优选地，所述产聚基因工程菌和野生菌相比，产聚基因工程菌的胞外聚合物产量提高了23.9-25％，黏度提高了17-35.7％；
39.其中，所述野生菌为产聚基因工程菌的出发菌株，野生菌命名为xanthomonas campestris，gdm编号为gim1.857。
40.优选地，所述产聚基因工程菌，名称为xanthomonas campestris wl，于2022年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.24297。
41.本发明还公开了一种产聚基因工程菌的应用，用于制备胞外聚合物。
42.优选地，所述的胞外聚合物用于石油开采，所述的胞外聚合物能够提高石油采收率。
43.优选地，所述的产聚基因工程菌采用发酵的方法制备胞外聚合物，发酵的具体条件如下：发酵温度28-32℃(最佳发酵温度为30℃)，发酵时间6-12天，发酵培养基的成分如下：碳源40g/l、氮源4g/l、caco33g/l、kh2po45g/l、mgso40.5g/l、feso40.25g/l、一水柠檬酸1.0g/l，发酵培养基的ph 7.0。
44.优选地，所述氮源为氯化铵，碳源为葡萄糖。
45.优选地，所述产聚基因工程菌和野生菌相比，产聚基因工程菌的胞外聚合物产量提高了23.9-25％，黏度提高了17-35.7％；
46.其中，所述野生菌为产聚基因工程菌的出发菌株，野生菌命名为xanthomonas campestris，gdm编号为gim1.857。
47.优选地，所述产聚基因工程菌，名称为xanthomonas campestris wl，于2022年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.24297。
48.下面给出具体的实施例来说明本发明的产聚基因工程菌株及其构建方法，以及其在提高石油采收率的应用。
49.实施例1：氮源种类对菌株(野生菌xanthomonas campestris)生长的影响。
50.xanthomonas campestris(gdm编号gim1.857)以葡萄糖为碳源，比较分别以4g/l
硝酸钾、尿素、氯化铵为氮源，其他培养基成分如表1所示。在发酵体积为0.2l，发酵转速为110rpm，发酵温度30℃的条件下培养。经过10-12天的发酵培养，根据菌株的生长曲线表明，该野生菌在以氯化铵为氮源时生长状况最好，其次在以硝酸钾为氮源时生长良好，而在尿素为氮源的条件下不生长，如图1所示。因此优选氯化铵作为氮源(od
600
代表菌体细胞浓度)。
51.表1发酵基础培养基成分表
[0052][0053][0054]
实施例2：碳源种类对菌株(野生菌xanthomonas campestris)生长和胞外聚合物产量的影响。
[0055]
xanthomonas campestris以氯化铵为氮源，分别以40g/l葡萄糖、蔗糖、甘油为碳源，其他培养基成分如表1所示。在发酵体积为0.2l，发酵转速110rpm，发酵温度30℃的条件下培养，如图2所示。其中，od
600
表示菌体细胞浓度。以甘油为碳源时，与不添加碳源的对照组相比，菌株基本不生长；以葡萄糖为碳源时，随着时间的增加，胞外聚合物不断产生而浓度增加，葡萄糖被消耗而浓度降低；以蔗糖为碳源时，随着时间的增加，胞外聚合物不断产生而浓度增加，蔗糖被消耗而浓度降低。经过13天的发酵培养，发现该菌株不能利用甘油生长，而在以葡萄糖和蔗糖为碳源时均能生长良好。在胞外聚合物的产量上，在培养第6天时达到最高峰，以葡萄糖作为碳源的产量(1.627g/l)远高于以蔗糖为碳源的产量(0.953g/l)，因此优选葡萄糖作为碳源。
[0056]
实施例3：全基因组中胞外聚合物相关合成基因的分析。
[0057]
