与莲藕节间形状相关的SNP分子标记及其应用

与莲藕节间形状相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及作物育种技术领域，更具体地说，本发明涉及一种与莲藕节间形状相关的snp分子标记、检测莲藕节间形状相关性状的引物及其应用。


背景技术：

2.莲(nelumbo nucifera gaertn.)又称莲藕，是莲科莲属多年生水生草本植物。莲藕是我国栽培面积最大的水生蔬菜，其主要食用部位是膨大的地下根状茎，即藕。节间形状是藕的重要外观品质，直接影响消费者的喜好和其商品价值，是莲藕育种的主要目标性状。莲藕节间形状主要有短筒形、中筒形和长筒形，节间形状主要由节间长度决定。目前，全国各地的主栽品种以短筒形和中筒形的鄂莲系列品种为主，产量较高，但节间较粗，不适用于生产鲜切藕片等加工产品，且过短的节间会导致藕商品性降低。各地的莲藕地方品种多为长筒形，部分特色品种口感较好，但因产量较低逐渐被淘汰。因此，培育节间形状适宜的高产优质品种已成为莲藕育种的重要方向，但迄今为止控制莲藕节间形状的基因位点还未见报道。因此，挖掘控制莲藕节间形状的基因位点并开发相关分子标记对于莲藕育种具有重要意义。
3.parms(penta-primer amplification refractory mutation system)技术是新开发的一种snp基因分型技术，该技术利用五条引物(一对通用荧光引物、一对等位基因特异引物和一条反向共用引物)对snp或短indel位点进行等位基因特异性扩增，通过荧光扫描进行基因分型。与pcr/re(polymerase chain reaction/restriction enzyme)、page(polyacrylamide gel electrophoresis)等需要电泳基因分型的传统方法相比，parms技术具有操作简便、耗时短和成本低等优势。


