亚铁离子在防治传染性脾肾坏死病毒感染中的应用

1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及亚铁离子的医药用途，含有亚铁离子的化合物可用于制备预防和治疗传染性脾肾坏死病毒(isknv)感染的药物。


背景技术：

2.传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus，isknv)属虹彩病毒科，病毒为150-170nm的正二十面体粒子，遗传物质为双链dna。isknv造成的传染性脾肾坏死病特征为脾脏、肾脏、大脑和心脏的组织病变，以及脾肾组织的细胞肿大，在适宜温度下，致死率高达100％。该病毒能够感染超50种海洋及淡水鱼类，对水产养殖业造成了严重危害。亚太地区是isknv的主要流行区，而近年来，北美、欧洲、印度等地的观赏鱼及养殖鱼中也相继报道isknv的感染实例，该病毒已经在世界各地广泛传播。
3.目前，水产养殖领域针对isknv的防治方法较为有限。一方面，养殖户使用常见消毒用药聚维酮碘、二氧化氯消杀，辅以氟苯尼考等抗生素预防isknv感染，但抗生素的使用易造成水体污染，并且对于已经感染病毒的动物效果不佳。另一方面，较为温和的免疫增强剂如中草药、黄芪多糖、维生素、免疫多糖等也被用于预防和治疗isknv感染，尽管具有副作用小、药残低的特点，仅调节免疫功能同样无法有效治疗传染性脾肾坏死疾病，主要起到预防作用。传染性脾肾坏死疾病的有效治疗手段难寻，是isknv防治的主要瓶颈。
4.亚铁离子在生命活动中承担着重要功能，是合成血红蛋白、肌红蛋白等的重要原料；同时，铁作为催化剂在氧化还原反应中进行电子交换，是机体生命活动的基础。在机体免疫功能方面，铁能够通过影响细胞色素氧化酶及触媒的合成并激活多种酶如琥珀脱氢酸、黄嘌呤氧化酶的活性，进而影响t、b淋巴细胞的增殖，红细胞的免疫黏附及体内免疫球蛋白合成等多项免疫过程。由于亚铁离子在多项生命活动中的广泛影响，其在机体免疫过程中同样至关重要，直接应用含亚铁离子药物可能为防治水生病毒疾病提供新的见解。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供亚铁离子在制备防治传染性脾肾坏死病毒(isknv)感染药物中的应用，抗病毒实验证实亚铁离子对于isknv病毒感染起到保护作用，亚铁离子能够显著抑制鱼类离体培养细胞中isknv相关基因(包括orf006，orf119)的转录，进而抑制病毒增殖。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.亚铁离子在防治isknv病毒感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染isknv的epc细胞系经1mm fecl2处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，fecl2处理之后，epc细胞中病毒相关基因(包括orf006，orf119)的转录被显著抑制。本发明通过建立细胞感染isknv病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知亚铁离子适用于isknv的病毒防治。
8.亚铁离子作为预防或治疗isknv病毒感染的药物，可以以注射剂或口服剂形式使
用，具有给药剂量低，成分单一，防治效果佳的优点。
附图说明
9.图1为fecl2对isknv感染细胞产生细胞病变效应的影响。
10.图2为fecl2对细胞中isknv病毒增殖的影响。
11.图3为fecl2对细胞中isknv病毒基因转录水平的影响。
12.图4为fecl2对细胞增殖的影响。
具体实施方式
13.实施例1：fecl2对isknv感染细胞产生细胞病变效应的影响
14.通过抗病毒实验检测细胞感染isknv后的病变效应。在24孔细胞培养板中进行。取生长状态良好的epc细胞传代接入24孔板，28℃、5％ co2培养过夜；接种moi＝1的isknv，同时使用1mm fecl2处理；接种后继续培养72h，待细胞病变效应完全出现，使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜(贴壁细胞被染色)，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。结果如图1所示，1mm fecl2处理后的感染病毒细胞中，细胞脱落形成的空斑显著减少。
15.实施例2：fecl2对细胞中isknv病毒增殖的影响
16.通过计算半数组织培养感染剂量(tcid
50
)表示isknv在细胞中的滴度。在24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。取生长状态良好的epc细胞传代接入24孔板培养过夜，接种moi＝1的isknv，同时使用1mm fecl2处理。接种后继续培养72h，待细胞病变效应完全出现，吸取上清液，每孔各200μl，冻存至-80℃备用。另取生长状态良好的epc细胞传代接入96孔板培养过夜，将上清液进行10倍的连续稀释，然后加入(100μl)到96孔板中培养的单层epc细胞上。继续培养72h，待细胞病变效应完全出现，去除培养基，4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜。根据染色结果，使用reed和muench两氏法计算病毒滴度
1.。结果如图2，1mm fecl2处理后，isknv病毒滴度显著降低。
17.实施例3：fecl2对细胞中isknv病毒基因转录水平的影响
18.检测感染isknv之后的细胞用1mm fecl2处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的epc细胞传代接入6孔板培养过夜。过夜生长的单层细胞接种moi＝1的isknv，同时用1mm fecl2处理。接种后继续培养24h，吸尽细胞培养基，用trizol(invitrogen)裂解细胞后提取细胞总rna，由goscript逆转录试剂盒(promega)逆转录得到cdna。通过qpcr检测病毒相关基因的转录水平，包括isknv相关基因orf006、orf119，相关方法参照文献
2.。结果表明：1mm fecl2处理后，细胞中isknv基因orf006、orf119的转录水平显著下降(图3)。
19.实施例4：fecl2对细胞增殖的影响
20.使用细胞增殖实验cell counting kit-8(cck-8)检测fecl2对细胞增殖的影响。具体使用cck-8(dojindo,kumamoto,japan)，按照制造商的说明进行。将epc细胞传代接入96孔培养板中培养，同时使用1mm fecl2处理。用等体积的dmso处理的细胞作为对照。在fecl2处理12h后，将10μl cck-8溶液加入培养液中，继续培养8h。期间在0.5h、1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、8.0h分别使用酶标仪在450nm处测定细胞的吸光度，以指示细胞增殖情况。结果
显示，1mm fecl2处理对细胞增殖无明显毒性作用(图4)。
21.参考文献：
22.[1]reed l j,muench h.asimple method of estimating fifty percent endpoints[j].american journal of epidemiology,1938,27(3):493-497.
[0023]
[2]long-feng lu,et al.fish herpesvirus klp manipulates beclin1 to selectively degrade mitathrough a precise autophagic manner for immune evasion[j].water biology and security,2023,2.1:100092.

技术特征：
1.含有亚铁离子的化合物在制备防治水生病毒感染的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的水生病毒为传染性脾肾坏死病毒。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的亚铁离子的化合物为氯化亚铁。

技术总结
本发明公开了亚铁离子（Fe


技术研发人员：李卓聪 李顺 陆龙凤
受保护的技术使用者：中国科学院水生生物研究所
技术研发日：2023.04.20
技术公布日：2023/8/22