对菌株xanthomonas campestris的16s rdna扩增后测序，在ncbi数据库比对后发现与其相似度最高的菌株，通过碱基系列比对，形成与其他近缘种的16s rdna系统进化树，如图3所示。查找相关文献确定胞外聚合物的关键基因。核酸糖合成关键基因：xana、xanb、pgi、galu、ugd；胞外聚合物合成关键基因：gumbcdefghijklm，有12个共簇基因。针对野生菌
的全基因组，在uniprot官网比对相关合成基因建库，将目标基因进行比对后，筛选出目标基因，如图4所示，说明该菌株在基因组上具有产胞外聚合物的潜力。
[0058]
实施例4：产聚基因工程菌的构建方法。
[0059]
本发明以xanthomonas campestris(gdm编号gim1.857)为出发菌株，提供了一种产聚基因工程菌的构建方法。在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、oh自由基等)浓度的等离子体射流。高浓度的等离子体射流可以使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。针对诱变育种的微生物，采用特殊的培养基进行筛选，快速获得具有产量和黏度都提升的产聚基因工程菌株；具体步骤如下：
[0060]
(1)菌株的活化。将xanthomonas campestris(gdm编号gim1.857)从-80℃冰箱中取出，解冻2-3min；将解冻的菌株离心(4℃、12000r/min、2min)，弃去上清液，在超净工作台进行划线操作；若离心后分层不明显，则用移液枪吸取底部菌液，采用涂布法，接种后放入25℃培养箱培养24h。在无菌环境条件下，用灭菌牙签挑取已生长菌落置入lb液体培养基中继续振荡培养(25℃、200r/min)24h后得到种子液。
[0061]
(2)菌悬液制备。菌体所形成的单细胞悬液越均匀分散，诱变效果越好。此外，选用处于生长旺盛的对数生长期的细胞，以有利于诱变处理的效果。将种子液发酵培养34h后，取发酵液100ml，12000r/min下离心5min后舍弃上清，加入等量生理盐水洗涤2次，再重新加入等量生理盐水均匀混合后，菌体细胞均匀分散后稀释调整至108/ml菌体。
[0062]
(3)诱变与培养。将要突变的菌株在摇瓶中培养至指数期后进行等离子体突变。将10μl培养物浸在无菌不锈钢板上，射频功率输入设为100w，等离子炬喷嘴出口与样品板之间的距离为2mm，空气流量为10ml/min，等离子流温度为25～35℃。为了找到最佳的诱变处理时间，等离子处理时间设置为0～120s。洗涤细菌样品，然后将其涂在准备好的钢板上进行诱变。诱变后，将钢板浸入含有1ml无菌水的ep管中，以10-5
～10-10
的稀释倍数涂布平板。
[0063]
(4)初筛和复筛。将诱变后的菌株稀释后涂在初筛培养基平板上(如图5所示，图5中黑色小字是在实验过程中，为了作记录和标记，可以忽略。)，初筛平板配方为：蛋白胨5g，葡萄糖20g，氯化钠2g，琼脂15g，补充蒸馏水至1l。再将生长出的单克隆挑至液体培养基中扩大培养(如图6所示，图6中左边图为诱变处理20s得到菌(即wl菌株)的培养结果，图6中右边图为未诱变处理菌(即野生菌株)的培养结果)，复筛培养基配方如表1所示发酵基础培养基，最终筛选到20s诱变条件下的功能强化的产聚基因工程菌株。
[0064]
实施例5：wl菌(本发明的产聚基因工程菌)与野生菌的胞外聚合物产量和黏度比较。
[0065]
在40g/l葡萄糖为碳源，4g/l氯化铵或4g/l蛋白胨为氮源时，其他培养基成分如表1所示，发酵体积0.4l，发酵转速110rpm，发酵温度30℃的条件下培养时，发酵第6天野生菌和基因工程菌wl的胞外聚合物产量及其黏度如表2所示。相比野生菌，wl菌的胞外聚合物产量提高了23.9-25％，黏度提高了17-35.7％。在成本较低的氯化铵培养基中实现了产量提升23.9％，黏度提升35.7％。
[0066]
表2不同氮源条件下的胞外聚合物产量和黏度(20℃)
[0067][0068]
实施例6：wl菌(本发明的产聚基因工程菌)与野生菌产生的胞外聚合物随温度变化情况。