技术实现要素：

4.本发明首先自鄂莲9号(e9)与山东本地莲藕品种zw2杂交f1代单株自交f2群体中发现莲藕节间形状性状分离，长短节间分离比符合3∶1，然后利用bsa-seq和遗传连锁分析的方法，定位到一个控制莲藕节间形状的隐性基因，定位区间内筛选出一个和基因共分离的snp分子标记，开发了该snp标记的parms引物。上述的标记和引物可以直接用于莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲藕节间形状相关性状，提高工作效率，为莲藕分子育种提供有效的技术支持。
5.为实现上述目的，采用的技术方案如下：一种与莲藕节间形状相关的snp分子标记，其特征是，所述snp分子标记位于第1号染色体第143127799碱基，该处碱基为a或g。
6.在本发明的一些实施例中，所述snp分子标记的gg基因型对应的莲藕为短节间(属于极短至短节间范围)，所述snp分子标记的aa或ag基因型对应的莲藕为长节间(属于中长至长节间范围)。
7.本发明的另一目的是提供一种检测莲藕节间形状相关性状的parms引物，所述引物可以扩增上述snp分子标记，具体为：
8.引物序列如下，
9.s1-234-f1(seq id no:1)：
10.gaaggtgaccaagttcatgctccctctctgctcccttctatctata；
11.s1-234-f2(seq id no:2)：
12.gaaggtcggagtcaacggattccctctctgctcccttctatctatg；
13.s1-234-r(seq id no:3)：
14.aggaagctattgaacatgcaaagg。
15.本发明还提供了上述snp分子标记、引物在莲藕分子标记辅助育种中的应用。
16.本发明还提供了上述snp分子标记、引物在莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定方面的应用。
17.采用上述的snp分子标记、引物进行莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定的方法，其特征是，
18.(1)以待检测莲藕的dna为模板，利用如seq id no:1-3所示的parms扩增引物进行touchdown pcr扩增，获得扩增产物；
19.(2)pcr产物用quantstudio 5荧光定量pcr仪genotyping模式采集fam和hex荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图；
20.(3)在基因分型图中，右下角的分型结果为g:g，对应短节间莲藕样品，中间部分分型结果为a:g，对应长节间莲藕样品；左上角的分型结果为a:a，对应长节间莲藕样品。
21.其中pcr扩增体系(10μl)：5μl 2
×
parms master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μl10mm s1-234-f1引物，0.15μl 10mm s1-234-f2引物，0.4μl 10mm反向共用引物s1-234-r，0.5μl模板dna，3.8μl ddh2o。pcr反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.(1)本发明利用bsa-seq和遗传连锁分析的方法，定位到一个控制莲藕节间形状的snp分子标记，并继而开发了扩增该snp分子标记的parms引物。本发明首次获得了控制莲藕节间形状的基因位点并开发相关分子标记对于莲藕育种具有重要意义。
24.(2)本发明的snp分子标记准确性好，根据snp分子标记和parms引物，可以直接用于莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲藕节间形状相关性状，提高了工作效率，为莲藕分子育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
附图说明
25.图1为本发明实施例1中f2群体中的长节间莲藕和短节间莲藕；
26.图2为本发明实施例1中莲藕节间形状基因定位图；
27.图3为本发明实施例2中利用snp分子标记对f2群体600株单株检测的基因分型图；其中，红色为短节间莲藕样品，蓝色为长节间莲藕样品，绿色为长节间莲藕样品，黑色为空白对照。
具体实施方式
28.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
29.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
30.在本发明中的其中一个方面，采用结合bsa-seq和遗传连锁分析方法进行snp变异位点查找，发现与莲藕节间形状相关的snp位点位于1号染色体上，143127799bp位置，该处的碱基为a或g，可作为控制莲藕节间形状相关性状的snp分子标记。
31.在本发明的另一方面，根据查找到的与莲藕节间形状相关的snp分子标记，进一步设计了检测snp变异位点的parms引物。
32.若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本发明所用试剂均有市售。
33.以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
34.实施例1：莲藕节间形状基因定位及snp标记parms引物开发
35.本实施例查找到与莲藕节间形状相关基因的snp位点，并针对该snp位点设计parms引物。具体包括以下步骤：
36.1、从鄂莲9号(e9)与山东本地莲藕品种zw2杂交f1代中选择了一个单株(编号f
1-003)，自交获得160株f2群体，经多年莲藕节间形状相关性状表型鉴定，该f2群体可分为两类，一类莲藕表现为短节间，一类表现为长节间(图1)。
37.2、遗传分析：f2群体莲藕节间长度和节间形状系数均呈典型的双峰分布，经卡平方测验，短节间和长节间分离比例符合1∶3，初步预测短节间性状为单隐性基因控制。另外，遗传分析还表明：莲藕节间较长的母本zw2及f1在该位点均为杂合，莲藕节间较长的父本e9在该位点为显性纯合。
38.3、基因定位：选择f2群体中节间形状系数最大(短节间)的植株、节间形状系数最小(长节间)的植株各30株，分别构建dna混池，进行bsa-seq分析。结果显示：在chr1上有唯一定位区间(图2a)，进一步证明了莲藕节间形状为单基因控制。
39.通过双亲基因组重测序数据，针对bsa-seq定位位置附近80mb区间内高质量snp位点开发了parms标记，对160个f2群体单株进行基因分型，构建了遗传连锁图，各个标记的遗传位置和物理位置顺序完全一致。结合f2群体单株节间形状表型数据，把莲藕节间形状基因初步定位在分子标记s1-105至s1-107间，遗传距离为5.9cm，该区间物理位置位于上述bsa定位区间范围内。通过加密定位区间分子标记，对420株f2群体进行基因型分析，结合所有植株两年的表型数据，把基因定位于分子标记s1-209和s1-231区间，对应参考基因组550kb(图2b)。根据两个亲本的全基因组重测序数据，查找该定位区间内的snp变异位点。在143127799bp位置查找到一个snp位点变异a/g。
40.3、设计parms引物：根据143127799bp位置snp位点上下游150bp的序列，用parms引物设计网站(http://www.snpway.com)设计等位基因特异引物和反向共用引物。
41.在143127799bp位置snp位点上下游150bp的序列如下(参见seq no.4-5)：
