用于ASD的生物标志物及其应用的制作方法

用于asd的生物标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及疾病基因检测及诊断技术领域，特别是涉及一种用于asd的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders，asd)以社交沟通障碍为核心特征，对患者及其家庭的身心健康影响巨大。asd目前的全球发病率约为0.6％-1％。asd诊断对针对性的治疗有着重要的意义。但目前asd具体的致病机制未明，主流的观点认为主要与遗传和环境有关，数据显示asd是高度可遗传的疾病，其遗传性大约为80％(74-93％)。一般通过检测患者的cnv和基因突变来判断其是否患病，目前研究已知有1000多个基因被发现可能与asd遗传风险相关，其中大多数基因都和大脑不同功能区域之间的正常神经发育和连接密切相关，如fmr1、shank3和mecp2等基因突变和拷贝数变异等，已知与asd相关的基因或cnv见sfari官网，https://www.sfari.org/resource/sfari-gene/。然而，这众多的asd相关的致病或易感基因，说明了asd基因异常的异质性，也造成了诊断困难的现状。因此，目前诊断asd主要靠行为打分等表型进行判断，基因检测仅作为诊断的辅助手段。
3.而由于asd的基因异质性，asd的易感基因突变的检出率非常低，不足20％，这造成了诊断asd的困难。且基因检测asd往往需要检测cnv以及相关基因的有害突变，需要使用全基因组芯片或全基因组测序的方法扫描全基因的cnv，罕见突变需要使用全外或全基因组测序的方法检测，这大大增加了检测成本。同时，绝大多数的asd患者中往往无法检测到已知的相关基因突变，这造成检测了也无法进行基因诊断的现状。
4.另外，基因突变及cnv的突变检测涉及到上千基因及全基因组范围，全外测序、芯片cnv检测或全基因组测序均需较高的检测成本。因此，开发一套性价比高且可帮助asd诊断的产品具有较大的市场应用价值。


技术实现要素：

5.基于此，有必要针对上述asd基因检测检出率低、成本高的问题，提供一种用于asd的生物标志物，对此生物标志物进行检测，能够较好的分析获得个体asd的患病风险。
6.一种用于asd的生物标志物，包括以下基因位点：
7.8.[0009][0010]
研究发现，经典asd的遗传异常可能源于多个基因常见变异(common variants)，如单核苷酸变异(snv)，包括新发的和遗传性的，这些变异过去认为“不致病”，没有明确临床意义，但目前推测可能以数量性状遗传或累加性效应方式增加个体asd的遗传易感性，其中一些基因作用较大，称为主效基因(major gene)，一些基因作用小，称为微效基因(minor gene)。如果个体变异的基因数量大，或者包含了主效基因异常，则遗传易感性大，反之亦然。
[0011]
基于上述研究基础和思考，本发明人认为asd可能是由多种变异积累而导致的多基因风险因素，因此，我们通过选择特定的风险基因突变位点组合，并根据其风险效益进行累加权的方法，利用多基因风险评分来预测其患asd的风险，可为临床诊断asd提供一定的判断依据，上述生物标志物即为能够较好预测asd风险的基因位点组合。
[0012]
在其中一个实施例中，该生物标志物包括以下snp风险等位基因：1:9347278:g:a；1:9755273:g:a；1:22523128:at:a；1:44935688:a:at；1:45056293:g:a；1:56798308:a:g；1:58647705:c:a；1:63529371:c:a；1:86465821:a:g；1:87629310:g:a；1:99505519:g:a；1:111088759:g:a；1:145536082:g:a；1:145547963:g:a；1:161219361:g:a；1:161658658:g:
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[0013]
每个snp风险等位基因中，第一个冒号前后分别表示染色体号和位点位置，第三个冒号前后分别表示突变前碱基和突变后碱基。
[0014]
本发明还公开了上述的生物标志物在制备用于辅助诊断asd的试剂中的应用。
[0015]
可以理解的，上述试剂可选用本领域通用试剂及方法，可用于检测上述特定的生物标志物基因信息即可。
[0016]
本发明还公开了一种用于辅助诊断asd的panel，包括用于检测上述的生物标志物的试剂。
[0017]
可以理解的，上述panel可按照本领域通用的panel设计即可，关键在于选择的检测基因位点组合为上述生物标志物。
[0018]
本发明还公开了一种用于辅助诊断asd的检测系统，包括：
[0019]
检测装置，用于检测待测样本中上述的生物标志物，获得每个snp的位点信息；
[0020]
分析装置，获取上述每个snp的效应值，累加得到总效应值，将总效应值与预设阈值进行比较判断，得到asd患病风险，以及
[0021]
输出装置，用于将上述asd患病风险结果输出。
[0022]
上述检测系统，在获得每个snp的位点信息后，根据不同snp的效应值，累加得到总效应值，以累加的总效应值评估asd患病风险，可将主效基因和微效基因均合理的整合在一起，达到较好的评估效果。