[0069]
在40g/l葡萄糖，4g/l氯化铵,其他培养基成分如表1所示，发酵体积0.4l，发酵转速110rpm，发酵温度30℃的条件下培养。收集胞外聚合物后，在20℃、40℃、60℃、80℃和100℃下分别测黏度。如图7所示，随着温度的升高，胞外聚合物的黏度先缓慢降低再升高，在100℃时，wl菌的胞外聚合物黏度达377mpa.s。
[0070]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种产聚基因工程菌，其特征在于，所述的产聚基因工程菌用于制备胞外聚合物。2.根据权利要求1所述的一种产聚基因工程菌，其特征在于，所述的胞外聚合物用于石油开采。3.根据权利要求2所述的一种产聚基因工程菌，其特征在于，所述的产聚基因工程菌采用发酵的方法制备胞外聚合物，发酵的具体条件如下：发酵温度28-32℃，发酵时间6-12天，发酵培养基的成分如下：碳源40g/l、氮源4g/l、caco33g/l、kh2po45g/l、mgso40.5g/l、feso40.25g/l、一水柠檬酸1.0g/l，发酵培养基的ph 7.0；其中，所述氮源为氯化铵，碳源为葡萄糖。4.根据权利要求3所述的一种产聚基因工程菌，其特征在于，在相同发酵条件下，所述产聚基因工程菌和野生菌相比，产聚基因工程菌的胞外聚合物产量提高了23.9-25％，黏度提高了17-35.7％；其中，所述野生菌为产聚基因工程菌的出发菌株，野生菌命名为xanthomonas campestris，gdm编号为gim1.857。5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种产聚基因工程菌，其特征在于，所述产聚基因工程菌，名称为xanthomonas campestriswl，于2022年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24297。6.一种产聚基因工程菌的应用，其特征在于，用于制备胞外聚合物。7.根据权利要求6所述的一种产聚基因工程菌的应用，其特征在于，所述的胞外聚合物用于石油开采。8.根据权利要求7所述的一种产聚基因工程菌的应用，其特征在于，所述的产聚基因工程菌采用发酵的方法制备胞外聚合物，发酵的具体条件如下：发酵温度28-32℃，发酵时间6-12天，发酵培养基的成分如下：碳源40g/l、氮源4g/l、caco33g/l、kh2po45g/l、mgso40.5g/l、feso40.25g/l、一水柠檬酸1.0g/l，发酵培养基的ph 7.0；其中，所述氮源为氯化铵，碳源为葡萄糖。9.根据权利要求8所述的一种产聚基因工程菌的应用，其特征在于，在相同发酵条件下，所述产聚基因工程菌和野生菌相比，产聚基因工程菌的胞外聚合物产量提高了23.9-25％，黏度提高了17-35.7％；其中，所述野生菌为产聚基因工程菌的出发菌株，野生菌命名为xanthomonas campestris，gdm编号为gim1.857。10.根据权利要求6-9任意一项所述的一种产聚基因工程菌的应用，其特征在于，所述产聚基因工程菌，名称为xanthomonas campestris wl，于2022年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24297。

技术总结
本发明公开了一种产聚基因工程菌及其应用，所述的产聚基因工程菌用于制备胞外聚合物，所述的胞外聚合物用于石油开采。本发明提供的产聚基因工程菌产生的胞外聚合物在产量和黏度都较野生菌株更高，代谢产生的胞外聚合物具有耐高温的特性。物具有耐高温的特性。物具有耐高温的特性。


技术研发人员：王璐 宋文枫 苟敏 汤岳琴 田茂章 吕伟峰 王鸿 周炜 周新宇 廉黎明 黄佳
受保护的技术使用者：中国石油天然气股份有限公司
技术研发日：2022.02.09
技术公布日：2023/8/21