42.cataaattaaactaccttattatttccaacccaatgagatgtgttagaatgagcctca caaaaatcaatcaaataaatatgtagagaagctcactaagattgattttccattttccttt tcttcttccctctctgctcccttctatctat[a/g]ctcttgaaagttagcatgtccagttgc ctttgcatgttcaatagcttcctacatatttcaatatggaagtataaacatttgatgacaa gatcagagaagaaattcgggggggggggggggggggggggggggagtgcgtgcttgt ttgtg。
[0043]
引物序列如下，
[0044]
s1-234-f1(seq id no:1)：
[0045]
gaaggtgaccaagttcatgctccctctctgctcccttctatctata；
[0046]
s1-234-f2(seq id no:2)：
[0047]
gaaggtcggagtcaacggattccctctctgctcccttctatctatg；
[0048]
s1-234-r(seq id no:3)：
[0049]
aggaagctattgaacatgcaaagg。
[0050]
实施例2：实施例1的莲藕节间形状基因snp分子标记及parms引物的验证
[0051]
通过f2群体(将f
1-003再次自交获得f2群体600个单株)对实施例1查找到的snp分子标记及parms引物进行验证。
[0052]
具体包括如下步骤：
[0053]
1、以f2群体基因组(600个单株)dna为模板(利用ctab法从莲的叶片中提取基因组dna)，利用分子标记的扩增引物parms引物，进行touchdown pcr扩增，获得扩增产物。
[0054]
pcr扩增体系(10μl)：5μl 2
×
parms master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μl 10mm s1-234-f1引物，0.15μl 10mm s1-234-f2引物，0.4μl 10mm反向共用引物s1-234-r，0.5μl模板dna，3.8μl ddh2o。
[0055]
pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃(-0.8℃每循环)退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环。
[0056]
2、对扩增产物进行检测与分析
[0057]
检测方法：pcr产物用quantstudio 5荧光定量pcr仪genotyping(基因分型)模式采集fam和hex荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图(fam和hex荧光信号在图中分别显示蓝色和红色图像，杂合信号显示绿色图像)，输出基因型检测结果用于后续分析。
[0058]
利用实施例1的snp分子标记及parms引物，对f2分离群体(600个单株)进行检测，其中g:g的荧光信号有140个单株，a:g的荧光信号有330个单株，a:a的荧光信号有130个单株。结合600个单株表型分析发现，检测结果与表型一致的准确率为100％。莲藕节间形状基因分型结果如图3所示，图中右下角(红色)的分型结果为g:g，对应短节间莲藕样品，图中中间部分(绿色)分型结果为a:g，对应长节间莲藕样品，图中左上角(蓝色)的分型结果为a:a，对应长节间莲藕样品。可见，利用该snp分子标记可用于区分莲藕节间形状相关性状。
[0059]
以上结果充分说明，实施例1的snp分子标记，g与短节间性状紧密连锁，a或者杂合与长节间性状紧密连锁。在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到的g:g荧光信号的材料，就能够选育出短节间莲藕纯合材料；保留检测到a:a荧光信号的材料，就能够选育出长节间莲藕纯合材料；保留检测到a:g荧光信号的材料，就能够选育出长节间莲藕杂合材料。
通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
[0060]
本发明的snp分子标记准确性好，能够用来预测、鉴定和筛选莲藕节间形状相关性状，在苗期可以有效地进行筛选，提高了工作效率，减少后期种植的人力物力财力。
[0061]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0062]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.一种与莲藕节间形状相关的snp分子标记，其特征是，所述snp分子标记位于第1号染色体第143127799碱基，该处碱基为a或g。2.如权利要求1所述的与莲藕节间形状相关的snp分子标记，其特征是，所述snp分子标记的gg基因型对应的莲藕属于极短至短节间范围，所述snp分子标记的aa或ag基因型对应的莲藕属于中长至长节间范围。3.一种检测莲藕节间形状相关性状的parms引物，所述引物可以扩增权利要求1所述的snp分子标记，所述parms引物具体为：s1-234-f1：gaaggtgaccaagttcatgctccctctctgctcccttctatctata；s1-234-f2：gaaggtcggagtcaacggattccctctctgctcccttctatctatg；s1-234-r：aggaagctattgaacatgcaaagg。4.权利要求1所述的snp分子标记和权利要求3所述的parms引物在莲藕分子标记辅助育种中的应用。5.权利要求1所述的snp分子标记和权利要求3所述的parms引物在莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定方面的应用。6.权利要求1所述的snp分子标记和权利要求3所述的parms引物进行莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型鉴定的方法，其特征是，(1)以待检测莲藕的dna为模板，利用如seq id no:1-3所示的parms扩增引物进行touchdown pcr扩增，获得扩增产物；(2)pcr产物用quantstudio 5荧光定量pcr仪genotyping模式采集fam和hex荧光信号值，软件自动基因分型后得到清晰直观的基因分型图；(3)在基因分型图中，右下角的分型结果为g:g，对应短节间莲藕样品，中间部分分型结果为a:g，对应长节间莲藕样品；左上角的分型结果为a:a，对应长节间莲藕样品。7.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述pcr扩增体系为：5μl 2
×
parms master mix，0.15μl 10mm s1-234-f1引物，0.15μl 10mm s1-234-f2引物，0.4μl 10mm反向共用引物s1-234-r，0.5μl模板dna，3.8μl ddh2o；所述2
×
parms master mix包含2条通用荧光引物。8.如权利要求7所述的方法，其特征是，pcr反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s，65℃退火及延伸1min，扩增10个循环；94℃变性20s，57℃退火及延伸1min，扩增28-30个循环；其中65℃退火及延伸：-0.8℃每循环。

技术总结
本发明公开了与莲藕节间形状相关的SNP分子标记及其应用，所述SNP分子标记位于第1号染色体第143127799碱基，该处碱基为A或G，扩增上述SNP分子标记的PARMS引物序列如SEQ ID No:1-3所示。根据SNP分子标记和PARMS引物，可以直接用于莲藕节间形状相关性状和相对应的基因型的鉴定，从而在苗期就可以实现从基因型上快速、准确的判断莲藕节间形状相关性状，提高了工作效率，为莲藕分子育种提供有效的技术支持。持。持。


技术研发人员：律文堂 李效尊 吴修 尹静静 徐国鑫
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/8/22