[0023]
在其中一个实施例中，所述分析装置中，按照以下公式计算得到总效应值：
[0024]
总效应值＝β1x1+β2x2+
…
+βkxk+
…
+βnxn
[0025]
其中：βk为每个snp的效应值，xk为待测样本每个snp的风险等位基因数目，n为283个snp。
[0026]
在其中一个实施例中，每个snp的效应值取自如下β值
±
10％的区间：
[0027]
[0028]
[0029]
[0030][0031][0032]
或者
[0033]
每个snp的效应值取自如下β值
±
10％的区间：
[0034]
[0035]
[0036]
[0037][0038]
在其中一个实施例中，上述效应值取自β值
±
5％的区间、β值
±
3％的区间、β值
±
2％的区间、β值
±
1％的区间、β值
±
0.5％的区间。
[0039]
可以理解的，snp效应值可通过采用大样本数进行检测后分析得到，但采用上述snp效应值，具有评估准确性高的优势。
[0040]
在其中一个实施例中，所述分析装置中，按照以下方法进行比较判断：当所述总效应值≥阈值，则判断为asd高风险。
[0041]
在其中一个实施例中，所述阈值为7-10。可以理解的，该阈值可根据人群样本测序数据后，综合临床评估情况确定。本发明人经过大量样本的实验后得出，采用上述条件，判断为asd高风险的asd患病概率较高，且总体上较为平均分散，具有较好的效能。
[0042]
本发明还公开了一种非诊断治疗用途的asd的检测方法，包括以下步骤：
[0043]
基因检测：检测待测样本中上述的生物标志物基因信息，获得每个snp的位点信息；
[0044]
效应值分析：获取上述每个snp的效应值，累加得到总效应值，将总效应值与预设阈值进行比较判断，得到asd患病风险大小。
[0045]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0046]
本发明的用于asd的生物标志物，是通过风险基因的筛选及基因连锁确定了283个asd风险位点的组合，并利用这些风险等位基因的效用值计算其累加asd风险，结合prs分数范围，对个体asd患病风险进行评估，其roc的auc值高达0.9423。将其组合形成panel，只需检测283个snp位点的小panel，大大节省了原来的检测费用，节省了成本。
[0047]
同时，还可根据每个位点的风险累加效用值，判断个体asd的患病风险，免去基因和cnv检测等主效基因的致病性判断，节省了时间和工作量，且提高了预测评估准确性。
附图说明
[0048]
图1为实施例1中实验方法流程图；
[0049]
图2为实施例2和4中以最佳效应值beta best在各测试组和验证集中的总效应值；
[0050]
图3为实施例3和4中以整体效应值beta all在各测试组和验证集中的总效应值；
[0051]
图4为实施例4中验证集的roc曲线图。
具体实施方式
[0052]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0053]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0054]
以下实施例所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。
[0055]
实施例1
[0056]
一种用于asd的生物标志物，通过以下方法研究发现。
[0057]
1、asd样本收集及突变数据整理
[0058]
为了寻找asd评估的辅助诊断的基因突变panel，我们首先收集asd样本的突变数据。
[0059]
本实施例中共收集了591例asd患者(asd组)及500例非asd患者(对照组)的cytoscan hd芯片的测序数据。cytoscan hd芯片是thermo fisher scientific公司生产的染色体微阵列芯片，可检测全基因组的cnv(拷贝数变异)，亦包含了约750,000个snp标记物。
[0060]
我们通过thermo fisher scientific公司的chas软件对每个个体的snp进行提取，并整理成群体突变的vcf格式的文件。由于芯片数据仅提供不到75万个snp标记物，为了扩大snp的范围，因此我们需要对数据进行全基因组填充。我们使用网站进行填充(westlake imputation server，https://imputationserver.westlake.edu.cn/help/help/help.html)，该服务网站提供9千多单倍型及超过4000万个常染色体突变，可有效提供可靠准确的全基因组填充数据。
[0061]
按照本领域的常规填充手段，通过全基因组填充后，我们使用maf》1％和r2》0.8的过滤条件(即最小等位基因频率大于1％及填充可靠度大约80％的位点)对所有位点进行过滤，获得4,291,808个高质量snp位点。
[0062]
2、snp组合的确定及其效应值的计算
[0063]
我们采用了8:2的比例随机抽取asd组和对照组的样本，分别进行基础数据分析及验证分析，并重复10次。
[0064]
(1)所有snp对asd患病的风险效应值评估。
[0065]
我们先采用所有的样本，及591例asd患者组及500例对照组进行全基因组关联分析，使用regenie v3.1.1软件的firth逻辑回归模型，采用firth似然比检验(firth likelihood ratio test)获得每个snp风险等位基因的效应值。然后根据上述的10次重复的随机提取的基础样本(8/10，即414例asd患者和350例对照样本)，使用同样的方法，获得10次所有snp的asd患病的风险效应评估值(beta，β)。
[0066]
(2)多基因风险评估测试
[0067]
使用prsice 2.3.1.e软件，对10次重复的测试样本(2/10，即177例asd患者和150例正常对照样本)进行多基因风险评估测试，通过随机计算的9837种不同的snp组合，每种组合均使用线性回归的r2进行判断，获得10次测试中每个组合的最佳snp组合，并使用roc曲线进行效能验证。测试结果见表1。
[0068]
表1.测试集中最佳snp组合的个数及其效能
[0069][0070][0071]
从表1可以看出，10个随机的测试集的平均roc可达0.7221，最高值可达0.7548，相比不足20％的致病基因突变检测率，具有较好的预测效能。
[0072]
3、snp组合的效能验证
[0073]
为了找出最佳的snp组合，我们将以上的测试集的各最佳snp组合进行并集整合，获得了283个snp的组合，作为本发明的最佳snp组合panel。为了方便研究，这些snp的风险等位基因的asd的在各自测试中的效应值(beta best)及在整体的效应值(beta all)，见下表。
[0074]
表2.各snp的效应值
[0075]
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081][0082]
注：上述snp表述第一个冒号前后分别表示染色体号和位点位置，第三个冒号前后分别表示突变前碱基和突变后碱基，如“1:9347278:g:a”表示此snp为1号染色体的第9347278位碱基，突变前为g，突变后为a；“1:205740437:aaaag:a”表示此snp为1号染色体的第205740437位碱基，突变前为aaaag，突变后为a。上述freq指人群发生频率。
[0083]
上述snp的风险等位基因即为用于辅助诊断评估asd的生物标志物。
[0084]
实施例2
[0085]
本实施例使用实施例1得到的283个snp在各组测试中的最佳效应值beta best，通过使用283个snp的组合，根据以下公式计算总效应值(total effect)：
[0086]
total effect＝β1x1+β2x2+
…
+βkxk+
…
+βnxn[0087]
式中，βk为每个snp的效应值，xk为待测样本在该snp位点的风险等位基因数目，n为283个snp。
[0088]
据此，我们计算出验证人群(10次随机的177例asd患者和150例正常对照样本)的总效应值的roc，如图1和表3所示。
[0089]
表3.以最佳效应值beta best加权的283snp panel在各测试组中的效能
[0090][0091][0092]
从表3可以看出，各测试集的roc平均值可达0.9398，总效应值的范围从负20多到
正五六十，平均值约为10左右，中值基本在9左右，总效应值大于中值的asd患病概率约为89.20％，总体上较为平均分散，具有辅助诊断asd的效能。
[0093]
实施例3
[0094]
本实施例使用实施例1得到的283个snp在在整体的风险效应值beta all，通过使用283个snp的组合，参照实施例2的方法，我们计算出同样验证人群(10次随机的177例asd患者和150例正常对照样本)的总效应值的roc，如表4所示。
[0095]
表4.以总效应值beta all加权的283snp panel在各测试组中的效能
[0096][0097]
上述结果与实施例2的结果相差不大，但总的roc平均值为0.9423，比实施例2中较高。且加权风险效应值范围也相对缩窄了，平均值降为7左右，中值为6左右，总效应值大于中值以上的患病率平均值为88.96％，总体上较为平均分散，具有辅助诊断asd的效能，且比实施例2略佳。
[0098]
实施例4
[0099]
为了进一步验证本发明asd风险评估的可靠性，我们使用beta best和beta all的数据，分别测试了不同来源样本的数据集，包括7个asd的患者及405个其他数据的样本(根据asd的患病率为2-4％不等，其中可能存在asd的样本)，以上述数据集作为验证集(verify)进行分析。结果如图2-4所示。
[0100]
从结果可以看到，正常人群(对照组)以beta best和beta all统计的总效应值范围分别为-17.08～25.75，和-10.35～17.607，中值分别为5.61和3.72，均在测试的范围之内，且显著低于asd组。
[0101]
7个asd样本数据的总效应值分别为：以beta best计算为7.807～21.172，中值为13.328；以beta all计算为5.247～13.647，中值为8.282，与asd组的分布也基本吻合。
[0102]
本实施例中，将405样本的人群及7个asd数据进行roc分析，以beta best计和以beta all计的roc分别为0.804(95％ci：0.681～0.9261)及0.801(95％ci：0.695～0.9064)，相差不大，具体见图4。
[0103]
综上所述，采用本发明的snp作为生物标志物和加权算法，可通过加权效应值，对roc风险进行分析评估，并可达到辅助诊断的预测要求。
[0104]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存
在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0105]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种用于asd的生物标志物，其特征在于，包括以下基因位点：
2.根据权利要求1所述的用于asd的生物标志物，其特征在于，包括以下snp风险等位基因：1:9347278:g:a；1:9755273:g:a；1:22523128:at:a；1:44935688:a:at；1:45056293:g:a；1:56798308:a:g；1:58647705:c:a；1:63529371:c:a；1:86465821:a:g；1:87629310:g:a；1:99505519:g:a；1:111088759:g:a；1:145536082:g:a；1:145547963:g:a；1:161219361:g:a；1:161658658:g:a；1:162320978:c:t；1:190061806:c:a；1:194232033:g:a；1:205740437:aaaag:a；1:221465080:g:gtaatt；1:223180844:c:t；1:229826077:atggt:a；1:
231968283:g:a；1:232787053:g:a；1:232858468:t:c；1:238273454:t:c；2:2644858:a:c；2:5680859:ta:t；2:9071427:a:c；2:11540489:t:c；2:24243127:t:c；2:37465344:g:t；2:52163147:t:c；2:76533082:a:g；2:76800193:c:a；2:80080287:c:a；2:101490450:g:gt；2:113382684:g:a；2:119042700:g:a；2:124450103:c:t；2:136464965:c:t；2:173038064:a:g；2:179260382:a:g；2:189851887:c:t；2:191234995:c:t；2:224558743:t:g；3:11670061:a:g；3:13273299:c:t；3:23017012:c:t；3:24734617:g:a；3:70967199:t:c；3:73296564:c:t；3:112379369:c:a；3:151478769:t:c；3:159719132:a:g；3:197812186:a:g；4:4261796:a:g；4:6422476:a:c；4:19902437:a:c；4:23871590:a:g；4:26486816:ca:c；4:26494411:c:t；4:32270753:cttg:c；4:35129586:c:t；4:42875791:c:t；4:58166176:a:g；4:63390201:c:t；4:111121841:a:g；4:134893186:g:a；4:175065243:c:t；4:179940751:t:c；4:182847899:c:t；4:184256979:a:g；4:185856878:a:g；5:61092625:c:a；5:61882534:c:t；5:63977000:g:a；5:72526505:c:t；5:76683468:tctc:t；5:79074229:t:c；5:135384092:c:t；5:144012547:ca:c；5:145813950:c:t；5:153304569:g:a；5:155323482:caa:c；5:157032783:c:a；5:172829796:ct:c；5:173136667:g:a；6:1490104:g:t；6:10035866:c:a；6:13161138:c:t；6:13940796:a:c；6:17432373:g:a；6:21901658:a:c；6:46118413:a:g；6:56297437:g:a；6:61977078:c:t；6:71117655:g:a；6:73899718:c:ca；6:93916121:c:a；6:123469051:a:ac；6:125475645:g:t；6:130955699:a:g；6:151618825:c:t；6:164065525:a:g；7:7804891:a:g；7:14360034:a:g；7:14592662:t:g；7:22046220:c:a；7:29206680:c:a；7:32061610:t:c；7:45459733:g:a；7:49202075:c:t；7:69755860:a:g；7:87986355:a:g；7:88231767:g:a；7:89621864:g:t；7:130876979:a:aaatat；7:133391858:a:g；8:1588469:g:a；8:3725241:a:g；8:8338592:g:a；8:9097737:ta:t；8:14318719:a:g；8:14601428:c:t；8:19032221:g:a；8:19187642:a:g；8:24897820:t:g；8:32595943:t:tac；8:39112600:t:c；8:59314113:t:g；8:59810877:c:t；8:60251078:t:c；8:63602687:c:t；8:98623084:g:a；8:115484185:t:tcaca；8:116921178:attg:a；9:7280488:g:a；9:9777805:a:c；9:27173180:c:t；9:28228958:a:g；9:29517349:a:g；9:30043590:g:a；9:32537141:t:g；9:80935588:tgtccatccatccaacc:t；9:91189753:c:t；9:95679005:c:t；9:103249058:a:g；9:120512867:t:c；9:123708286:ca:c；10:5388149:t:g；10:26956626:t:c；10:29972550:a:g；10:48524247:c:a；10:48628441:t:c；10:51564487:a:aaaaag；10:82702830:a:g；10:99770333:a:g；10:105214932:t:c；10:107441454:t:c；10:108530976:gt:g；10:121030127:c:t；10:128081737:a:c；11:3173813:t:c；11:19604832:g:t；11:21431441:g:a；11:21915113:g:a；11:42490143:g:a；11:47298201:c:t；11:51215645:c:a；11:51533354:a:g；11:60266616:at:a；11:63598690:a:g；11:72263122:g:a；11:75124132:c:t；11:81582575:a:c；11:86957273:c:a；11:94679823:g:a；11:99367849:a:g；11:115025905:ctttttttttttttt:c；11:128467030:g:a；11:130264515:g:a；12:526482:a:g；12:18205835:t:c；12:31112670:a:g；12:39070505:a:g；12:46830041:g:a；12:47906340:g:a；12:52489247:t:c；12:97867811:a:g；12:116056547:a:c；12:121887194:a:g；13:24441156:gccaacacttc:g；13:30689441:g:a；13:64906150:ctt:c；13:75040462:t:c；13:77039814:g:a；13:102123480:a:c；13:104279232:t:c；13:104358672:t:c；13:107553786:c:t；14:22763063:g:a；14:49069193:g:a；14:54221497:a:c；14:55330566:g:
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…
+β
k
x
k
+
…
+β
n
x
n
其中：β
k
为每个snp的效应值，x
k
为待测样本每个snp的风险等位基因数目，n为283个snp。7.根据权利要求6所述的检测系统，其特征在于，每个snp的效应值取自如下β值
±
10％的区间：
或者每个snp的效应值取自如下β值
±
10％的区间：
8.根据权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述分析装置中，按照以下方法进行比较判断：当所述总效应值≥阈值，则判断为asd高风险。9.根据权利要求8所述的检测系统，其特征在于，所述阈值为7-10。10.一种非诊断治疗用途的asd的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：基因检测：检测待测样本中权利要求1或2所述的生物标志物基因信息，获得每个snp的位点信息；效应值分析：获取上述每个snp的效应值，累加得到总效应值，将总效应值与预设阈值进行比较判断，得到asd患病风险大小。

技术总结
本发明涉及一种用于ASD的生物标志物及其应用，属于疾病基因检测及诊断技术领域。该生物标志物包括283个SNP位点。可通过选择特定的风险基因突变位点，并根据其风险效益进行累加权的方法，及多基因风险评分来预测其患ASD的风险，帮助临床诊断ASD提供一定的判断依据，免去了基因和CNV检测等主效基因的致病性判断，节省了时间和工量，且具有预测评估准确性高的特点。特点。特点。


技术研发人员：蒙裕欢 林俊维 沈茂婷 范喜杰 陈涛 梁耀铭 于世辉
受保护的技术使用者：广州金域医学检验中心有限公司 广州金域医学检验集团股份有限公司
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/8/22